斑地錦黃烷酮-3-羥化酶基因及啟動(dòng)子的克隆與分析

鐘小菊，吳晴陽，張永康，饒澤昌，王 飛，黃勝和*

(1 江西中醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校 醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)部，江西撫州 344000；2 南昌大學(xué) 撫州醫(yī)學(xué)院，江西撫州 344000)

斑地錦(EuphorbiamaculataL.)是一年生大戟科(Euphorbiaceae)大戟屬(EuphorbiaL.)草本植物，分布于江西、新疆、河南和浙江等地區(qū)[1]，具有清熱解毒、利濕退黃、涼血止血等功效，主治痢疾、泄瀉、尿血、便血、瘡癤癰腫、濕熱黃疸等[2]。斑地錦主要含有黃酮類、萜類、酚酸類和生物堿類等成分，其中槲皮素是主要藥效成分之一[3]。目前，斑地錦研究主要集中在成分分離、藥用價(jià)值以及臨床應(yīng)用等方面[4-5]，分子生物學(xué)相關(guān)研究報(bào)道較少。

槲皮素屬于黃酮類化合物，其生物合成經(jīng)由苯丙烷代謝途徑，而黃烷酮-3-羥化酶(flavanone 3-hydroxylase，F(xiàn)3H)是苯丙烷代謝途徑的關(guān)鍵酶之一，催化柚皮素(naringenin)生成二氫山奈酚(dihydrokaempfero，DHK)。DHK是合成黃酮醇和花青素的重要中間物質(zhì)，阻斷F3H基因的表達(dá)，可導(dǎo)致擬南芥植株體內(nèi)黃酮及花色素等含量變低[6]。目前，F(xiàn)3H基因已在金魚草(AntirrhinummajusL.)[7]、丹參(Salviamiltiorrhiza)[8]和白芨(Bletillastriata)[9]等多種植物[10]中被克隆，但斑地錦F3H基因克隆還未見報(bào)道。該實(shí)驗(yàn)根據(jù)已知的植物F3H基因進(jìn)行序列比對(duì)，在高度保守區(qū)設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，PCR法結(jié)合RACE技術(shù)、熱不對(duì)稱PCR(Tail-PCR)[11]克隆斑地錦F3H基因及其啟動(dòng)子，利用qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)在苗期、花期和果期不同組織中的表達(dá)情況，為進(jìn)一步研究斑地錦F3H基因表達(dá)調(diào)控和完善斑地錦槲皮素生物合成途徑提供便利條件。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)植株采集于江西中醫(yī)藥高等專科學(xué)校實(shí)驗(yàn)田，經(jīng)江西中醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校藥學(xué)系中藥教研室鑒定為斑地錦(EuphorbiamaculataL.)。分別采集苗期(未開花)、花期(開3朵以上的花且未結(jié)果)和果期(結(jié)3個(gè)以上的果)等的根、莖、葉以及果期的果實(shí)，樣品采集后立即置-80 ℃冰箱備用。

1.2 主要試劑與儀器

植物總RNA提取試劑盒(Spin Column Plant Total RNA Purification Kit)、基因組DNA抽提試劑盒(Spin Column Plant Genomic DNA Purification Kit)、質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒(SanPrep柱式)、膠回收試劑盒(SanPrep Column DNA Gel Extraction Kit)、引物合成、測(cè)序等，生工生物工程(上海)股份有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimeScript RT Reagent Kit with gDNA Eraser)、熒光定量PCR試劑盒(PrimeScript RT Master Mix)等，寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司；Pfu酶(TransStart FastPfu DNA Polymerase)、Taq酶、Marker(Trans2K?Plus Ⅱ DNA Marker)、T-載體(pEASY-Blunt Simple Cloning Kit)等，北京全式金生物技術(shù)有限公司。該實(shí)驗(yàn)所用引物見表1。

表1 實(shí)驗(yàn)所使用的引物

普通PCR儀(S1000TMThermal Cycler)、熒光定量PCR儀(CFX96 Real-Time)等，美國(guó)Bio-Rad公司；超微量分光光度計(jì)(NanoDrop One)，美國(guó)Thermo Scientific公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 總RNA提取、cDNA合成和DNA的提取斑地錦總RNA提取、DNA提取和cDNA合成均按試劑盒說明書進(jìn)行?？俁NA提取后經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA質(zhì)量，超微量分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度。

