干旱脅迫下發(fā)菜光合作用相關(guān)基因差異表達(dá)分析

馬曉蓉，梁新華，張 箏，胡進(jìn)紅，周思麗，梁文裕

(寧夏大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院, 銀川 750021)

發(fā)菜(Nostocflagelliforme)是一種分布在中國(guó)西北干旱半干旱荒漠草原地區(qū)的陸生固氮念珠藻。發(fā)菜為適應(yīng)干旱的生存環(huán)境，進(jìn)化出一系列獨(dú)特的形態(tài)結(jié)構(gòu)和生理代謝特性來(lái)適應(yīng)干旱，如細(xì)胞被主要成分為多糖的膠質(zhì)鞘包裹，使發(fā)菜具有極強(qiáng)的吸收水分和保持水分的能力，在極端干旱環(huán)境下與其他旱生植物相比具有更強(qiáng)的適應(yīng)能力，干旱脅迫下發(fā)菜生理活性降低甚至進(jìn)入類似休眠狀態(tài)以度過(guò)不良時(shí)期[1]。已有研究表明，陸生念珠藻耐干旱的機(jī)理是其結(jié)構(gòu)、生理及分子水平上協(xié)調(diào)作用的綜合反映[2]。

由于光合作用作為發(fā)菜生長(zhǎng)發(fā)育的生理基礎(chǔ)和能量代謝的起點(diǎn)，其相關(guān)基因差異表達(dá)及其調(diào)控的機(jī)制對(duì)深入理解其生長(zhǎng)發(fā)育和抗逆機(jī)制至關(guān)重要，雖然目前對(duì)發(fā)菜響應(yīng)干旱脅迫的光合生理及蛋白質(zhì)表達(dá)規(guī)律有了初步的認(rèn)識(shí)，然而發(fā)菜在干旱脅迫條件下光合機(jī)構(gòu)及光合作用相關(guān)基因如何變化以適應(yīng)干旱脅迫并不明確。因此，本研究采用高通量測(cè)序技術(shù)及生物信息學(xué)方法對(duì)發(fā)菜干旱脅迫下差異表達(dá)的光合作用相關(guān)基因進(jìn)行篩選，采用qRT-PCR進(jìn)一步分析關(guān)鍵基因差異表達(dá)規(guī)律，并對(duì)光合色素和相關(guān)酶活性進(jìn)行檢測(cè)，進(jìn)而解析干旱條件下發(fā)菜光合相關(guān)基因差異表達(dá)規(guī)律，為深入認(rèn)識(shí)發(fā)菜耐旱的光合分子機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材 料

將采自寧夏賀蘭山自然生長(zhǎng)的發(fā)菜培植于培養(yǎng)床上，持續(xù)培養(yǎng)10 d，測(cè)定光合速率及Rubisco活性，與野生狀態(tài)發(fā)菜進(jìn)行比較，確保發(fā)菜處于正常生長(zhǎng)狀態(tài)后對(duì)樣品進(jìn)行處理。發(fā)菜失水率0%的樣品為對(duì)照組(A)，經(jīng)過(guò)失水處理30 min、60 min和48 h分別獲得發(fā)菜失水率為30%的樣品(B)、75%的樣品(C)和100%的樣品(D)。每組處理重復(fù)3次。

1.2 方 法

1.2.1 RNA提取及cDNA測(cè)序文庫(kù)構(gòu)建發(fā)菜RNA提取采用楊佳[9]的方法。樣品總RNA質(zhì)量檢測(cè)合格后，構(gòu)建測(cè)序文庫(kù)。將RNA樣本充分混合，然后去除rRNA富集mRNA。以mRNA為模板，合成第一條cDNA鏈，經(jīng)過(guò)dNTP反轉(zhuǎn)錄合成第二條cDNA鏈，純化雙鏈cDNA以及做末端修復(fù)、加polyA并連接測(cè)序接頭，然后進(jìn)行片段大小選擇，最后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，建立樣本轉(zhuǎn)錄組測(cè)序文庫(kù)。

