山黧豆160年研究歷程及進展

徐全樂，蔣景龍，焦成瑾，張大偉，Neil C. Turner，Shiv Kumar，熊友才*

(1 西北農林科技大學 生命科學學院，陜西楊陵 712100；2 陜西理工大學 生物科學與工程學院，陜西漢中723000；3 天水師范學院 生物工程與技術學院，甘肅天水 741000；4 蘭州大學 生命科學學院/草地農業(yè)生態(tài)系統(tǒng)國家重點實驗室，蘭州 730000；5 Centre for Plant Genetics and Breeding, the University of Western Australia, M080, Perth, WA6009, Australia; 6 International Centre for Agricultural Research in the Dry Areas [ICARDA], Rabat P.O. Box 6299, Morocco)

山黧豆(Lathyrussativus)是世界上最古老的作物之一[1]，廣泛分布在歐亞大陸、北美洲、南美溫帶地區(qū)和非洲東部等地[2-4]。由于富含蛋白、具有優(yōu)良而廣譜的抗逆性，山黧豆是干旱、半干旱地區(qū)和貧困地區(qū)的重要農作物選擇[1]，也是對抗亞太地區(qū)等存在的“隱性饑餓”、豐富農作物系統(tǒng)等的優(yōu)良種質資源[5]。在Kew’s千年種子庫及全球作物多樣性信托基金主導的“氣候變化的農業(yè)適應”項目中，山黧豆是29個優(yōu)先級作物之一，對于物種多樣性保護、針對氣候變化條件下的遺傳育種以及未來的糧食安全等具有重要的意義[1, 6]。然而，長期以山黧豆為主要食物來源造成的神經山黧豆中毒事件，以及傳統(tǒng)觀點對于其內源活性物質β-N-草酰-L-α,β-二氨基丙酸(β-N-oxalyl-L-α,β-diaminopropionic acid，β-ODAP)毒理特征的過度強調等限制了山黧豆的進一步開發(fā)利用。但過去一百多年中，圍繞山黧豆中毒機理、β-ODAP的功能、優(yōu)良品種的選育等核心問題的研究卻始終沒有止步。該文簡要地總結了山黧豆研究160年經歷的不同階段、取得的主要成績以及研究進展，并提出了目前存在的問題和未來研究方向，以期為今后山黧豆的種質資源開發(fā)和利用研究提供借鑒和參考。

1 山黧豆研究歷程概述

在SCI引文數據庫中可檢索到山黧豆研究的文獻記載始見于1861年。該報道記載了印度北部城市阿拉哈巴德發(fā)現(xiàn)的機體麻痹癥狀和食用山黧豆的相關性[7]。實際上，從17世紀一直到20世紀90年代，在印度、希臘、德國、俄國、孟加拉、法國、西班牙、敘利亞、意大利、阿比西尼亞、阿爾及利亞、阿富汗、埃塞俄比亞、伊朗、中國等國家發(fā)生過多次較大規(guī)模的山黧豆中毒事件[8](圖1)。這些分布在不同區(qū)域和不同歷史時期記載，帶來了廣泛的關注，使山黧豆中毒一度成為重大公共衛(wèi)生問題。相關基礎研究也一直以山黧豆中毒機制的研究和“低毒、無毒”品種的選育為主要核心。通過梳理，山黧豆漫長的研究歷史可以粗略地劃分為山黧豆中毒因素的探索、神經山黧豆中毒機理的解析、神經山黧豆中毒及β-ODAP生物學功能的再認識等3個階段。

1.1 山黧豆中毒因素的探索

山黧豆中毒事件可以追溯到希波克拉底(Hippocrates，BCE460-370)的敘述。但直到1844年，印度科學家Sleeman[9]才對此進行了較為準確的描述。1873年，Cantani將其正式命名為Lathyrism[10]，即山黧豆中毒；也可稱之為neurolathyrism[11]，即神經山黧豆中毒。之后，印度、埃塞俄比亞等國家發(fā)生了多起較大規(guī)模的山黧豆中毒事件(圖1)，也有一些文獻進行了詳細的報道和分析，并且發(fā)現(xiàn)山黧豆中毒造成的神經損傷是不可逆轉的[12]。

圖1 部分山黧豆中毒事件的時間軸圖Fig.1 Timeline of lathyrism in partial

山黧豆不同品種引起的中毒主要表現(xiàn)為兩種癥狀：一種是β-氨基丙腈(β-aminopropionitrile，BAPN)造成的骨中毒(osteolathyrism)[11, 13]，一種是神經山黧豆中毒[11]。骨中毒僅占神經山黧豆中毒的12%左右[14-16]。而且，在動物飼喂實驗和實際放牧中均未發(fā)現(xiàn)骨中毒的報道[17]。因此，科學家們主要對神經山黧豆中毒的原因進行了不懈的探索。β-氨基丙腈[18]、L-α,γ-二氨基丁酸[19]、β-腈基丙氨酸[20]等均曾被認為是山黧豆的致毒因子，但隨后因為導致的癥狀差異及在山黧豆品種之間分布的差異性被否認。Roy等[21]利用山黧豆的乙醇提取物注射雞后產生了嚴重的神經退行性癥狀，這與用純化的β-ODAP[22-23]注射雞產生的癥狀完全相同；說明β-ODAP是山黧豆導致的雞神經退行性癥狀的主要因素。對人工合成和天然純化的β-ODAP進行的紅外光譜和核磁共振結構分析進一步佐證了β-ODAP是山黧豆中毒的因素[24]。Spencer等[25]通過人和靈長動物食蟹猴的研究證實了β-ODAP和神經山黧豆中毒的直接關聯(lián)。β-ODAP的分離及其與神經山黧豆中毒的關聯(lián)研究也成為山黧豆研究史上的標志性事件。

1.2 山黧豆中毒機理解析

β-ODAP的天然提取物中含有7%～10%的α構象[26]，這說明β-ODAP可以發(fā)生分子重排形成α-ODAP并達到平衡[27-29]。但是，β-ODAP引發(fā)的神經山黧豆中毒具有結構的專一性，α-ODAP和D-構型β-ODAP均不導致神經山黧豆中毒[30-31]。