1.3.2F3H基因片段的獲得在GenBank中查找麻風(fēng)樹(JatrophacurcasL.)、非洲菊(GerberajamesoniiBolus)和烏桕(Triadicasebifera)等植物的F3H基因序列，比對(duì)找出高度保守區(qū)，Primer Premier5.0軟件設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物F3H-ZF和F3H-ZR，以引物FZL-1對(duì)總RNA反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，PCR擴(kuò)增斑地錦F3H基因保守序列。反應(yīng)體系(25 μL)：5×GC緩沖液5 μL，dNTPs 2 μL，F(xiàn)3H-ZF、F3H-ZR各2 μL，cDNA模板2 μL，Pfu酶0.3 μL，滅菌超純水11.7 μL。反應(yīng)程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min。PCR產(chǎn)物電泳后膠回收試劑盒回收，連T-載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)，菌液PCR篩選陽性后送測(cè)序。

1.3.3F3H基因ORF區(qū)的獲得根據(jù)保守序列測(cè)序結(jié)果設(shè)計(jì)正向特異引物F3H-XF，根據(jù)反轉(zhuǎn)錄引物FZL-1設(shè)計(jì)反向引物F3H-3R，進(jìn)行3′-RACE。反應(yīng)體系(25 μL)：5×GC緩沖液5 μL，dNTPs 2 μL，F(xiàn)3H-XF、F3H-3R各1 μL，cDNA模板1 μL，Pfu酶0.3 μL，滅菌超純水14.7 μL。反應(yīng)程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min。PCR產(chǎn)物電泳后膠回收測(cè)序。

根據(jù)保守序列測(cè)序結(jié)果設(shè)計(jì)特異引物F3H-

SR1、F3H-SR2、F3H-SR3，與隨機(jī)引物ADF1/ADF2/ADF3/ADF4，以及引物ADF0進(jìn)行Tail-PCR擴(kuò)增F3H基因5′端。Tail-PCR第一輪PCR，反應(yīng)體系(25 μL)：10×緩沖液2.5 μL，dNTPs 2 μL，ADF1(/ADF2/ADF3/ADF4)2 μL，F(xiàn)3H-SR1 1 μL，基因組DNA模板1 μL，Taq酶0.3 μL，滅菌超純水16.2 μL。第二輪PCR反應(yīng)體系(25 μL)：10×緩沖液2.5 μL，dNTPs 2 μL，ADF0、F3H-SR2各1 μL，稀釋100倍的第一輪PCR產(chǎn)物1 μL，Taq酶0.3 μL，滅菌超純水17.2 μL。第三輪PCR反應(yīng)體系(25 μL)：10×緩沖液2.5 μL，dNTPs 2 μL，ADF0、F3H-SR3各1 μL，稀釋100倍的第二輪PCR產(chǎn)物1 μL，Taq酶0.3 μL，滅菌超純水17.2 μL。Tail-PCR反應(yīng)程序見文獻(xiàn)[11]。根據(jù)第二輪和第三輪PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果選擇長(zhǎng)度合適的條帶進(jìn)行膠回收測(cè)序。

將所獲得的F3H保守序列、5′端序列和3′端序列用DNAstar軟件拼接，結(jié)合GenBank中的blast結(jié)果，獲得ORF區(qū)序列，設(shè)計(jì)特異引物F3H-CF、F3H-CR，用Pfu酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增并送測(cè)序。

1.3.4 生物信息學(xué)分析F3H蛋白的理化性質(zhì)預(yù)測(cè)采用ExPASy Proteomics Server提供的在線工具Protparam (https://web.expasy.org/protparam/)，NCBI的 conserved domain database(https://www.ncbi.nlm.nih. gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)預(yù)測(cè)蛋白保守結(jié)構(gòu)域。TMHMM 2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM)進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)，Phyre2 (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi?id=index)進(jìn)行結(jié)構(gòu)域三維建模[12]，NCBI中的Distance tree of results(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹分析。