使用核酸蛋白定量?jī)x(Qubit2.0)初步定量構(gòu)建完成的文庫(kù)，稀釋文庫(kù)至1 ng/μL，隨后使用安捷倫2100生物分析儀(Agilent 2100)對(duì)文庫(kù)的大小進(jìn)行檢測(cè)。采用qRT-PCR方法將插入片段符合預(yù)期的文庫(kù)準(zhǔn)確定量其有效濃度(文庫(kù)有效濃度>2 nmol/L)，以確保文庫(kù)質(zhì)量達(dá)到送樣要求。

1.2.2 Illumina HiSeq測(cè)序及差異基因篩選通過(guò)高通量Illumina HiSeq PE150測(cè)序平臺(tái)對(duì)已構(gòu)建好的文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序獲得原始數(shù)據(jù)。對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行去除帶接頭(adapter)的讀段(reads)、去除N(N表示無(wú)法確定堿基信息)的比例大于10%的reads和去除低質(zhì)量reads(堿基質(zhì)量值Phredscore≤5的堿基數(shù)占整個(gè)讀段長(zhǎng)度的50%以上)的處理，獲得測(cè)序后的過(guò)濾數(shù)據(jù)(clean reads)。然后以發(fā)菜基因組(http://genome. kazusa.or.jp/cyanobase/NostocflagelliformeCCNUN1)作為參考基因組進(jìn)行序列比對(duì)。以P<0.05為光合作用相關(guān)差異表達(dá)基因篩選標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.3 光合作用相關(guān)基因的qRT-PCR分析選擇轉(zhuǎn)錄組測(cè)序中篩選的部分重要差異光合作用相關(guān)基因進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證。qRT-PCR定量實(shí)驗(yàn)用(Vazyme)諾唯贊生物科技有限公司(中國(guó)，南京)試劑盒完成。熒光定量檢測(cè)用ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix試劑盒。根據(jù)NCBI上已發(fā)表的發(fā)菜基因組信息，用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)目的基因擴(kuò)增引物(表1)，內(nèi)參基因16S rDNA引物16S-F和16S-R，用Roche LightCycler480型熒光定量PCR儀進(jìn)行反應(yīng)，PCR擴(kuò)增條件為95 ℃ 10 min；95 ℃ 30 s；60 ℃ 1 min；共41個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCt方法[10-11]分析基因的相對(duì)表達(dá)量，每個(gè)反應(yīng)3次重復(fù)。

表1 基因功能注釋及引物序列

1.2.4 光合色素含量檢測(cè)藻藍(lán)素、異藻藍(lán)素、藻紅素和藻膽素含量測(cè)定參照張薇君等[12]的方法。

藻藍(lán)素(PC，mg·mL-1)=0.187OD620-0.089OD652

異藻藍(lán)素(APC，mg·mL-1) = 0.196OD652-0.041OD620

藻紅素(PE，mg·mL-1) =0.104OD562-0.253PC-0.088APC

藻膽蛋白(w，%)=PC%+APC%+PE%

葉綠素a、類胡蘿卜素含量測(cè)定參照馬增嶺[13]的方法。

葉綠素a含量：Ca (μg·mL-1)=16.29×OD665-8.54×OD652

類胡蘿卜素含量：C (μg·mL-1)=7.6×(OD480-1.49×OD510)。

1.2.5 干旱脅迫下Rubisco和GAPDH活性測(cè)定采用蘇州科銘生物技術(shù)有限公司對(duì)Rubisco活性進(jìn)行測(cè)定。在340 nm吸光度的變化可計(jì)算還原型輔酶Ⅰ氧化速率，還原型輔酶Ⅰ氧化速率可反映Rubisco的活性。25 ℃中1 mg蛋白1 min氧化1 nmol NADH，按樣本蛋白濃度計(jì)算Rubisco活性。