流行病學調查發(fā)現(xiàn)，神經山黧豆中毒顯著影響下肢，屬于上運動神經元疾病[32]；發(fā)病概率受到營養(yǎng)水平、飲食、性別、年齡和血型等多重影響[33-34]，主要在青年男子中發(fā)病[35]。

山黧豆中毒的病理學研究主要來自于雞、成年鼠、猴等動物的神經中毒模型[36-42]，偶見在人體中的報道[32]。研究表明，β-ODAP注射幼鼠腦部的葡萄糖、糖原、ATP、磷酸肌醇和乙酰膽堿等含量降低，無機磷、乳酸和乙酰膽堿酯酶水平增高[43]。而且，β-ODAP 可穿過幼年猴子等動物模型的血腦屏障，在中樞神經系統(tǒng)積累[37-38, 44]。

β-ODAP是谷氨酸的結構類似物，屬于興奮性氨基酸(excitatory amino acids，EAA)[45]。谷氨酸是神經系統(tǒng)中較普遍的興奮性神經遞質，其受體表現(xiàn)為N-甲基-D-門冬氨酸(N-methyl-D-asparate，NMDA)受體、海人草酸(Kainate，KA)和使君子氨酸(quisqualate，QA)受體(又稱為α-氨基-3羥基-5甲基-4異噁唑丙酸受體，α-amino-3- hydroxy-5-methyl-4-isoxazole propionate receptor，AMPA受體)等3種亞型。研究表明，β-ODAP與NMDA受體的甘氨酸位點具有較弱的拮抗作用[46-47]，這種作用在一定程度上表現(xiàn)為神經保護作用[47]。然而，絕大部分研究表明β-ODAP可通過QA和/或KA受體系統(tǒng)作用于神經元細胞[48-51]，尤其是對于AMPA受體具有高度的親和能力[52]。β-ODAP可以通過AMPA受體作用于大腦皮層神經系統(tǒng)[53-54]，引起神經細胞內鈣離子濃度增加[55]，表現(xiàn)為谷氨酸類似的興奮型神經毒性機制并導致神經退行性癥狀[52-53, 56]。在β-ODAP激活AMPA受體作用時伴隨著谷氨酸釋放到突觸間隙和NO的產生，進而產生活性氧形成氧化脅迫[57]。此外，β-ODAP通過激活蛋白激酶C(Protein kinase C，PKC)調控AMPA受體磷酸化及其功能[58]或導致磷脂酰乙醇胺結合蛋白(phosphatidylehthanolamine binding protein 1，PEBP1)磷酸化水平上調[59]。PEBP1水平下調及磷酸化修飾共同激活絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信號和G蛋白偶聯(lián)受體信號，導致興奮性中毒[59]。

β-ODAP還可以通過增加星形膠質細胞的谷氨酰胺合成酶活性調節(jié)中樞神經系統(tǒng)的谷氨酸含量[60]，并通過抑制神經元附近的星形細胞的谷氨酸/胱氨酸轉運體，導致神經元突觸的谷氨酸含量持續(xù)增加，引起興奮性中毒[61]。在抑制谷氨酸/胱氨酸轉運體的同時，β-ODAP可以抑制胱硫醚裂解酶(cystathionine-c-lyase)，導致Cys供應受到抑制，谷胱甘肽(glutathione，GSH)合成受限[62-63]，引起抗氧化脅迫能力的降低。

然而，β-ODAP和突觸膜只能以較低的特異性結合，不能確保β-ODAP與谷氨酸受體作用并產生效應[64]。而且，AMPA受體的廣泛性、β-ODAP對不同物種作用存在的差異性[23, 45]、β-ODAP和興奮性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)之間核磁結構的有限相似性研究[65]等，均表明β-ODAP導致的山黧豆中毒除了興奮性神經中毒機制之外可能還存在其他的作用機制。例如，代謝型谷氨酸受體I(group I metabotropic glutamatergic receptors，mGluRs)以非直接作用方式參與神經性山黧豆中毒[66]。β-ODAP還可以導致線粒體復合物Ⅰ功能紊亂[67]、線粒體內活性氧[68]和Ca2+濃度過載[69]或者天冬氨酸-α酮戊二酸轉氨酶及天冬氨酸-丙酮酸轉氨酶活性升高，導致慢性氨中毒[70-71]。值得關注的是，β-ODAP是酪氨酸氨基轉移酶(tyrosine aminotransferase，TAT)的抑制劑，可以導致腦部多巴和多巴胺的合成增加，表現(xiàn)為非興奮性作用方式[72]。

1.3 神經山黧豆中毒及β-ODAP生物學功能的再認識

1.3.1 膳食平衡與神經山黧豆中毒在災后以山黧豆為主要食物來源的人群中，神經性山黧豆中毒的比例小于5%[73]。這種個體化的差異可能受到年齡、烹調方法、生理狀態(tài)等多種因素影響[34]。而且，對于人神經性山黧豆中毒機制的理解主要來自于動物實驗的推論[34]。但是，大部分β-ODAP(84%)在包括靈長類動物在內的山黧豆中毒動物模型中未進行進一步代謝[44, 74]，在人體內則可被氧化為無毒的2,3-二氨基丙酸(2,3-Diaminopropionic acid，DAP)[34]。此外，通過浸泡、煮沸、煎烤等烹調手段及發(fā)酵處理等均可大幅度(90%以上)去除β-ODAP以消除山黧豆毒性[22, 75-76]。在印度監(jiān)獄中日常混用4～6盎司的山黧豆數年也表現(xiàn)出安全性[77]。因此，對于β-ODAP及神經山黧豆中毒的理解和研究仍然需要進一步加強。