1.3.5F3H基因不同生長(zhǎng)期組織表達(dá)差異分析根據(jù)F3H基因ORF區(qū)序列設(shè)計(jì)熒光定量PCR引物F3H-qF、F3H-qR，分別提取斑地錦苗期、花期和果期的根、莖、葉以及果實(shí)的總RNA，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳和超微量分光光度計(jì)檢測(cè)后，反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，以UBQ為內(nèi)參基因[13]，進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系(20 μL)：2×TB Green Premix Ex Taq(TliRNaseH Plus)10 μL，上下游引物各0.4 μL，cDNA模板2 μL，滅菌水7.2 μL；擴(kuò)增條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，53 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)；每個(gè)反應(yīng)體系重復(fù)3次。利用Excel分析處理實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.3.6F3H基因啟動(dòng)子序列的獲得與分析根據(jù)5′端序列設(shè)計(jì)特異引物F3H-SR4、F3H-SR5、F3H-SR6，以基因組DNA為模板，采用Tail-PCR進(jìn)行染色體步移，擴(kuò)增EmF3H基因的啟動(dòng)子，反應(yīng)體系和反應(yīng)程序與1.3.3相同。根據(jù)Tail-PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果設(shè)計(jì)特異引物F3H-PF、F3H-PR，用Pfu酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增并送測(cè)序。序列分別用Plantcare(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)和PLACE(https://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/?action=newplace)分析序列特征。

2 結(jié)果與分析

2.1 斑地錦F3H基因的克隆

試劑盒提取斑地錦總RNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)質(zhì)量良好(圖1)。由圖1可知，同源克隆法設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物F3H-ZF和F3H-ZR，PCR獲得預(yù)期510 bp左右的斑地錦F3H基因保守序列，3′-RACE法得到約530 bp的3′端序列；Tail-PCR進(jìn)行染色體步移，第三輪產(chǎn)物比第二輪產(chǎn)物小120 bp左右，將第三輪產(chǎn)物測(cè)序獲得保守序列上游約2 000 bp，其中包含基因5′端序列；將保守序列、3′端序列、5′端序列用DNASTAR軟件進(jìn)行組裝，根據(jù)組裝結(jié)果設(shè)計(jì)特異引物F3H-CF和F3H-CR擴(kuò)增ORF區(qū)。測(cè)序結(jié)果顯示，斑地錦F3H基因ORF區(qū)包含1 092 bp，編碼364個(gè)氨基酸，其中氨基酸序列與油桐(Verniciafordii)、烏桕(Triadicasebifera)的序列相似性高達(dá)85.5%、85.4%。將此基因命名為EmF3H， GenBank登錄號(hào)為MW767838。

M. Trans2K? Plus Ⅱ；1.總RNA；2.保守序列；3.3′-RACE；4-5.5′-Tail第二、三輪產(chǎn)物；6.ORF 圖1 EmF3H基因的克隆M. Trans2K? Plus Ⅱ; 1. Total RNA; 2. Conserved sequence; 3. 3′-RACE; 4-5. The second and third round products of 5′-Tail-PCR; 6. ORFFig.1 Cloning of EmF3H

2.2 EmF3H的生物信息學(xué)分析

用在線工具Protparam分析斑地錦F3H蛋白的理化性質(zhì)，等電點(diǎn)(pI)為5.47，相對(duì)分子質(zhì)量為40.93 KDa，不穩(wěn)定系數(shù)47.89，脂肪指數(shù)為86.54，平均親水性為-0.371，表明EmF3H為相對(duì)穩(wěn)定的疏水性蛋白。保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)顯示該蛋白屬于2-酮戊二酸鐵依賴的雙加氧酶(2-oxoglutarate/iron-dependent dioxygenase，2-ODD)超家族，與其他植物F3H的保守結(jié)構(gòu)域相似。TMHMM 2.0預(yù)測(cè)EmF3H不含跨膜區(qū)域。Phyre三維建模結(jié)果見圖2，以克拉維胺合成酶(Clavaminate synthase，PDB ID：d1gp6a)的晶體三維結(jié)構(gòu)為模板建模，三維模型覆蓋率為91%，序列的一致性為31%。利用NCBI在線BLAST工具將F3H 與GenBank 中其他植物F3H蛋白進(jìn)行比對(duì)，選擇相似性最高的17種F3H蛋白，用Distance tree of results中的Neighbor Joining法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖3)，不同物種來源的F3H蛋白在進(jìn)化上歸屬不同的分支，類似于蔓花生、大花懸鈴果的F3H，EmF3H也為相對(duì)獨(dú)立的一個(gè)分支。