GAPDH活性測(cè)定采用蘇州科銘生物技術(shù)有限公司試劑盒。通過(guò)分光光度計(jì)測(cè)定340 nm處NADPH減少量計(jì)算GAPDH活性，每mg組織蛋白每分鐘消耗1 nmol的NADH定義為一個(gè)酶活力單位。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS Statistics 26.0、Origin和Excel進(jìn)行方差分析檢驗(yàn)結(jié)果的差異顯著性并作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量評(píng)價(jià)

樣本測(cè)序數(shù)據(jù)中，每個(gè)樣本的錯(cuò)誤率≤0.03%，測(cè)序堿基質(zhì)量值大于20的堿基占總體堿基的百分比在97%以上、大于30的堿基在93%以上。GC含量占總堿基的45%左右。測(cè)序數(shù)據(jù)具有較高的準(zhǔn)確性。對(duì)發(fā)菜4個(gè)的不同樣本進(jìn)行相關(guān)性檢測(cè)，樣本間的相關(guān)系數(shù)均大于0.88，表明測(cè)序數(shù)據(jù)可靠、樣本間重復(fù)性良好且變異不大。

2.2 干旱脅迫下發(fā)菜光合作用相關(guān)基因的差異表達(dá)

對(duì)發(fā)菜干旱脅迫下所有差異表達(dá)基因通過(guò)KEGG pathway顯著性富集進(jìn)行分析，選擇顯著富集到光合作用途徑的相關(guān)基因(P<0.05)，包含113個(gè)差異基因(表2)。以失水率0%(A)為對(duì)照，失水率30%(B)發(fā)菜光合作用的差異基因共有44個(gè)，失水率75%(C)發(fā)菜光合作用的差異表達(dá)基因共有74個(gè)，失水率100%(D)發(fā)菜光合作用差異表達(dá)基因共有91個(gè)。B、C和D均有顯著差異基因的個(gè)數(shù)為31個(gè)(圖1)。進(jìn)一步分析表明，B樣上調(diào)基因?yàn)?個(gè)，占光合作用總差異基因18.2%，下調(diào)基因?yàn)?6個(gè)，占光合作用總差異基因81.2%；C樣上調(diào)基因?yàn)?1個(gè)，占光合作用總差異基因28.4%，下調(diào)基因?yàn)?3個(gè)，占光合作用總差異基因71.6%；D樣上調(diào)基因?yàn)?6個(gè)，占光合作用總差異基因50.5%，下調(diào)基因?yàn)?5個(gè)，占光合作用總差異基因49.5%。

表2 不同發(fā)菜樣品參與光合作用相關(guān)的差異表達(dá)基因

續(xù)表2 Continued Table 2

續(xù)表2 Continued Table 2

2.3 干旱脅迫下發(fā)菜光合作用相關(guān)差異基因的qRT-PCR分析

對(duì)干旱脅迫下發(fā)菜12個(gè)光合相關(guān)基因進(jìn)行qRT-PCR分析。結(jié)果表明，隨著干旱脅迫程度的加深，Psb27、gap2、PsbL、PetE、PsbX、ZDS和PetJ先下降然后上升最后又下降，且都在失水率為75%時(shí)表達(dá)量最高。PsaK、CrtW、CRTISO5、PetH和PsaB呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì)，且PsaK、CrtW、CRTISO5基因在失水率為75%時(shí)表達(dá)量最高，而PetH和PsaB基因在失水率為30%時(shí)表達(dá)量最高。實(shí)時(shí)熒光定量反應(yīng)的結(jié)果與RNA-seq數(shù)據(jù)基本一致，從而證實(shí)了發(fā)菜干旱脅迫下這些基因的表達(dá)模式(圖2)。

A. 失水率為0%的樣品；B. 失水率為30%的樣品；C. 失水率為75%的樣品；D. 失水率為100%的樣品；vs. 比較；下同圖1 干旱脅迫下發(fā)菜光合作用相關(guān)差異表達(dá)基因A. Water loss 0%; B. Water loss 30%; C. Water loss 75%; D. Water loss 100%; vs. Control; the same as belowFig.1 Differential expression genes related to photosynthesis of N. flagelliforme under drought stress

