苦蕎類黃酮糖基轉(zhuǎn)移酶FtUFGT1的重組表達與酶學(xué)性質(zhì)分析

李睿林，韓小韋，陳 鵬

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，陜西楊陵 712100)

類黃酮是植物中最重要的次生代謝產(chǎn)物之一，其在植物應(yīng)對生物脅迫、非生物脅迫中發(fā)揮重要的生物學(xué)功能[1-3]。同時作為食品的重要成分之一，黃酮類物質(zhì)具有清除自由基、預(yù)防心腦血管疾病、抗衰老等營養(yǎng)保健功效，隨著人們對健康的重視，類黃酮的種類及含量已逐漸成為衡量農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)的重要指標之一。類黃酮類物質(zhì)在植物中主要以糖基化的形式存在。糖基化對于提高類黃酮物質(zhì)的穩(wěn)定性、水溶性及促進其積累和運輸以及減少其自身的化學(xué)毒性等，對類黃酮生理功能的發(fā)揮起決定性的作用[4-6]。

類黃酮的糖基化由屬于糖基轉(zhuǎn)移酶超家族中第1家族的UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶催化，其以尿苷二磷酸(UDP)-糖作為活性糖基供體，催化UDP-糖(UDP-sugar)以糖苷鍵形式連接到類黃酮苷元或類黃酮糖苷分子上[5-7]。目前已在金魚草(AntirrhinummajusL.)、馬鈴薯(SolanumtuberosumL.)、擬南芥(Arabidopsisthaliana)等植物中克隆了糖基轉(zhuǎn)移酶的基因。在擬南芥中 UGT 家族包括 120 個家族成員，這些家族成員參與如類黃酮、萜類、固醇、生物堿、酚類、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等的糖基化過程[8]。不同植物類黃酮的合成具有相對的保守性，同時也具有明顯的種屬特異性，種屬特異性是不同植物類黃酮結(jié)構(gòu)多樣性的主要原因[9]?？嗍w含有豐富的黃酮類物質(zhì)，鑒定參與其黃酮類物質(zhì)糖基化修飾的糖基轉(zhuǎn)移酶基因在研究類黃酮代謝調(diào)控研究中有重要的基礎(chǔ)性地位。另外，分析黃酮類物質(zhì)糖基化修飾相關(guān)酶的催化特性，將為在體外條件下利用特異的糖基轉(zhuǎn)移酶催化高附加值的黃酮類次生代謝物的合成奠定基礎(chǔ)[10]。

本研究在分析苦蕎轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫的基礎(chǔ)上篩選苦蕎類黃酮糖基轉(zhuǎn)移酶基因FtUFGT1，構(gòu)建該基因的原核表達載體并實現(xiàn)其可溶性表達，采用高效液相色譜鑒定重組FtUFGT1的催化活性和部分酶學(xué)性質(zhì)，以期為深入分析苦蕎FtUFGT1相關(guān)的次生代謝調(diào)控、生物學(xué)功能及在體外條件下合成高純度的糖基化次生代謝物奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

九江苦蕎，原核表達載體pGEX-6P-1、大腸桿菌(Escherichiacoli)TOP10、Rosetta(DE3)菌株由陳鵬教授實驗室保存。槲皮素、異槲皮素標樣為上海源葉生物科技有限公司產(chǎn)品。

1.2 實驗方法

1.2.1FtUFGT1基因的克隆苦蕎葉片總RNA的提取參照Concert Plant RNA Reagent說明書進行。電泳檢測RNA的質(zhì)量并利用NanoDrop核酸檢測儀測定濃度。以總RNA為模板，參照TaKaRa公司的PrimeScriptTMRT Reagent Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒進行cDNA第一鏈的合成。根據(jù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫分析獲得的FtUFGT1完整ORF區(qū)序列，設(shè)計帶有pGEX-6p-1載體同源臂序列的引物UFGT1-F(TGTTCCAAGGTCCACTGGGATCCACGGTAT-CTTCCGCCACC)和UFGT1-R(GCTCGAGTC-GACCCGGGAATTCTTAGGTTGTGATGATGC-TAATGAACT)。以苦蕎cDNA作為模板，通過PCR反應(yīng)擴增FtUFGT1基因，反應(yīng)總體系為25 μL，含cDNA模板1 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，2×HiProof PCR Mix12.5 μL，H2O 9.5 μL。PCR反應(yīng)程序如下：95 ℃變性3 min；95 ℃變性20 s，58℃退火20 s，72℃延伸45 s，6個循環(huán)；95 ℃變性20 s，68 ℃退火20 s，72 ℃延伸45 s，32個循環(huán)；72 ℃終延伸7 min。1%瓊脂糖凝膠檢測FtUFGT1基因擴增產(chǎn)物并進行切膠回收。