在營養(yǎng)均衡條件下建立的靈長類動物的山黧豆中毒模型是可逆的，說明營養(yǎng)不良等因素可能是不可逆神經山黧豆中毒的必要因素[78-79]。在對埃塞俄比亞228例患者的流行病調查中，首次注意到了膳食平衡和含硫氨基酸缺乏在山黧豆中毒中的作用[80]。研究表明，山黧豆與硫營養(yǎng)比較豐富的谷類作物混合食用可以防止中毒的發(fā)生[81-82]。山黧豆飼料中添加甲硫氨酸可防止雞的神經中毒[83]。而且，洋蔥、姜、蒜等調味品具有較好的抗氧化活性[84]，可以降低氧化脅迫促進的山黧豆中毒風險[82,85]。在培養(yǎng)基上添加Met和/或Cys可以使神經元細胞避免β-ODAP引起的毒性[86-87]。這些結果均表明山黧豆中毒是神經毒性和營養(yǎng)不良的交互作用[88]。因此，膳食營養(yǎng)的均衡對于神經山黧豆中毒的預防至關重要[77]。這一觀點直到現(xiàn)在仍然是適用的，是山黧豆食用和飼用的重要原則。

由于優(yōu)良的綜合抗逆性，山黧豆在原始農業(yè)生產體系中占據競爭優(yōu)勢并被貧困人群過量食用(占主糧的1/3—1/2)，造成中毒。盡管它遠不是有毒植物或有毒豆類的代表，但在營養(yǎng)科學的研究史上，從來沒有一種豆科作物像山黧豆一樣被釘上有毒的標簽。實際上，山黧豆中毒主要發(fā)生在災后的邊遠農村[89]，種植戶為文盲、極度貧困且長期以山黧豆為唯一食物來源[1]。當和其他豆類一樣處于常規(guī)混合食用時，山黧豆毫無疑問是安全的[90]。因此，戰(zhàn)勝山黧豆中毒主要是消除貧窮和無知[8]。

1.3.2 β-ODAP的生物學功能除了山黧豆之外，豬屎豆[91]、金合歡[92]、蘇鐵[93]，及傳統(tǒng)中藥材人參、三七等中均含有較高水平β-ODAP(被命名為三七素，dencichine)[94-96]，說明β-ODAP的存在具有廣泛性，這也提示β-ODAP在植物中可能具有重要的生物學功能。例如，β-ODAP可以參與Zn2+轉運[97]，清除羥基自由基[98]，在強光下保護植物光呼吸代謝關鍵酶乙醇酸氧化酶活[99]等。此外，β-ODAP水平與山黧豆的抗逆性也密切關聯(lián)[100-103]。例如，干旱引起的ABA水平增加可以進一步促進β-ODAP的合成[104]。蔣景龍等[105]和宋瑤瑤等[106]分別綜述了山黧豆抗逆性研究以及β-ODAP代謝與抗逆性的關系。但是，β-ODAP與山黧豆抗逆性的關聯(lián)性仍需要進一步研究證實[57]。

值得關注的是，β-ODAP的神經作用具有劑量效應，在幾十個微摩爾水平對于AMPA受體的過度刺激可導致神經性山黧豆中毒[86, 107]；在嚴格控制 β-ODAP劑量(pmol)的情況下，可以激活以小腦cGMP變化為標志的神經傳遞而不引起神經元和動物模型的行為改變，表明該模型在神經退行性疾病研究中可能具有重要的價值[108]。

2 山黧豆基礎研究的文獻概況

在SCI科學引文索引數據庫中以Lathyrus為主題搜索到的文章接近3 000篇，其中以Lathyrussativus或者grass pea(栽培山黧豆)為主題的文章接近2 700篇，約占總數的90%(圖2，A)。這說明栽培山黧豆是該領域的主要研究對象。以20世紀60年代為拐點，β-ODAP的鑒定極大地促進了山黧豆的相關研究，發(fā)文量呈現(xiàn)明顯增加；直至20世紀90年代，β-ODAP代謝規(guī)律的研究促使發(fā)文量呈現(xiàn)新一輪的激增(圖2，A)。其中，以美國、印度、巴西、澳大利亞、加拿大、英國、意大利、德國、土耳其和中國等國科學家的發(fā)文量居多(圖2，B)。對近30年的文獻分析表明，山黧豆研究主要集中于臨床神經學、神經科學、藥理學和藥劑學、生化與分子生物學、毒理學等領域[109]，尤其在植物修復、健康促進、離體再生與遺傳育種、β-ODAP與逆境響應、基因組及多組學研究等方面取得了一定的進展[110]。

在國際上，比利時根特大學Lambein教授以接近60篇的發(fā)文量位居全球山黧豆研究科學家之首(圖2，C)，其工作極大地推動了β-ODAP生物合成、毒理機制、流行病學、營養(yǎng)學等眾多領域的研究。印度知名山黧豆學者Rao在山黧豆中毒機制及功能營養(yǎng)學研究、Spencer在山黧豆流行病學及毒理學研究、Ikegami和Kuo等在β-ODAP的生物合成及代謝研究、Siddique等在栽培生理研究、Rubiales和Patto在山黧豆遺傳多樣性和植物病理研究、Mehta在山黧豆中毒機制及生理生化研究等均做出了重要貢獻。極大地推動了人們對于山黧豆的全方位認識，發(fā)文量均名列前茅。在國內，蘭州大學植物化學家李志孝教授的發(fā)文量位居全球科學家第三，在β-ODAP的檢測和生物學功能研究等方面做出了重要貢獻。中國山黧豆研究先驅、蘭州大學王亞馥教授等多位中國學者均位列Top50(圖2，C)，在接近50年的研究過程中做出了系列重要貢獻(表1)，使中國的山黧豆研究始終處于國際主流地位。

