山黧豆β-腈基丙氨酸合成酶基因LsCAS的原核表達(dá)及蛋白聚合狀態(tài)分析

賈海燕，李辰浩，宋瑤瑤，劉鳳娟，焦成瑾，徐全樂(lè)

(1 隴東學(xué)院 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，甘肅慶陽(yáng) 745000；2 西北農(nóng)林科技大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，陜西楊陵 712100； 3 天水師范學(xué)院 生物工程與技術(shù)學(xué)院，甘肅天水 741000)

β-N-草酰-L-α,β-二氨基丙酸(β-N-oxalyl-L-α,β-diaminopropionic acid，β-ODAP)在山黧豆(Lathyrussativus)中首次獲得分離和鑒定[1]，并被發(fā)現(xiàn)廣泛存在于三七(Panaxnotoginseng)、西洋參(Panaxquinquefolium)和人參(Panaxginseng)等物種[2-3]。研究表明，β-ODAP是傳統(tǒng)中藥材三七止血的活性成分，被命名為三七素(dencichine)[2]，并在神經(jīng)保護(hù)、糖尿病及腎病防治等過(guò)程中發(fā)揮重要作用[3-8]。因而，β-ODAP生物合成的調(diào)控是山黧豆、三七等作物品質(zhì)形成機(jī)理研究的重要內(nèi)容。

β-ODAP的生物合成在山黧豆種子萌發(fā)期和成熟期形成2個(gè)顯著高峰[9]。對(duì)萌發(fā)期種子的代謝組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析表明，β-ODAP的生物合成與硫代謝等基礎(chǔ)代謝途徑密切關(guān)聯(lián)[10-12]。其中，β-腈基丙氨酸合成酶(β-cyanoalanine synthase，β-CAS)負(fù)責(zé)催化異噁唑-5-酮與半胱氨酸(Cys)反應(yīng)生成β-異噁唑-5-酮-丙氨酸[β-(isoxazolin-5-on-2-yl)alanine，BIA]。BIA進(jìn)一步通過(guò)兩步反應(yīng)生成β-ODAP[13-14]。

在擬南芥和大豆等物種中的研究表明，β-CAS隸屬于磷酸吡哆醛(pyridoxal phosphate，PLP)依賴(lài)的β基取代的丙氨酸合成酶家族(β-substituted alanine synthase，Bsas)，可形成二聚體，分子量范圍為50～70 kD[15-16]。在山黧豆中，將LsCAS的PLP附著關(guān)鍵位點(diǎn)Lys突變后導(dǎo)致突變體酶活喪失[14,17]，說(shuō)明LsCAS也是PLP依賴(lài)性蛋白酶。該蛋白可通過(guò)與絲氨酸乙?；D(zhuǎn)移酶(serine acetyltransferase，SAT)互作起到β-ODAP生物合成調(diào)控分子開(kāi)關(guān)的作用[14]。