使用NEBuliderHiFi DNA Assembly Cloning Kit以無縫克隆方式將帶有pGEX-6p-1同源臂序列的FtUFGT1片段連接到經(jīng)BamH I和SalI線性化pGEX-6p-1表達載體上。連接產(chǎn)物采用熱激法轉(zhuǎn)化TOP10感受態(tài)細胞并涂布于含100 μg/mL 氨芐青霉素(Ampicillin,Amp)LB平板上，37 ℃培養(yǎng)過夜。經(jīng)菌落PCR鑒定為陽性的克隆送西安擎科生物技術(shù)有限公司測序。測序正確的克隆命名為pGEX-6p-1-UFGT。

1.2.2FtUFGT1的生物信息學(xué)分析使用NCBI的在線Blast軟件(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)對FtUFGT1的氨基酸序列進行比對分析。通過ExPASy(https://web.expasy.org/protparam/)對各基因編碼蛋白的分子量大小及等電點進行預(yù)測。使用Pfam(http://pfam.xfam.org/search)在線軟件預(yù)測各蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)域。采用ClustalX軟件對FtUFGT1進行多序列比對后，使用ESPript(http://espript.ibcp.fr/ESPript/cgi-bin/ESPript.cgi)在線作圖。選擇MEGA6軟件的N-J法構(gòu)建出系統(tǒng)發(fā)育樹，并生成圖像。序列比對中所用的其他物種的UGT序列皆來自https://www.ncbi.nlm.nih.gov/。

1.2.3 FtUFGT1蛋白的重組表達與純化用pGEX-6p-1-UFGT載體轉(zhuǎn)化Rosetta(DE3)感受態(tài)，復(fù)蘇后菌體涂布于含25 μg/mL氯霉素(chloramphenicol，Cam)和100 μg/mL Amp的LB平板上，37 ℃培養(yǎng)過夜。挑取單克隆菌落，加入3 mL LB(Cam，Amp)中，37 ℃培養(yǎng)至OD600約為1.0時，將菌液以1∶100的比例轉(zhuǎn)接至150 mL含Cam和Amp的LB培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)。OD600達到0.6時，加入IPTG至終濃度0.6 mmol/L，20 ℃誘導(dǎo)14 h。4 ℃、10 000 r/min 離心收集菌體，加入50 mL預(yù)冷GST破菌緩沖液(20 mmol/L Tris-HCl，300 mmol/L NaCl，pH7.6)，超聲裂解。4 ℃、12 000 r/min 離心15 min，取上清。采用GST-resin純化重組表達的蛋白，純化方法參考GST-Resin的說明書進行，含F(xiàn)tUFGT1的洗脫組分采用30 kD超濾管進行超濾濃縮和緩沖液交換，加入甘油至終濃度為50%(V/V)，置-20 ℃保存。