CNKI中收錄的山黧豆研究中文文章始見于1966年(圖3，A)，共有40余家科研機構發(fā)表了學術論文191篇，學位論文33篇(圖3，B)。其中，蘭州大學的發(fā)文量遙遙領先于國內其他單位(圖3，B)，在一定程度上反映了蘭州大學在該領域的傳統(tǒng)優(yōu)勢地位。早在20世紀70年代，蘭州大學陳耀祖院士就建立了國內首個山黧豆課題組，通過不斷的開拓和傳承，在β-ODAP的檢測分析和生理生態(tài)學功能等研究方面形成了鮮明的特色。此外，中國農業(yè)大學圍繞林生山黧豆的引種栽培、丁二氨酸的代謝等展開研究，西北農林科技大學聚焦于β-ODAP的生物合成途徑研究和種質資源利用基礎研究，其發(fā)文量均位于國內三甲(圖3，B)。南充市農業(yè)科學院聚焦于山黧豆作為綠肥的推廣應用研究，中國農科院在山黧豆遺傳多樣性的研究等方面也形成了一定的傳統(tǒng)和優(yōu)勢。

3 目前的研究進展

與谷物相比，對于豆類在飲食和營養(yǎng)方面的學術研究要少很多，主要集中在豆類的抗營養(yǎng)因子和毒性研究[111]。對于毒理特征的過度強調，使得山黧豆的種質資源利用長期處于低谷。但在相關學者的長期堅持下，也取得了較為豐碩的成果。

3.1 山黧豆毒理學研究

流行病學調查和細胞實驗表明，神經山黧豆中毒與含硫營養(yǎng)的缺失呈正相關[81, 87]，但其細胞及分子機理尚不明確。由于β-ODAP與Glu是結構類似物且均為興奮性氨基酸，β-ODAP可能和Glu 競爭性結合Glu 受體AMPA并影響Ca2+通透性、神經元的發(fā)育等[112]。興奮性神經中毒機制也是目前接受程度最高的神經山黧豆中毒機制。

AMPA 受體阻滯劑1-萘基乙?；?精胺(1-naphthyl acetyl-spermine，NAS)可以特異性地抑制β-ODAP 誘導的細胞內[Ca2+]升高[68]。這進一步說明β-ODAP可結合并異常激活神經細胞的AMPA受體，破壞神經細胞內鈣穩(wěn)態(tài)。并使得Integrin β1等表達量上調，黏著斑激酶磷酸化增加，黏著斑蛋白單元在細胞微絲上大量聚集影響細胞骨架聚合，最終引起神經細胞營養(yǎng)障礙[113-114]。利用蛋白組學分析也表明，參與細胞骨架結構與信號傳遞、細胞代謝、自由基清除、氧化脅迫、神經退行性疾病的多個蛋白在β-ODAP處理2 h后表達量上調[115]。

3.2 β-ODAP分析方法

山黧豆種子的β-ODAP含量介于0.1%～2.5%[116]，其檢測分析是山黧豆研究的核心方法之一。在化學合成β-ODAP標準品的基礎上[117-118]，建立了多種β-ODAP的檢測方法，為β-ODAP含量分析及毒理機制研究奠定了堅實的基礎。多篇文獻曾詳細綜述了β-ODAP檢測方法[119-120]，包括比色法[121]，基于PITC、FDNB、6-aminoquinolyl-N-hydroxysuccinimidyl carbamate (AQC)等衍生的多種HPLC檢測方法[122-127]，氨基酸分析儀法[128]，毛細管電泳法[129-130]，流動注射法[131]，液相-質譜法[96]等。近來，Emmrich等[132]利用穩(wěn)定同位素標記的β-ODAP為內標建立了質譜分析方法，成為了β-ODAP分析檢測的金標準。此外，BIA[133]、草酸[134]等β-ODAP生物合成關鍵前體檢測方法的建立，為β-ODAP代謝規(guī)律的研究奠定了基礎。

3.3 山黧豆品質改良基礎研究

3.3.1 β-ODAP生物合成研究β-ODAP在山黧豆不同組織和器官中均有分布，其中在幼苗和發(fā)育種子中含量最高[135-136]。研究表明，山黧豆種子β-ODAP的含量主要受到遺傳背景的影響，但環(huán)境因素也有一定作用[15, 137-138]。Jiao等[139]全面綜述了β-ODAP含量的影響因素。例如，β-ODAP隨山黧豆生長階段呈現(xiàn)規(guī)律性變化[136]、水分脅迫增加β-ODAP含量[140]、鹽脅迫降低β-ODAP含量[141]等。此外，β-ODAP含量與N、P、金屬離子等多種元素相關[106, 139, 142-143]。

β-ODAP的生物合成途徑研究是山黧豆的核心研究內容之一，對于山黧豆的種質資源利用，三七、西洋參等含有β-ODAP物種的品質形成機理研究等具有重要意義。經過多位科學家的持續(xù)研究和驗證[100, 144-151]，提出了廣為接受的β-ODAP生物合成途徑。即環(huán)狀分子異噁唑-5-酮(Isoxazolin-5-one)在半胱氨酸合成酶(cysteine synthase，CS)催化下與O-乙酰絲氨酸(O-acetylserine，OAS)反應生成重要中間產物β-異噁唑-5-酮-丙氨酸[β-(isoxazoline-5- on-2-yl)-L-alanine，BIA][100, 150-152]；BIA開環(huán)后接受草酰輔酶A的草?；罱K形成β-ODAP[100, 153]。然而，在該合成途徑中，CS雖然能夠催化合成BIA，但其效率較低，僅為CS催化Cys合成效率的十分之一不到[150]；而且BIA開環(huán)后的產物L-α,β-二氨基丙酸(L-α,β-diaminopropionic acid，DAP)尚未檢測到，催化DAP形成β-ODAP的關鍵酶尚不清楚。