植物硫代謝途徑調(diào)控的一個(gè)典型特征是2個(gè)CS同源二聚體與2個(gè)SAT同源三聚體共同形成半胱氨酸調(diào)控復(fù)合物十聚體(cysteine regulatory complex，CRC)，并通過(guò)聚合/解聚狀態(tài)調(diào)節(jié)CS 與SAT酶活[18-20]。為進(jìn)一步研究LsCAS功能及聚合狀態(tài)，本研究克隆了LsCAS基因的CDS序列，構(gòu)建了pGEX2T-LsCAS原核表達(dá)載體，通過(guò)蛋白純化和Western-blot分析進(jìn)行了LsCAS功能驗(yàn)證，并利用分子排阻初步解析山黧豆LsCAS蛋白的聚合狀態(tài)，深入了解LsCAS的功能。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所用山黧豆(Lathyrussativus)種子為西北農(nóng)林科技大學(xué)生命學(xué)院實(shí)驗(yàn)室保存。種子在含腐殖土、蛭石、珍珠巖(1∶1∶1)的混和基質(zhì)中于23 ℃萌發(fā)6 d，取其根部提取RNA。GST親和柱購(gòu)自碧云天生物技術(shù)公司，GST標(biāo)簽抗體購(gòu)自美國(guó)Affinity公司，大豆CS 抗體為美國(guó)農(nóng)業(yè)部Hari Krishnan教授惠贈(zèng)，牛凝血酶購(gòu)自上海翊圣生物科技有限公司，10 kD超濾管等購(gòu)自Millipore。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1LsCAS基因克隆采用Invitrogen公司的總 RNA 提取試劑盒(Trizol法)提取山黧豆6 d齡幼苗的根部RNA，利用TaKaRa公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimeScriptTMⅡ1st Strand cDNA Synthesis Kit)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。采用50 μL反應(yīng)體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其中5×PrimeSTAR 緩沖液 10 μL，dNTP 混合液(2.5 mmol/L)4 μL，模板2 μL，PrimeSTAR HS DNA 聚合酶(2.5 U/μL)0.5 μL；上下游引物(10 μmol/L)各1.5 μL。PCR程序?yàn)椋?8 ℃ 1 min；98 ℃ 10 s，57 ℃ 5 s，72 ℃ 1 min 15 s，30個(gè)循環(huán)；最后72 ℃ 延伸5 min。引物序列為F(ATCACCTTCCTCAAGCGAACCTC)和R(CTC-GGAACTCGTGGAAGAAAT)。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，送北京擎科生物科技有限公司測(cè)序。

1.2.2 原核表達(dá)載體構(gòu)建利用EcoR I和BamH Ⅰ對(duì)pGEX2T載體進(jìn)行雙酶切，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后采用天根DNA純化試劑盒(Tiangen)進(jìn)行切膠回收，利用T4DNA連接酶(TaKaRa)和帶有EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ酶切位點(diǎn)的LsCAS片段連接。重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到DH5α后，經(jīng)菌落PCR、雙酶切和測(cè)序鑒定。

M. DL2000；1. RT-PCR圖1 LsCAS基因的RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 RT-PCR amplification result of LsCAS

1.2.3 LsCAS蛋白純化將pGEX2T-LsCAS重組質(zhì)粒利用KCM法轉(zhuǎn)化入感受態(tài)BL21(DE3)中。挑取單克隆于5 mL含Amp的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r/min培養(yǎng)12 h后；取2 mL菌液轉(zhuǎn)接于200 mL含有Amp的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD600為0.4～0.6，加入終濃度為0.2 mmol/L IPTG，25 ℃培養(yǎng)10～12 h。收集菌體后用PBS緩沖液重懸，超聲破碎后收集上清液。使用碧云天GST親和柱(BeyoGoldTMGST-tag Purification Resin)進(jìn)行親和層析，用PBS緩沖液平衡GST親和柱并洗去未結(jié)合雜蛋白，用含有10 mmol/L GSH的GST洗脫緩沖液洗脫目的蛋白。通過(guò)SDS-PAGE對(duì)純化蛋白進(jìn)行鑒定。

1.2.4 Western-blot分析上述純化蛋白使用12.5%的SDS-PAGE分離后，轉(zhuǎn)移到NC 膜上，用GST標(biāo)簽抗體和大豆CS 抗體分別進(jìn)行驗(yàn)證。

1.2.5 分子排阻將純化的LsCAS用牛凝血酶切割GST標(biāo)簽，用10 kD超濾管濃縮至蛋白終濃度為3 mg/mL。取1 mL樣品，使用AKTA蛋白純化系統(tǒng)，Superdex 200 Increase 10/300 GL凝膠柱分析純化的LsCAS分子量。檢測(cè)條件為：柱溫室溫，流速0.5 mL/min，流動(dòng)相0.1 mol/L Tris-HCl緩沖液(pH 7.5，含200 mmol/L NaCl)，檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm和412 nm。

2 結(jié)果與分析

2.1 山黧豆LsCAS基因CDS序列克隆

利用RT-PCR從山黧豆萌發(fā)6 d的幼苗根部RNA中進(jìn)行LsCAS基因CDS序列的特異性擴(kuò)增。結(jié)果表明，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在1 000 bp左右，與預(yù)期相符，且條帶單一(圖1)。PCR產(chǎn)物的測(cè)序結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)序列完全一致，表明所獲序列為β-腈基丙氨酸合成酶基因。LsCAS基因的CDS序列為1 035 bp，編碼344個(gè)氨基酸。編碼的蛋白質(zhì)具有典型的CBS-like 蛋白功能結(jié)構(gòu)域(Cystathionine beta-synthase，CBS)和半胱氨酸合成酶(CS)，表明LsCAS基因克隆成功。

