高效液相色譜儀、酶標儀和快檢儀檢測 小麥中嘔吐毒素的對比分析

陳 舟

（襄陽市公共檢驗檢測中心，湖北襄陽 441000）

嘔吐毒素，又名為脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（DON），主要由禾谷鐮刀菌和黃色鐮刀菌產(chǎn)生，是一種全球性的污染谷物的霉菌毒素之一，通常在小麥、大麥、燕麥、玉米等谷物及其制品中最為常見。DON超標攝入會導致人畜厭食、嘔吐、腹瀉、發(fā)燒、站立不穩(wěn)和反應遲鈍等急性中毒癥狀，嚴重時會導致組織壞死和內(nèi)臟出血，甚至死亡[1]。正因為DON對人類的生命健康有很大的威脅，我國對小麥中的DON含量制定了嚴格的限量標準。

當前，我國檢測機構(gòu)針對小麥中的DON檢測設備有很多種，但涉及檢測原理主要有串聯(lián)質(zhì)譜法、高效液相色譜法、薄層色譜測定法、酶聯(lián)免疫吸附篩查法、膠體金紙層析免疫法等。在DON檢測中根據(jù)不同的需求，選擇不同的設備和方法來檢測，對于檢測效率至關(guān)重要，因此，本文通過實驗對高效液相色譜儀、酶標儀、真菌毒素快速檢測儀3種設備檢測小麥中DON的優(yōu)劣進行對比分析。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

LC-20A高效液相色譜儀、SPD-20A紫外檢測器，島津；Model-680酶標儀，美國伯樂；ROSA-M快檢儀，美國CHARM；TLE204E/02電子天平，梅特勒-托利多；PHC-11D氮吹儀，月旭科技（上海）；HY-4振蕩器，金壇市大地自動化儀器；800D離心機，常州普天儀器；DON免疫親和柱，安譜（CNW）；Deoxynivalenol標準品，安譜（ANPEL）；DON檢測試劑盒，芬德生物（SZ FINDE）；ROSA DON快檢試劑條，美國CHARM。

DON質(zhì)控樣-1、DON質(zhì)控樣-2，國家糧食和物資儲備局科學研究院；甲醇（色譜純）；聚乙二醇（生化試劑）；氯化鈉（分析純）；磷酸氫二鈉（分析純）；磷酸二氫鉀（分析純）；氯化鉀（分析純）；鹽酸（優(yōu)級純）；去離子水。

1.2 樣品前處理

1.2.1 高效液相色譜儀

稱取25 g樣品于100 mL具塞三角瓶，加5 g聚乙二醇，加水100 mL，混勻，振蕩20 min。以玻璃纖維濾紙過濾至澄清，移取濾液2.0 mL，以1滴/s流速過免疫親和柱，再分別用5 mL PBS緩沖鹽溶液和水先后淋洗，棄去流出液，抽干小柱。加2 mL甲醇洗脫親和柱，下滴速度1滴/s，收集洗脫液，50 ℃下氮氣緩緩吹至近干，最后加入1.0 mL初始流動相，渦旋30 s溶解，0.45 μm濾膜過濾，取濾液入進樣小瓶待上機檢測。

1.2.2 酶標儀

稱取5.0 g粉碎樣品于50 mL離心管，加入20 mL去離子水，振蕩5 min，室溫4 000 r/min離心10 min；靜置分層，取0.1 mL上清液，加入0.9 mL復溶液，混勻，待測。

1.2.3 DON快速檢測儀

準確稱量5.0 g粉碎樣品于50 mL的離心管，加入25 mL 的去離子水，渦旋振蕩1 min，靜置1 min，取1 000 μL上清液于1號離心管中，放入離心機5 000 r/ min，離心1 min后，從中取100 μL樣品提取液和1 000 μL嘔吐毒素稀釋緩沖液（DONQ）放入2號離心管，渦旋振蕩10 s，待測。

1.3 上機檢測

1.3.1 高效液相色譜儀

高效液相色譜儀設置紫外檢測器，色譜柱：XB-C18（4.6 mm× 150 mm，5 μm），其余色譜條件參考GB 5009.111—2016[2]。

1.3.2 酶標儀

加標準品和樣品50 μL/孔到對應微孔中，然后加抗體工作液50 μL/孔，輕輕震蕩5 s混勻，37 ℃避光反應30 min。 洗板：甩干孔中液體，用工作洗滌液350 μL/孔充分洗滌5次，每次間隔30 s，最后用吸水紙拍干。加酶標記物 100 μL/孔，37 ℃避光反應30 min。再次洗板（同上）。顯色：加底物A 50 μL/孔，再加底物B 50 μL/孔，輕輕振蕩5 min混勻，37 ℃避光顯色15 min。終止：加入終止液50 μL/孔， 輕輕振蕩混勻，終止反應。酶標儀于450 nm（建議雙波長450/630 nm）處上機測定每孔OD值。

1.3.3 DON快速檢測儀

讀數(shù)儀調(diào)至DON-00檔。取嘔吐毒素快檢試劑條（綠色），將其反面放入孵育器中，膠紙撕開至黑線處，取300 μL待測稀釋液，緩慢加入試劑條凹槽中后蓋上膠紙，45 ℃下孵育5 min后，插入讀數(shù)儀測定讀數(shù)。