山黧豆β-腈基丙氨酸合成酶(β-cyanoalanine synthase，β-CAS)由于蛋白序列及功能與 CS高度類似，也被劃分到CS家族[154-155]。通過種子萌發(fā)期的CS、β-CAS活性檢測、BIA含量和β-CAS基因的組織表達分析等發(fā)現(xiàn)，β-CAS在β-ODAP的生物合成中起關鍵作用[155-158]。該酶表現(xiàn)為β-CAS和CS兩種酶活，是磷酸吡哆醛(pyridoxal phosphate，PLP)依賴的雙功能酶[155, 158]；可與絲氨酸乙酰基轉移酶(serine acetyltransferase，SAT)形成半胱氨酸合成酶調控復合物CRC(cysteine regulatory complex)起到β-ODAP生物合成分子開關的作用[158]。在硫充足情況下，山黧豆β-CAS 和LsSAT2形成CRC調控復合物，增強了SAT活性；充足的硫供應保證了Cys的合成，進而在游離β-CAS作用下合成BIA及β-ODAP。在低硫情況下，OAS的積累促使CRC解聚，降低了SAT活性；低水平的Cys限制了以其為底物的BIA及β-ODAP合成。但積累的OAS可在CS催化下和異噁唑-5-酮以較低效率合成BIA[158]。BIA在體內可以自發(fā)開環(huán)形成DAP。利用煙草瞬時表達系統(tǒng)進行驗證表明，DAP可在BAHD3?；D移酶的作用下和草酰輔酶A反應生成β-ODAP[159]。本課題組利用原核表達系統(tǒng)獲得BAHD3后，與豌豆粗提液進行反應也檢測到了β-ODAP的生成(數據待發(fā)表)。這說明BAHD3確實是催化BIA合成β-ODAP的關鍵酶。

長期以來，三七等植物中的β-ODAP研究均參照、引用山黧豆中的相關研究結果[160]。最近，由于三七染色體級別基因組的組裝，發(fā)現(xiàn)三七中可能存在有別于山黧豆的β-ODAP合成路徑[161]。其主要依據之一是基于代謝組分析在三七中未檢測到BIA及其前體物質異噁唑-5-酮[161]。然而，這一結果尚需進一步驗證。一是在山黧豆基因組已公布的情況下，該潛在通路中發(fā)掘的β-ODAP生物合成關鍵酶，如3-phosphoserine aminotransferase (PSAT)、Class II PLP-dependent enzymes(PALP)、ornithine cyclodeaminase(OCD)等應與山黧豆基因組[162]、轉錄組[163]等數據進行比較，以明確山黧豆中是否也存在相同代謝途徑。二是應進一步通過質譜等方法確認BIA及異噁唑-5-酮在山黧豆、三七、人參、西洋參等物種中的含量。因此，山黧豆仍然是β-ODAP生物合成研究的模式生物。

3.3.2 蛋白酶抑制劑等抗營養(yǎng)因子研究含硫氨基酸缺乏及存在過敏原蛋白、蛋白酶抑制劑等抗營養(yǎng)因子是山黧豆品質改良研究的主要方面[106]。山黧豆過敏可導致支氣管哮喘、過敏性鼻炎、面部浮腫和蕁麻疹等癥狀[164-167]。但山黧豆過敏原蛋白的研究相對較少，在過敏原蛋白數據庫(allergome)中僅收錄了4種山黧豆過敏原蛋白，其中Lat S 來自于栽培山黧豆。Qureshi等[167]鑒定了一個山黧豆過敏原蛋白2S albumin，與豌豆2S albumin序列相似性達到了85%。Xu等[168]利用花生過敏患者血清確認了花生與山黧豆的交叉過敏反應，并純化和鑒定了山黧豆47 kD過敏原蛋白β-lathyrin。山黧豆β-lathyrin與豌豆vicilin 、扁豆Len c 1 相似性較高，其抗原表位T8在花生、大豆、扁豆、綠豆等多種豆科作物中廣泛存在。進一步證實了山黧豆與花生、扁豆等存在的交叉過敏關系[168-169]。

胰蛋白酶抑制劑(trypsin inhibitor，TI)是大豆等豆科植物中重要的抗營養(yǎng)因子，可分為KTI(Kunitztrypsin inhibit)和BBI(Bowman-Birkproteaseinhibitor)兩大類[170]。在山黧豆中也分別檢測到了KTI和BBI活性[171-174]。研究表明，山黧豆TI易溶于異丙醇[175]，其活性介于大豆和蠶豆等其他食用豆之間[17]。Xu等[176]對不同地域來源的51個山黧豆樣本進行了抗營養(yǎng)因子KTI和BBI的生化特征分析，篩選到了1個巴西山黧豆(PI337007)和2個塞浦路斯山黧豆品種(PI206375，PI283567)具有較低的KTI和BBI活性，為進一步的品種選育奠定了基礎。實際上，在將山黧豆作為豬等動物飼料時，抗營養(yǎng)因子KTI和BBI的影響遠遠大于β-ODAP[177]。山黧豆β-ODAP的生物合成與硫代謝密切相關，而過敏原蛋白β-lathyrin可能受到硫代謝關鍵化合物OAS的調節(jié)，抗營養(yǎng)因子KTI和BBI也富含二硫鍵[106]。因而，研究硫代謝對于山黧豆含硫氨基酸、β-ODAP及抗營養(yǎng)因子KTI和BBI合成的調控，進而篩選低抗營養(yǎng)因子種質將是山黧豆品質改良研究的重要內容。

3.3.3 山黧豆種質資源篩選及品種改良伴隨著神經山黧豆中毒機制的研究，低β-ODAP品系的選育一直都是山黧豆育種的重要方向。其中，種質資源評價和篩選、傳統(tǒng)育種、突變體育種、體細胞突變、轉基因育種和農田綜合管理等多種手段均可起到重要作用[178]。熊友才等[179]曾進行了細致的綜述。

栽培山黧豆具有極其豐富的農藝品質變異，通過品質資源篩選有望獲得優(yōu)良品系[180]。例如，Roy等[181]通過篩選獲得了低β-ODAP品系P-24，并廣泛栽培。陳耀祖等[182]從65個品種中篩選到5個低毒高產、抗旱耐寒的栽培山黧豆品種，并用于動物飼料。此外，‘西選1號’、‘南選山黧豆’等也是國內篩選的優(yōu)良品種(表1)。通常，傳統(tǒng)雜交育種在作物育種中占據主體地位。但是，栽培山黧豆和除L.Amphicarpos、L.cicera之外的山黧豆種內雜交不親和[183]，與豌豆等物種的種間雜交不親和[184]，這極大地限制了傳統(tǒng)雜交技術的應用。山黧豆和豌豆原生質體融合是一條可能的途徑[184]。中國科學家曾用60Coγ射線[185]、C6+重離子[186]、60Coγ射線與EMS復合處理[187]等對山黧豆種子進行了誘變劑量和誘變效果的探索。近年來，Emmrich[159]利用EMS誘變獲得了3個低β-ODAP品系，并在非洲進行推廣。