1.2.4 FtUFGT1活性的HPLC檢測參照Li等的方法檢測重組FtUFGT1的活性[11]。反應(yīng)體系的總體積為40 μL,含有400 μmol/L UDP-葡萄糖，80 μmol/L槲皮素，50 mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH 8.0)，及0.5 μg重組FtUFGT1。在30 ℃水浴鍋中反應(yīng)1 h，加入4倍體積甲醇終止反應(yīng)。以沸水加熱滅活的酶為對照。將反應(yīng)組和對照樣品12 000 r/min離心20 min，用0.22 μm有機相濾膜過濾后取10 μL利用HPLC進行分析。采用色譜柱為C18柱，流動相為10%甲酸水溶液和10%甲酸乙腈溶液。測定時柱溫箱設(shè)為30 ℃，紫外檢測器波長設(shè)定在360 nm；流動相為10%甲酸水溶液(A)和10%甲酸乙腈溶液(B)。樣品在0～25 min內(nèi)B由5%梯度增至15%；25～42 min，B由15%增至22%；42～60 min，B由22%增至36%；60～65 min，B由36%降至5%；最后以95%A和5%B等度洗脫10 min。流速1 mL/min。設(shè)置濃度范圍為1～1 000 μg/mL異槲皮素溶液，利用HPLC分析并繪制標準曲線。將30 ℃反應(yīng)10 min合成1 μmol槲皮素所需的酶的量定義為1個酶活力單位(U)。

1.2.5 FtUFGT1的酶學(xué)性質(zhì)分析參考1.2.4的方法，分別在20～60 ℃下反應(yīng)10 min，通過HPLC測定反應(yīng)體系異槲皮素的濃度，分析不同溫度對FtUFGT1活性的影響；分別在pH3.0～10.0條件下30 ℃反應(yīng)10 min，通過HPLC測定異槲皮素的濃度并分析不同pH值對FtUFGT1活性的影響；在反應(yīng)體系中分別加入0～20%(V/V)甲醇、或0.5%～2% Triton X-100，在30 ℃反應(yīng)10 min，通過HPLC測定異槲皮素的濃度并分析不同濃度甲醇及Triton X-100對FtUFGT1活性的影響。

1. FtUFGT1； M. DL2000圖1 FtUFGT1基因的PCR擴增Fig.1 PCR amplification of FtUFGT1 gene

2 結(jié)果與分析

2.1 FtUFGT1基因的克隆

以九江苦蕎cDNA為模板，以FtUFGT1-F/FtUFGT1-R為引物進行PCR擴增，瓊脂糖電泳顯示(圖1)，條帶明亮且單一，擴增產(chǎn)物約為1 400 bp，與預(yù)期大小基本一致。

2.2 FtUFGT1生物信息學(xué)分析

測序結(jié)果顯示FtUFGT1的ORF區(qū)全長為1 413 bp，編碼470個氨基酸。經(jīng)ExPASy等分析，F(xiàn)tUFGT1蛋白的相對分子量為50.25 kD，等電點為5.60，不穩(wěn)定指數(shù)為47.96。推測在65～453肽段含有UDPGT(UDP-Glycosyltrans ferase)結(jié)構(gòu)域。氨基酸序列比對發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)tUFGT1與甜蕎(Fagopyrumesculentum)中的類黃酮C-糖基轉(zhuǎn)移酶相似性最高，達到52.49%，與樹棉(GossypiumarboreumL.)、紫牡丹(PaeoniadelavayiFranch.)和葡萄(VitisviniferaL.)等物種的UGT相似性為40%左右。在其C末端，含有由44個氨基酸構(gòu)成保守序列——PSPG盒(圖2)。從系統(tǒng)發(fā)育樹可以看出，F(xiàn)tUFGT1與甜蕎中的UGT處于進化樹的同一分支，兩者進化關(guān)系最近(圖3)。

下劃線為C-末端PSPG盒圖2 FtUFGT1與其他植物UGT的氨基酸序列比對The underline shows the C-terminal PSPG box of FtUFGT1Fig.2 Amino acid sequences alignment of FTUFGT1 and UGTs from other plants

圖3 FtUFGT1與不同植物中UGT氨基酸序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of FtUFGT1 and UGTs from other plants

2.3 FtUFGT1的重組表達與純化

pGEX-6p-1-FtUFGT1載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosetta(DE3)感受態(tài)細胞，與未誘導(dǎo)的菌體相比，IPTG誘導(dǎo)的菌體在SDS-PAGE上顯示一條約為80 kD的蛋白，其大小與目標蛋白的分子量基本一致。將誘導(dǎo)后的菌體超聲破碎，分別取破菌的上清與沉淀進行SDS-PAGE分析，結(jié)果顯示上清和沉淀中均存在一條約80 kD的條帶，但上清中的可溶性形式表達量明顯高于沉淀形式。表明FtUFGT1蛋白在Rosetta(DE3)中主要以可溶形式表達。裂解誘導(dǎo)菌體獲得的上清，通過GST-resin親和層析柱進行純化。分析顯示，洗脫液中存在 0.1%TritonX-100溶液條件下，純化的FtUFGT1蛋白在SDS-PAGE凝膠上表現(xiàn)單一條帶(圖4)。