1.4 儀器檢測原理對比

（1）高效液相色譜儀（紫外檢測器）。利用物質(zhì)在色譜柱流動相與固定相之間有不同的分配量，進行DON分離，不同濃度的DON在紫外檢測器引起不同響應值進而輸出不同峰形，最后用外標法定量。

（2）酶標儀篩查原理。基于抗原抗體間接競爭反應技術(shù)，DON和酶標板上的預包被偶聯(lián)抗原競爭抗嘔吐毒素抗體，標記后用TMB底物顯色，樣本吸光度值與其所含DON量成負相關(guān)，與標準曲線比較后得出具體值。

（3）DON快檢測試儀檢測原理。基于膠體金免疫層析技術(shù)，以膠體金作為示蹤標志物，根據(jù)膠體金本身的顯色特點來診斷特異性的待測物。

2 結(jié)果與分析

2.1 回收率與精密度、質(zhì)控樣精準度試驗

在空白小麥樣品中分別加入3組不同濃度的DON標準溶液，按照正常試驗步驟進行前處理和檢測，每個加標樣品重復測定6次，測定其回收率和精密度，結(jié)果見表1。由表1可知，3種設備檢測方法的回收率和精密度均達標[3]。在低濃度檢測時高效液相色譜儀回收率略顯偏低，可能由于其方法前處理相對復雜，造成一定的DON損失。精密度方面，高效液相色譜儀精密度最高，穩(wěn)定性最好。

表1 小麥樣品中DON加標回收率與相對標準偏差試驗結(jié)果

將兩個不同濃度DON質(zhì)控樣，按照正常試驗步驟進行前處理和檢測，每個濃度做4個平行樣，測定其準確度，結(jié)果見表2。從表2中可知高效液相色譜儀準確度最高，其次是酶標儀，快檢儀準確度略顯不足，尤其是高濃度檢測時更明顯。由于快檢儀檢測原理和膠體金紙試劑條制備工藝等原因，快檢儀不適合做定量檢測。另外經(jīng)過多次試驗得出，酶標儀在高通量樣品檢測時，由于抗體的交叉反應、稀釋倍數(shù)及操作污染等因素影響，有出假陽性風險，故陽性試樣需進一步驗證[4]。

表2 三種設備測定小麥質(zhì)控樣品中DON含量試驗結(jié)

2.2 3種設備的操作使用對比

對3種設備在單位樣品檢驗時間、費用、操作等方面進行綜合比較，結(jié)果見表3。從表3中可知，3種檢測設備各有優(yōu)劣，檢測機構(gòu)、企業(yè)或者檢驗人員可根據(jù)自身不同需求和環(huán)境、樣品量等因素綜合考量來選擇最合適的設備進行檢驗。尤其是快檢儀操作簡便、靈敏度高，適合于樣品的快速篩查，可滿足我國糧食及飼料企業(yè)、政府職能監(jiān)管部門等開展日常現(xiàn)場檢驗和監(jiān)管抽查工作[5]。

表3 3種設備檢測綜合比較

3 結(jié)論

本文主要對高效液相色譜儀、酶標儀、真菌毒素快速檢測儀檢測小麥中嘔吐毒素的操作過程和檢測結(jié)果進行對比分析。

從操作過程看，高效液相色譜儀前處理最為復雜和關(guān)鍵，直接影響結(jié)果準確度，另外消耗試劑較多，易造成污染，主要操作為電腦軟件，能自動連續(xù)處理樣品，可用于科研和高質(zhì)量檢驗，對人員能力有一定要求；酶標儀操作過程相對簡單，所需耗材成本也較低，但因其配置試劑較多，操作暴露風險較大，有一定安全隱患，但能同時上機檢測96個樣品，單批次平均成本低，也可用于現(xiàn)場實驗，人員操作易上手；快檢儀操作最為簡單，所用耗材也較少，檢測過程比較安全，檢測速度較快，人員水平要求較低。

從檢測結(jié)果來看，3種設備回收率和精密度均符合要求，其中高效液相色譜儀精密度和準確度最高；酶標儀檢測可能會出現(xiàn)假陽性，因此在其檢測出陽性樣品時，可用高效液相色譜儀進行復檢確認；快速檢測儀檢測速度較快，但其定量檢測準確度不高，比較適用于快速定性檢測。

在實際應用中，3種設備可以相互配合使用，靈活運用各種設備優(yōu)勢來高效率完成工作。糧食企業(yè)單位在新糧收購、轉(zhuǎn)運時可運用快速檢測儀進行糧食DON指標快速篩查，檢測機構(gòu)在集中進行糧食品質(zhì)分析時，可運用酶標儀進行高通量檢測[6]，對以上兩個設備篩檢出的陽性批次可用高效液相色譜儀進行精準復核，提升檢測效率。日常檢驗工作中，快檢儀和酶標儀可為高效液相色譜儀提供輔助性檢測，相互補充，取長補短，為精準高效檢驗嘔吐毒素共同提供數(shù)據(jù)參考。