圖2 不同干旱脅迫下發(fā)菜光合相關(guān)基因的qRT-PCR分析Fig.2 Analysis of qRT-PCR data of photosynthesis-related genes from N. flagelliforme under drought stress

2.4 干旱脅迫下發(fā)菜光合色素含量及相關(guān)酶活性分析

發(fā)菜藻藍(lán)素、異藻藍(lán)素、藻紅素和藻膽素隨著干旱脅迫的加強(qiáng)，其含量呈顯著降低的趨勢(shì)。藻藍(lán)素、異藻藍(lán)素、藻紅素和藻膽素含量在失水率為0%時(shí)與30%、75%和100%時(shí)呈現(xiàn)顯著差異，但在失水率為30%、75%和100%時(shí)，相互之間沒(méi)有顯著性差異(圖3)。

PC.藻藍(lán)素；APC.異藻藍(lán)素；PE.藻紅素圖3 干旱脅迫下發(fā)菜色素含量和酶活性檢測(cè)PC. Phycocyanin; APC. Allophycocyanin; PE. PhycoerythrinFig.3 Detection of pigment contents and enzyme activities of N. flagelliforme under drought stress

發(fā)菜葉綠素a和類胡蘿卜素含量隨干旱脅迫的增加呈顯著下降趨勢(shì)。失水率為0%時(shí)與30%、75%和100%時(shí)葉綠素a和類胡蘿卜素含量呈現(xiàn)顯著差異，但類胡蘿卜素含量分別在失水率為0%和30%時(shí)及30%和75%時(shí)沒(méi)有顯著性差異(圖3)。

Rubisco活性隨著干旱脅迫的增加呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)(圖3)，且失水率為30%的時(shí)候Rubisco活性達(dá)到最大值，但在失水率為0%、75%和100%時(shí)相互之間沒(méi)有顯著性差異。隨著干旱脅迫的增加，GAPDH的活性逐漸下降，失水率為0%時(shí)與30%、75%和100%時(shí)GAPDH的活性差異顯著，但在失水率為75%和100%時(shí)沒(méi)有顯著性差異(圖3)。

3 討 論

3.1 干旱脅迫對(duì)發(fā)菜光合色素及相關(guān)基因差異表達(dá)的影響

光合色素包括葉綠素、反應(yīng)中心色素和輔助色素等，存在于類囊體膜上，主要參與光能吸收、傳遞，以及原初光化學(xué)反應(yīng)等過(guò)程。與高等植物相比，藍(lán)藻有其特殊的光捕獲系統(tǒng)，主要由藻膽體(PBSs)組成，而藻膽體由藻膽蛋白和接頭多肽組成。藻膽體主要分為藻藍(lán)素(PC)、異藻藍(lán)素(APC)和藻紅素(PE)。PE吸收的光能先遷移到PC，然后轉(zhuǎn)移到APC，最后轉(zhuǎn)移到葉綠素a[14]。本研究發(fā)現(xiàn)12個(gè)參與光合作用的捕光色素復(fù)合體基因顯著下調(diào)表達(dá)，而且隨著干旱脅迫的持續(xù)增加，發(fā)菜藻藍(lán)素、藻紅素和異藻藍(lán)素含量有所下降，即藻膽素含量總體下降，同時(shí)葉綠素a的含量明顯降低。因此，推測(cè)干旱脅迫致使大部分發(fā)菜光合作用捕光色素復(fù)合體基因下調(diào)表達(dá)，光合色素蛋白減少，捕獲光能的能力減弱，光合作用受到抑制，從而降低發(fā)菜在干旱脅迫條件下光合系統(tǒng)遭受破壞的風(fēng)險(xiǎn)，這也是發(fā)菜適應(yīng)干旱脅迫的一種光保護(hù)調(diào)節(jié)機(jī)制。