2.4 重組FtUFGT1活性的檢測

HPLC分析顯示，以槲皮素為底物，重組FtUFGT1可以催化生成與異槲皮素相同保留時間的產(chǎn)物(圖5)，說明重組FtUFGT1具有糖基轉(zhuǎn)移酶活性，它在體外能以槲皮素為糖基受體，將活化糖供體UDP-葡萄糖的葡萄糖基綴合到槲皮素的3-OH上生成異槲皮素。將30 ℃反應(yīng)10 min合成1 μmol槲皮素所需酶的量定義為1個酶活力單位(U)，在該定義條件下，F(xiàn)tUFGT1的比活力為9.174 U/mg。

2.5 重組FtUFGT1活力的影響因素

分別在20～60 ℃測定重組FtUFGT1對槲皮素的糖基化活性。在20～30 ℃內(nèi)，F(xiàn)tUFGT1活性隨著溫度升高而增加，在30 ℃時，F(xiàn)tUFGT1具有最高活性。溫度高于30 ℃，F(xiàn)tUFGT1活性隨著溫度升高而降低。FtUFGT1的最適溫度為30 ℃(圖6，A)。分別在pH 3.0～10.0范圍內(nèi)測定FtUFGT1的活性。在pH3.0～7.0范圍內(nèi)，F(xiàn)tUFGT1活性隨著pH值升高而增加，在pH7.0時活性達到最高。而在pH大于8.0時，F(xiàn)tUFGT1活性隨著pH值升高而驟降。FtUFGT1在pH6.0～8.0范圍具有較高活性，其最適pH為7.0(圖6，B)。在反應(yīng)體系中加入5%～20%的甲醇，當反應(yīng)體系甲醇濃度為5%時，F(xiàn)tUFGT1活性即出現(xiàn)大幅降低，活性僅為無甲醇條件下的10%左右。由此表明FtUFGT1對反應(yīng)體系中的甲醇耐受性較低(圖6，C)。同樣的方法分析發(fā)現(xiàn)，0.5%的TritonX-100可以抑制FtUFGT1的活性，且在0.5%～2%TritonX-100范圍內(nèi)，酶活性變化不明顯(圖6，D)。

1.未誘導(dǎo)；2.誘導(dǎo)；3.超聲破菌上清；4.超聲破菌沉淀；5.純化的FtUFGT1；M. 蛋白Marker圖4 FtUFGT1的誘導(dǎo)表達、可溶性以及純化的SDS-PAGE分析1. Uninduced cell; 2. Induced cell; 3. Supernatant; 4. Precipitate; 5. Purified FtUFGT1; M. Protein markerFig.4 SDS-PAGE analysis the overexpression and purification of FtUFGT1

圖6 反應(yīng)溫度(A)、pH(B)、甲醇(C)和TritonX-100(D)對FtUFGT1活性的影響Fig.6 Effect of reaction temperature(A), pH(B), methanol(C) and TritonX-100(D) on the activity of FtUFGT1