山黧豆離體再生體系的建立[188-194]是基因工程育種的前提條件。研究表明，再生植株[195]和體細胞突變株[196-197]的β-ODAP含量均顯著降低。此外，針對β-ODAP生物合成途徑相關基因，利用山黧豆遺傳轉化體系[198-199]，有望獲得低β-ODAP品系。例如，在山黧豆中過表達草酸脫羧酶基因，在降低草酸含量(75%)的同時降低了β-ODAP含量(73%)[200]。此外，DNA分子標記被廣泛用于山黧豆遺傳育種和多樣性研究等[201]。

長期以來，山黧豆品種選育都是以低β-ODAP含量為首要目標。隨著對神經山黧豆中毒機制和β-ODAP生物學功能研究的深入理解，山黧豆育種工作也向低β-ODAP含量兼具早花、大籽粒、高產、高收獲指數等優(yōu)良農藝性狀發(fā)展[137]。此外，山黧豆具有極強的抗旱、抗病性，可以作為豌豆等其他作物抗逆遺傳育種的基因庫。

3.4 山黧豆種質資源利用研究

少數主流作物的盛行以及依賴單一作物作為主食的飲食習慣造成了很多高品質作物的資源浪費，也影響到人們的食品安全和人口健康。在聯(lián)合國糧農組織提出的零饑餓計劃(Zero Hunger in Asia and the Pacific)中，未來智慧食物(Future Smart Food，F(xiàn)SF)代表了農業(yè)生產及消費的新方向[5]。FSF又被稱為“被忽視和未充分利用的作物”(neglected and underutilized species，NUS)、“孤兒作物”(orphan crops)、“有希望的作物”(promising crops)等，可以提供豐富的營養(yǎng)元素、具有一定氣候適應性、低成本以及易栽培等特征。山黧豆因為較高的蛋白含量、廣譜的抗逆性以及對環(huán)境友好等特征而名列其中[5]。因此，進一步篩選山黧豆種質資源，并在干旱、半干旱地區(qū)以及待發(fā)達地區(qū)的推廣應用具有廣闊前景。

作為綠肥和飼料也是目前山黧豆種質資源的主要利用方向。山黧豆作為綠肥常見于澳大利亞、加拿大以及中國四川、貴州、湖北、河北等地。在加拿大進行的研究表明，山黧豆代替休耕方式和小麥輪作，可以顯著提升土壤有機氮等理化性質[202-203]。雖然山黧豆和豌豆、扁豆等豆科綠肥在土壤水分、有效氮及有效磷等的改善中差異不大[204]，但更適合半干旱土壤和貧瘠土壤[205]。韓文斌等[206]比較了山黧豆不同播期和播量對橘園間作下山黧豆產量及農藝性狀的影響，對橘園山黧豆間作高產栽培措施進行了分析和評價[207]。而且，在橘園中播種山黧豆等作為豆科綠肥以起到保水、降溫、改土肥田作用已明確寫入中國農業(yè)農村部發(fā)布的《果菜茶有機肥替代化肥技術指導意見》中，并和苕子、箭筈豌豆等一起作為長江上游柑橘帶、贛南-湘南-桂北柑橘帶、浙-閩-粵柑橘帶“綠肥+自然生草”模式的主推品種。

在飼料應用方面，Hanbury等[17]對山黧豆飼用的安全性和可能性做了詳細的綜述；可用于魚、鳥、豬、牛、羊等[17, 208]，也可和大麥等混合作為青貯飼料[209]。陳耀祖院士等曾篩選到低β-ODAP山黧豆(0.075%～0.093%)。在甘肅武威的種植和動物實驗表明，β-ODAP含量穩(wěn)定，在飼喂驢、豬、羊(日飼喂量50%～80%)超過半年未發(fā)現(xiàn)急性或慢性山黧豆中毒[180,182]。李鳳民等[210]曾將山黧豆與苜蓿等制備為混合飼料用于兔等嚙齒類動物。山黧豆飼料尤其適合于反芻動物。在反芻動物中沒有山黧豆中毒的報道，可能是反芻動物的腸、瘤胃中具有降解β-ODAP的微生物埃氏巨球型菌(Megasphaeraelsdenii)、雙酶桿菌(Clostridiumbifermentans)等[211-212]。這也表明可采用復合菌劑處理提高山黧豆飼草安全性。

3.5 學術會議和學術組織

自1985年首次召開山黧豆國際會議后，在法國、英國、埃塞俄比亞、孟加拉、比利時等國家舉辦了至少10次國際性專題研討會[179]。其中，2004年在敘利亞召開的國際會議(International Workshop on Grasspea as a Food/Feed Crop)上探討了山黧豆食用和飼用的安全性。2009年在比利時召開的國際會議(International Workshop on the Toxico-Nutritional Neurodegenerations Konzo and Lathyrism)上對于神經山黧豆中毒與營養(yǎng)均衡之間的關系等進行了深入探討，為山黧豆的安全利用奠定基調[179]。