類胡蘿卜素具有捕獲光能并將其傳遞給葉綠素的功能[15]。由于干旱脅迫會(huì)導(dǎo)致水稻葉片中水分缺失，細(xì)胞膜被破壞或消失，類囊體膜出現(xiàn)解體，使得葉綠素和類胡蘿卜素含量降低，進(jìn)而影響光合作用的進(jìn)行[16]，而本研究發(fā)現(xiàn)發(fā)菜葉綠素a和類胡蘿卜素含量隨干旱脅迫的增加呈顯著下降趨勢(shì)，暗示干旱脅迫會(huì)使發(fā)菜葉綠素a和類胡蘿卜素合成相關(guān)蛋白(酶)的基因差異表達(dá)，進(jìn)而導(dǎo)致其含量下降而影響光合作用。目前已經(jīng)確認(rèn)，ZDS、crtW和CRTISO基因參與類胡蘿卜素生物合成和分解代謝途徑。ZDS是類胡蘿卜素生物合成途徑上游控制β-胡蘿卜素生成的關(guān)鍵酶，它催化9,9-雙順-β-胡蘿卜素脫氫生成7,9,7,9-四順式-番茄紅素[17]，該酶的活性和表達(dá)量的多少直接決定了β-胡蘿卜素的產(chǎn)量，是調(diào)控β-胡蘿卜素合成量的關(guān)鍵酶。crtW基因編碼crtW型β-胡蘿卜素酮醇酶，β-類胡蘿卜素經(jīng)β-胡蘿卜素酮醇酶催化形成角黃素[18]。CRTISO是催化番茄紅素由順式結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變?yōu)榉词浇Y(jié)構(gòu)的關(guān)鍵異構(gòu)酶[19]，CRTISO的下調(diào)表達(dá)使果實(shí)中β-胡蘿卜素的含量提高[20]，而且CRTISO表達(dá)量的降低抑制了類胡蘿卜素降解反應(yīng)的進(jìn)行，還可能會(huì)導(dǎo)致煙草中類胡蘿卜素的積累[21]。在本研究中，隨著干旱脅迫的增加，ZDS基因顯著下調(diào)，crtW和CRTISO5基因顯著上調(diào)，說(shuō)明這些基因抑制了干旱脅迫下發(fā)菜類胡蘿卜素的增加，導(dǎo)致類胡蘿卜素捕獲光能并將其傳遞給葉綠素的功能減弱，進(jìn)而影響光合速率。