2.2 LsCAS表達(dá)載體構(gòu)建

采用酶切連接法構(gòu)建LsCAS基因的原核表達(dá)載體。經(jīng)菌液PCR驗(yàn)證后(圖2，A)，挑取陽(yáng)性克隆進(jìn)行質(zhì)粒提取及EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ雙酶切驗(yàn)證(圖2，B)。瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果表明，重組質(zhì)粒的電泳遷移率略小于pGEX2T空載體；重組質(zhì)粒經(jīng)雙酶切后在5 kb和1 kb左右呈2條條帶，其電泳遷移率分別與pGEX2T空載體和LsCAS基因擴(kuò)增產(chǎn)物大小相當(dāng)。這表明重組載體構(gòu)建成功。經(jīng)測(cè)序證實(shí)后，將其命名為pGEX2T-LsCAS。

2.3 LsCAS蛋白純化

利用IPTG進(jìn)行重組質(zhì)粒誘導(dǎo)表達(dá)后，采用GST親和層析法對(duì)LsCAS融合蛋白進(jìn)行純化。SDS-PAGE檢測(cè)表明，所獲融合蛋白條帶單一，大小在64 kD左右，符合預(yù)期大小。進(jìn)一步利用GST標(biāo)簽抗體和大豆CS抗體進(jìn)行Western-blot分析，在誘導(dǎo)后的菌體蛋白和純化后的重組蛋白中均能檢測(cè)到特征條帶，說(shuō)明所獲融合蛋白為山黧豆LsCAS蛋白(圖3)。

A. 菌液PCR驗(yàn)證：1-8. 菌落PCR； B. BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ雙酶切驗(yàn)證：1. pGEX2T；2. pGEX2T-CAS；3. pGEX2T-CAS酶切產(chǎn)物；4. pGEX2T酶切產(chǎn)物；5. LsCAS基因PCR產(chǎn)物；M. DNA marker圖2 重組質(zhì)粒驗(yàn)證A. Colony PCR: 1-8. Colony PCR of randomly selected colonies； B. Double enzyme digestion by BamH Ⅰ and EcoR Ⅰ: 1. Plasmid pGEX2T; 2. Plasmid pGEX2T-LsCAS; 3. Enzyme digested fragments of pGEX2T-LsCAS; 4. Enzyme digested fragments of pGEX2T; 5. Cloned LsCAS gene via RT-PCR; M. DNA markerFig.2 Identification of recombinant plasmid

A. SDS-PAGE；B. 利用大豆CS抗體檢測(cè)；C. 利用GST標(biāo)簽抗體進(jìn)行檢測(cè)；M.蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；1.IPTG誘導(dǎo)前總蛋白質(zhì)；2.IPTG誘導(dǎo)后總蛋白質(zhì)；3.純化后的LsCAS蛋白圖3 LsCAS蛋白純化的 SDS-PAGE及Western-blot檢測(cè)A. SDA-PAGE; B. CS antibody; C. GST antibody; M. Regular range protein marker; 1. Total protein before IPTG induction; 2. Total protein after IPTG induction; 3. The purified LsCASFig.3 SDA-PAGE and Western-blot analysis of purified LsCAS

2.4 分子排阻分析

使用Superdex 200 Increase 10/300 GL凝膠柱判斷LsCAS在離體條件下的分子量。結(jié)果表明(圖4)，純化的LsCAS在412 nm下具有特征吸收峰。由于412 nm是磷酸吡哆醛PLP的特征吸收波長(zhǎng)[21]，說(shuō)明LsCAS屬于PLP依賴(lài)的蛋白酶家族。在280 nm檢測(cè)波長(zhǎng)下，LsCAS在洗脫體積為14.56 mL處有最大吸收值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子的排阻體積進(jìn)行計(jì)算，對(duì)應(yīng)的分子量為145 kD左右。由于LsCAS蛋白單體分子量為36 kD，說(shuō)明LsCAS在離體條件下可能以四聚體方式存在。