為了加強信息交流，促進國際合作研究，山黧豆研究相關人員發(fā)起了國際山黧豆提升和山黧豆中毒消除合作組織(International Network for the Improvement ofLathyrussativusand the Eradication of Lathyrism，INILSEL)、木薯氰化物中毒和神經山黧豆中毒合作組織(Cassava Cyanide Diseases &Neurolathyrism Network，CCDNN)等，建設了Lathyrus Lathyrism Newsletter和CCDNN News等山黧豆專業(yè)通訊期刊，極大地促進了國際山黧豆研究專家的交流與合作。近期，由英國詹姆斯·赫頓研究所(the James Hutton Institute)、全球作物多樣性信托基金(the Crop Trust)和國際干旱地區(qū)農業(yè)研究中心(ICARDA)聯(lián)合發(fā)布的山黧豆網站(www.grasspea.net)，將致力于整合現(xiàn)有山黧豆信息和資源，促進山黧豆合作研究。

中國的山黧豆研究長期呈現(xiàn)發(fā)散態(tài)勢。自2018年以來，中國山黧豆科研人員的交流逐漸增加，以蘭州大學為牽頭單位成立了甘肅省山黧豆產業(yè)技術創(chuàng)新戰(zhàn)略聯(lián)盟，并于2021年初在陜西楊陵召開了全國性的山黧豆生物學學術研討會，產生了熱烈的思想碰撞，極大地促進了山黧豆研究學者之間的交流，有力地推動了中國山黧豆高水平基礎研究和推廣應用研究(表1)。

表1 中國山黧豆研究進程中的重要事件

4 存在的問題和未來研究方向

近年來，山黧豆相關基礎研究和推廣應用在經過短暫的高潮后，目前處于深入發(fā)展的瓶頸期，但前景仍然十分廣闊。

A. 不同年份的發(fā)表情況；B.不同國家的發(fā)表情況；C. 發(fā)表文章數量前50名的科學家圖2 山黧豆研究發(fā)表的SCI 論文情況A. Papers published in different years; B. Papers published in different countries; C. Top 50 scientistsFig.2 Distribution of Lathyrus-related SCI papers

4.1 山黧豆分子生物學等基礎研究亟待強化

基因組學及代謝組學等是解析豆科作物天然產物生物合成途徑的關鍵技術。在分子生物學、基因工程等研究手段層出不窮、飛速發(fā)展的今天，山黧豆的分子生物學研究處于相對滯后的狀況。Emmrich等[162]雖然獲得了山黧豆的基因組草圖，并利用BUSCO(Benchmarking Universal Single-Copy Orthologs)評估顯示基因組組裝完整度超過80%；但山黧豆較大的基因組使得染色體級別的組裝仍然面臨巨大挑戰(zhàn)。近年來，轉錄組學[163]、代謝組學[213]等紛紛用于β-ODAP的合成通路研究，蛋白組學[214]、轉錄組學[215]、代謝組學[216]等用于山黧豆抗脫水脅迫的分子機制研究，而轉錄組學在山黧豆遺傳多樣性研究中也廣泛采用[217]。但是，β-ODAP生物合成關鍵基因的功能研究和山黧豆抗逆分子機制研究等仍然相對匱乏，嚴重影響了對于山黧豆優(yōu)良生物學性狀的理解和進一步開發(fā)利用。

續(xù)表1 Continued Table 1

此外，蓬勃發(fā)展的CRISPR基因編輯技術在水稻、小麥等作物基因功能研究及遺傳改良中的應用已經非常廣泛。Zhang 等[218]綜述了CRISPR在作物定點改造及精準育種中的重要應用，并對利用CRISPR加速作物的遺傳改良解決糧食短缺問題進行了展望。但是，山黧豆高效離體再生和轉化體系的不成熟限制了CRISPR技術的應用。VIGS(Virus induced gene silencing)技術是豆科作物基因功能研究的重要工具[219]，在栽培山黧豆[220]中的成功應用將有利于基因功能的深入研究。

4.2 山黧豆種質資源利用急需系統(tǒng)規(guī)劃

種質資源是農業(yè)科技原始創(chuàng)新、現(xiàn)代種業(yè)發(fā)展的物質基礎。法國國家植物保護機構(CBNPMP)和國際干旱地區(qū)農業(yè)研究中心(ICARDA)分別保存了4 477份和3 239份山黧豆種質資源。印度和孟加拉等傳統(tǒng)山黧豆食用國家也分別保存了2 000份左右。其中，栽培山黧豆品種占據一半以上[221]。中國的山黧豆種質資源收集呈散發(fā)狀態(tài)，蘭州大學、西北農林科技大學、中國農科院、甘肅農科院、榆林農科院、南充市農科院、江蘇農科院等均有收集保存。此外，國家種質庫共收集引進山黧豆屬種質資源476份，包含中國內種植的栽培種有36份。

A. 不同年份的發(fā)表情況；B. 發(fā)表文章數量前20名的機構：1.蘭州大學；2.中國農業(yè)大學；3. 西北農林科技大學；4.南充市農業(yè)科學研究所(現(xiàn)南充市農業(yè)科學院)；5.東北師范大學；6.中國農業(yè)科學院中獸醫(yī)研究所(現(xiàn)蘭州獸醫(yī)研究所)； 7.中國農業(yè)科學院農業(yè)資源與農業(yè)區(qū)劃研究所；8.西北民族學院(現(xiàn)西北民族大學)；9.天水師范學院；10.陜西理工學院(現(xiàn)陜西理工大學)；11.華中農業(yè)大學；12.甘肅省農業(yè)科學院土壤肥料研究所(現(xiàn)甘肅省農業(yè)科學院土壤肥料與節(jié)水農業(yè)研究所)；13.貴州大學；14.四川大學；15.貴州省農業(yè)科學院土壤肥料研究所；16.中國科學院近代物理研究所；17.黑龍江八一農墾大學；18.哈爾濱師范大學；19.甘肅農業(yè)大學；20.中國農業(yè)科學院作物科學研究所圖3 山黧豆研究發(fā)表的中文論文情況A. Papers published in different years; B. Top 20 institutions： 1. Lanzhou University; 2. China Agricultural University; 3. Northwest A&F University; 4. Nanchong Academy of Agricultural Sciences; 5. Northeast Normal University; 6. Lanzhou Veterinary Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences (CAAS); 7. Institute of Agricultural Resources and Regional Planning, CAAS; 8. Northwest Minzu University; 9. Tianshui Normal University; 10. Shaanxi University of Technology; 11. Huazhong Agricultural University; 12. Institute of Soil, Fertilizer and Water-saving Agriculture, Gansu Academy of Agricultural Sciences; 13. Guizhou University; 14 Sichuan University; 15. Soil and Fertilizer Institute, Guizhou Academy of Agricultural Sciences; 16. Institute of Modern Physics, Chinese Academy of Sciences; 17. Heilongjiang Bayi Agricultural University; 18. Harbin Normal University; 19. Gansu Agricultural University; 20. Institute of Crop Sciences, CAAS.Fig.3 Lathyrus-related papers published in Chinese