3.2 干旱脅迫對(duì)發(fā)菜光反應(yīng)與卡爾文循環(huán)相關(guān)基因差異表達(dá)的影響

PsaK和PsaB是光系統(tǒng)I中重要的核心蛋白，且在PSⅠ捕光復(fù)合物中起重要作用[22-23]。JIA等[24]發(fā)現(xiàn)在鹽堿脅迫下，海棠中PsaK等6種與光合作用相關(guān)的蛋白顯著上調(diào)，且這些蛋白可以作為PS Ⅰ修復(fù)系統(tǒng)的調(diào)節(jié)劑。而在鎘脅迫下，由于煙草中PsaK和PsaB顯著下調(diào)而使PSⅠ系統(tǒng)受到嚴(yán)重的光抑制作用[25]。PetE和PetJ是光合作用中電子傳遞鏈重要的組成成分，有助于提高光反應(yīng)的電子傳遞效率[26]。有研究發(fā)現(xiàn)雖然PetE基因失活沒(méi)有影響藻細(xì)胞的生長(zhǎng)速率，但影響了光合電子傳遞鏈的氧化還原狀態(tài)[27]。Psb27蛋白是PSⅡ重要的組裝修復(fù)因子之一，它位于PSⅡ核心復(fù)合體的囊腔側(cè)，可使Mn與PSⅡ放氧復(fù)合體OEC更容易結(jié)合[28]。在低溫、高光或干旱等脅迫條件下，對(duì)維持PSⅡ的高效組裝修復(fù)起著重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)，干旱脅迫下發(fā)菜PsaK、PsaB、PetE、PetJ和Psb27均呈上調(diào)表達(dá)，表明干旱脅迫誘導(dǎo)了這些基因的表達(dá)，有利于穩(wěn)定PSⅡ和PSI的結(jié)構(gòu)以免受到干旱脅迫的破壞，且修復(fù)受損的PSⅠ和PSⅡ，穩(wěn)定光合電子傳遞鏈的氧化還原狀態(tài)，為發(fā)菜恢復(fù)吸水后快速進(jìn)入光合作用奠定了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。PsbL參與了PSⅡ中電子轉(zhuǎn)移的調(diào)節(jié)，在PSⅡ電子轉(zhuǎn)移過(guò)程中具有重要作用[29]。另外，PetH是光合電子傳遞鏈上的催化酶，可以將電子從PSⅠ傳遞到NADP+，產(chǎn)生的NADP會(huì)參與到CO2的同化，PetH酶活性的降低會(huì)影響CO2的同化過(guò)程，進(jìn)而影響植物的光合反應(yīng)[30]。有研究發(fā)現(xiàn)高濃度鋅脅迫下，PetH基因顯著上調(diào)，從而維持了正常的電子傳遞效率[31]。但本研究發(fā)現(xiàn)隨著干旱脅迫的增加，PsbL和PetH卻顯著下調(diào)表達(dá)。由于發(fā)菜在持續(xù)失水狀態(tài)下水分的虧缺會(huì)導(dǎo)致光合活性下降[32]，推測(cè)PetH和PsbL基因顯著下調(diào)抑制了光合電子傳遞鏈的活性，導(dǎo)致光合活性維持在較低水平甚至光合作用停止，這與QIU等[33]的結(jié)論一致。

干旱脅迫除了對(duì)發(fā)菜光反應(yīng)過(guò)程有影響外，對(duì)其暗反應(yīng)過(guò)程也產(chǎn)生了影響。Rubisco作為卡爾文循環(huán)的關(guān)鍵酶之一，可催化卡爾文循環(huán)中RUBP與CO2形成兩分子3-磷酸甘油酸(3-PG)[34]。在3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)的催化下三磷酸甘油酸被還原為了三磷酸甘油醛，它不僅是合成核酮糖-5-磷酸的底物，也是光合產(chǎn)物輸出的一種途徑，GAPDH活性水平與卡爾文循環(huán)的運(yùn)轉(zhuǎn)速率有關(guān)[35]。有研究表明，逆境脅迫引起的Rubisco活性下降，并降低核酮糖-1,5-二磷酸和3-磷酸甘油的含量，從而抑制無(wú)機(jī)磷的再生，進(jìn)而影響光合作用[36]。此外，Sen等[37]發(fā)現(xiàn)隨著干旱脅迫的增加，魚(yú)腥藻PCC 7120的Rubisco酶活性下降，從而導(dǎo)致光合活性降低。本研究表明，隨著干旱脅迫的增加，GAPDH的活性呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)，Rubisco活性升高后下降，表明隨著干旱脅迫的增加，這兩種酶活性的下降可能導(dǎo)致光合碳同化效率的降低，進(jìn)而影響發(fā)菜的光合活性。

綜上所述，干旱脅迫下發(fā)菜有113個(gè)光合作用相關(guān)基因發(fā)生了差異表達(dá)，干旱脅迫誘導(dǎo)部分光合相關(guān)基因上調(diào)表達(dá)，而另一些基因下調(diào)表達(dá)，共同調(diào)控發(fā)菜響應(yīng)干旱脅迫，這可能是發(fā)菜應(yīng)對(duì)干旱不利環(huán)境的一種光保護(hù)和光適應(yīng)機(jī)制。研究結(jié)果為深入認(rèn)識(shí)發(fā)菜耐旱的光合機(jī)理奠定了基礎(chǔ)，為后續(xù)發(fā)菜抗性基因的挖掘、篩選以及研究發(fā)菜干旱脅迫響應(yīng)機(jī)制提供了重要的參考價(jià)值。