3 討 論

類黃酮糖基轉(zhuǎn)移酶在植物體內(nèi)次生代謝物糖基化修飾中發(fā)揮核心的功能。糖基化調(diào)控黃酮類物質(zhì)的穩(wěn)定性、溶解度、胞內(nèi)定位、運輸方式，進而影響次生代謝物在植物體內(nèi)的功能[12-13]。已有的研究證實次生代謝相關(guān)糖基轉(zhuǎn)移酶與植物的抗逆性相關(guān)，但研究結(jié)果主要集中在擬南芥上，且研究結(jié)果存在明顯的差異性。擬南芥類黃酮糖基轉(zhuǎn)移酶UGT73B2缺失的植株表現(xiàn)對氧化脅迫的抗性增強，而過表達UGT73B2的擬南芥則表現(xiàn)對氧化脅迫高度敏感，推測缺失ugt73b2突變體黃酮類單體化合物含量升高，增強了植物對脅迫的抗性[14]。過表達低溫、鹽及干旱脅迫強烈誘導(dǎo)的矢車菊素糖基轉(zhuǎn)移酶UGT79B2/B3的擬南芥中花青素含量增加，植株對低溫、干旱和鹽脅迫的耐受性增強，而ugt79b2/b3雙突變體的花青素含量下降，表現(xiàn)對環(huán)境脅迫的敏感度增加，進而在不能合成花青素的擬南芥突變體tt18中過表達UGT79B2/B3不能提高植株的抗逆性，說明UGT79B2和UGT79B3通過調(diào)節(jié)花青素的含量提高擬南芥對非生物脅迫耐受性[15]。鑒于不同植物次生代謝物累積的差異性，鑒定不同植物來源的糖基轉(zhuǎn)移酶并揭示其生物學(xué)功能對于植物次生代謝途徑在抗逆中的生物學(xué)功能有重要的價值?？嗍w是中國西部地區(qū)的特色藥糧兼用高抗逆作物，其富含黃酮類物質(zhì)，鑒定苦蕎中的特異性黃酮糖基轉(zhuǎn)移酶基因并揭示其抗性的機制及調(diào)控苦蕎次生代謝物的累積有重要的意義。本研究基于苦蕎的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，在生物信息學(xué)分析基礎(chǔ)上，根據(jù)UDPGT結(jié)構(gòu)域及PSPG盒篩選確定苦蕎類黃酮糖基轉(zhuǎn)移酶FtUFGT1基因，實現(xiàn)了其在大腸桿菌Rosetta(DE3)中的可溶性表達，純化的FtUFGT1可催化槲皮素糖基化合成異槲皮素，進一步證明所克隆基因的正確性，研究結(jié)果為深入研究該基因的植物學(xué)功能及苦蕎次生代謝生物異槲皮素合成的調(diào)控機制奠定了基礎(chǔ)。

苦蕎含有豐富的次生代謝物，在本研究過程中，利用常規(guī)的RNA提取試劑如Trizol無法提取獲得RNA[16-18]，提取過程中氯仿進行上下相分離獲得的RNA提取物異常黏稠，無法進行后續(xù)的沉淀等步驟，其可能原因是苦蕎葉片中存在高含量的多酚和多糖類化合物在提取過程中與RNA形成較為穩(wěn)定的復(fù)合物[19]。為此在本研究系統(tǒng)中，利用含有高濃度β-巰基乙醇的Invitogen公司的 ConcertTMPlant RNA Reagent 并結(jié)合酸性酚抽提，有效解決了苦蕎葉片總RNA提取的問題，研究方法對其他高含多糖多酚植物材料的RNA提取有借鑒價值。在原核表達過程中，F(xiàn)tUFGT1在BL21(DE3)中無明顯的表達(結(jié)果未顯示)，但在補充稀有密碼子的菌株Rosetta(DE3)中可以實現(xiàn)高效的表達，說明稀有密碼子是限制其在BL21(DE3)中表達的主要因素。在純化過程中，洗滌液中添加0.1% TritonX-100可以有效地去除GST-Resin非特異性結(jié)合的雜蛋白，在破菌上清中加入0.1 mmol/L的絲氨酸蛋白抑制劑(phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF)可有效消除內(nèi)源蛋白酶對FtUFGT1降解引起的高度不穩(wěn)定問題。

異槲皮素是天然黃酮醇(3,5,7,3′,4′-五羥基黃酮)主要糖苷形式之一，其在生物安全性和生物活性等方面較槲皮素和蘆丁更具有優(yōu)勢[20]。本研究實現(xiàn)了苦蕎中可催化槲皮素形成異槲皮素的糖基轉(zhuǎn)移酶FtUFGT1的重組表達與純化，為通過體外合成制備異槲皮素奠定了基礎(chǔ)工作。