圖4 分子排阻驗(yàn)證LsCAS分子量及聚合方式Fig.4 Molecular weight analysis of LsCAS via size-exclusion chromatography

3 討 論

在山黧豆中，LsCAS是β-ODAP生物合成途徑的關(guān)鍵酶，負(fù)責(zé)催化異噁唑-5-酮與Cys合成關(guān)鍵中間化合物BIA[13-14]。研究表明，β-CAS隸屬于磷酸吡哆醛PLP依賴(lài)的半胱氨酸合成酶CS家族[16,21]。因而，PLP附著的關(guān)鍵位點(diǎn)Lys(K)對(duì)CS功能的行使至關(guān)重要[21]。例如，擬南芥AtOASSK46A突變體表現(xiàn)為Cys合成酶活性喪失[22]。在山黧豆中，將PLP附著關(guān)鍵位點(diǎn)的Lys突變后，進(jìn)行E.coliNK3功能互補(bǔ)分析和酶活檢測(cè)均表明，LsCS及LsCAS突變體酶活喪失[14, 17]。本研究在分子排阻試驗(yàn)中，檢測(cè)到LsCAS蛋白在412 nm波長(zhǎng)下具有PLP的特征吸收峰，進(jìn)一步證實(shí)了上述結(jié)論。

擬南芥、大豆等作物中的研究表明，植物硫代謝途徑調(diào)控的一個(gè)典型特征是2個(gè)CS同源二聚體與2個(gè)SAT同源三聚體共同形成半胱氨酸調(diào)控復(fù)合物CRC，并通過(guò)復(fù)合物的聚合/解聚狀態(tài)調(diào)節(jié)CS與SAT酶活[18-20]。當(dāng)形成CRC復(fù)合物時(shí)，會(huì)降低CS的活性而升高SAT活性[23]。山黧豆LsCAS在發(fā)揮功能時(shí)，可通過(guò)與LsSAT2互作起到β-ODAP生物合成調(diào)控分子開(kāi)關(guān)的作用[14]，這暗示LsCAS與LsSAT2可能通過(guò)CRC復(fù)合物的形成調(diào)控二者酶活。將LsCAS與LsSAT2采用梯度摩爾比例混合后，在降低LsCAS酶活的同時(shí)確實(shí)會(huì)增加LsSAT2活性[14]。本研究利用分子排阻法證實(shí)，LsCAS可能以四聚體方式存在，說(shuō)明LsCAS可能以?xún)蓚€(gè)二聚體方式參與CRC復(fù)合物的形成。

CRC的聚合與解聚狀態(tài)由細(xì)胞內(nèi)的硫含量決定[24]。在硫充足情況下，山黧豆LsCAS 和LsSAT2形成CRC調(diào)控復(fù)合物，增強(qiáng)了SAT活性；充足的硫供應(yīng)保證了Cys的合成，進(jìn)而在游離LsCAS作用下合成BIA及β-ODAP。在低硫情況下，OAS的積累促使CRC解聚，降低了SAT活性；低水平的Cys限制了以其為底物的BIA及β-ODAP合成。但積累的OAS可在CS催化下和異噁唑-5-酮以較低效率合成BIA[14]。

綜上所述，本研究克隆了山黧豆LsCAS基因的CDS序列，通過(guò)原核表達(dá)獲得了山黧豆LsCAS蛋白并利用Western-blot進(jìn)行了驗(yàn)證。在此基礎(chǔ)上，利用分子排阻試驗(yàn)證實(shí)了LsCAS為PLP依賴(lài)性蛋白酶，可能以四聚體方式發(fā)揮作用。在擬南芥中，AtCYS-C1編碼的AtCAS蛋白定位于線粒體，主要參與氰基代謝和根毛發(fā)育[25-26]。那么，山黧豆LsCAS是否和擬南芥AtCAS具有相同的作用方式、其功能是否存在差異，有待進(jìn)一步研究。