山黧豆種質資源仍然處于粗放式利用階段，缺乏系統(tǒng)規(guī)劃和深度挖掘。目前，定西等地主產栽培山黧豆，用于土地倒茬輪作或被收購用于魚料、鳥料配伍；寧夏局部仍較大規(guī)模采用栽培山黧豆作為牛羊飼料；四川等地主產扁莢山黧豆，廣泛用于綠肥等。實際上，山黧豆蛋白含量高、綜合抗逆性好，可在海拔1 800 ～ 2 800 m的高寒地帶生長[222]，針對青海等高海拔地區(qū)豆科牧草缺乏現(xiàn)狀，對山黧豆品種展開篩選工作非常必要。此外，山黧豆根系發(fā)達、耐貧瘠，對于鎘、鉛等重金屬污染土壤具有較好的修復作用[223-226]，可以應用于荒漠土壤改良、礦山土壤修復等。而且，根瘤菌可以顯著提升山黧豆的鉛耐受能力[227]。

在最近召開的全國山黧豆生物學學術研討會上，西北農林科技大學山黧豆課題組提出了山黧豆的綜合利用方案，認為山黧豆在食用、飼用、觀賞、藥用、土壤改良等多方面均具有進一步深入挖掘的潛力(圖4)。目前，該課題組聯(lián)合甘肅農科院西北種質資源保存與創(chuàng)新利用中心，通過對山黧豆種質資源進行精準鑒定和評價篩選，進一步推動山黧豆種質資源保存分庫(圃)建設，為西部農業(yè)生態(tài)的安全保障提供有價值的種質資源。

圖4 山黧豆種質資源利用Fig.4 Utilization of Lathyrus germplasm

4.3 山黧豆作為功能性食品的探索前景廣闊

過量食用山黧豆導致神經中毒的發(fā)生，促使印度等國家政府在20世紀50、60年代頒布的防止食品參雜條例(Rule 44-A of the Prevention of Food Adulteration Rules)中限制了山黧豆的大面積銷售和使用。然而，包括印度、孟加拉、葡萄牙、中國等多個國家的干旱半干旱地區(qū)仍然零散種植并食用山黧豆。印度流行病調查顯示，在營養(yǎng)均衡條件下食用山黧豆長達34年并未引起山黧豆神經中毒發(fā)生[228-229]。孟加拉的調查也發(fā)現(xiàn)，山黧豆在食物中的占比小于1/3的情況下食用是安全的[230]。近30年以來，未見到山黧豆中毒事件的報道，說明減少食用范圍和多元化飲食完全可以避免山黧豆中毒發(fā)生。實際上，波蘭在1997年就重新開放了山黧豆作為農作物的品種登記(1960年曾移除)[231]。印度醫(yī)學研究理事會(indian council of medical research，ICMR)也于2016年解除了對于山黧豆的禁止條例[232]，并在發(fā)布的2020年食品安全和標準修訂草案中將禁止和限制銷售山黧豆修訂為山黧豆在食物中的添加量不超過2%。這為山黧豆種質資源的重新利用和加工帶來了曙光。

在解析神經山黧豆中毒因素的同時，科學家們也在關注山黧豆自身的營養(yǎng)價值[233-234]。例如，山黧豆種子含有41%淀粉和17%膳食纖維(2%可溶，15%不可溶)，適合添加到食物中以增加飽腹感和延遲血糖反應[235]；較高的膳食纖維有利于心血管疾病治療[236]。實際上，山黧豆研究國際知名專家Rao[237]和Lambein[1]等均認為山黧豆種子含有多種潛在功能成分。對這些功能成分及其藥理活性研究表明，山黧豆作為新型功能食品具有重要的開發(fā)價值[238]。例如，山黧豆油脂含量約2%，其中亞麻酸等ω3脂肪酸及其他多不飽和脂肪酸可達60%[239-240]，從而使山黧豆具有潛在的降血脂、抗血栓形成、抗炎等諸多藥用功效功能[241]。山黧豆種子含有的肌醇磷酸聚糖(inositol phosphoglycan，IPG)具有類胰島素活性，是山黧豆用于減緩糖尿病癥狀的主要原因[242]。富含的賴氨酸[243]可以作為膳食營養(yǎng)平衡的重要來源。而且，山黧豆是已知作物中高精氨酸(HA)的唯一膳食來源[1]，這進一步提升了山黧豆的營養(yǎng)利用價值[244-246]，因為HA可以作為酶底物持續(xù)產生和維持內源性NO水平，引發(fā)血管擴張等。甚至，低血漿HA水平可作為心臟猝死的獨立預測因子[247]。即使對于山黧豆中備受關注的β-ODAP而言，低劑量對于神經細胞也具有一定的保護作用，并可用于制備治療神經變性病藥物[248]。而且，人成神經母細胞瘤的體外研究表明，β-ODAP對阿爾茲海默癥的治療可能具有一定的作用[90]。

致謝：感謝蘭州大學李志孝教授在成稿過程中的仔細閱讀并提出寶貴意見！感謝王亞馥教授、李志孝教授、王崇英教授等山黧豆研究先驅的不懈努力和長期堅守，使山黧豆研究的良好傳統(tǒng)得以傳承！感謝全國山黧豆研究同仁和甘肅省山黧豆產業(yè)技術創(chuàng)新戰(zhàn)略聯(lián)盟的長期支持！