圖2 EmF3H蛋白三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.2 The deduced three-dimensional structure of EmF3H

圖3 EmF3H和其他F3H蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.3 Phylogenetic tree analysis of EmF3H protein and other plant F3H proteins

2.3 EmF3H基因在不同生長(zhǎng)期組織表達(dá)模式

分別提取斑地錦不同生長(zhǎng)期(苗期、花期、果期)根、莖、葉、果的總RNA，以UBQ為內(nèi)參基因，進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增。結(jié)果顯示，EmF3H在不同生長(zhǎng)期各組織中均有表達(dá)，但表達(dá)量有顯著差異，其中花期的根和果期的果實(shí)中表達(dá)量最高，其次為苗期的根和果期的根、莖，在各生長(zhǎng)期的葉、苗期的莖和花期的莖內(nèi)表達(dá)水平較低(圖4)。另外，在莖中隨生長(zhǎng)期表達(dá)有不斷增強(qiáng)的趨勢(shì)，在根內(nèi)表達(dá)量先上調(diào)后下降。

2.4 EmF3H基因啟動(dòng)子序列的獲得與分析

以斑地錦基因組DNA為模板，Tail-PCR法進(jìn)行染色體步移(圖5)，將第三輪約2 000 bp的PCR產(chǎn)物膠回收后連接T-載體測(cè)序。根據(jù)測(cè)序結(jié)果設(shè)計(jì)特異引物F3H-PF、F3H-PR，Pfu酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增并送測(cè)序，結(jié)果獲得約1 604 bp的EmF3H啟動(dòng)子序列，用Plantcare和PLACE分析顯示內(nèi)含TATA-box、CAAT-box等基本啟動(dòng)子序列，也含有Box 4(ATTAAT)、G-Box(CACGTG)、GATA-motif(AAGATAAGATT)、AE-box(AGAAACAA)、I-box(TGATAATGT)、TCT-motif(TCTTAC)等光反應(yīng)元件，LTR(CCGAAA)低溫反應(yīng)元件，TC-rich repeats(GTTTTCTTAC)應(yīng)激反應(yīng)元件，circadian(CAAAGATATC)晝夜節(jié)律調(diào)控元件和ABRE(ABA反應(yīng)元件)、P-box(GAs反應(yīng)元件)、TGA-element(生長(zhǎng)素反應(yīng)元件)等激素反應(yīng)元件。

不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)圖4 不同生長(zhǎng)期不同組織中EmF3H的相對(duì)表達(dá)量Different normal letters indicate significant difference at 0.05 level (P<0.05)Fig.4 The relative expression levels of EmF3H from different tissues in different growth stages

M. Trans2K? Plus Ⅱ；1.啟動(dòng)子；2-3.Tail-PCR第二、三輪產(chǎn)物圖5 EmF3H基因啟動(dòng)子的克隆M. Trans2K? Plus Ⅱ; 1. EmF3H promoter; 2-3. The second and third rounds products of Tail-PCRFig.5 Cloning of EmF3H promoter

3 討 論

苯丙烷代謝途徑是植物重要的次生代謝途徑之一，該途徑以苯丙氨酸為底物，先后在苯丙氨酸解氨酶(PAL)、肉桂酸-4-羥化酶(C4H)、4-香豆酰-CoA連接酶(4CL)、查爾酮合成酶(CHS)、查爾酮異構(gòu)酶(CHI)、黃烷酮-3-羥化酶(F3H)、類黃酮-3′-羥化酶(F3′H)、黃酮醇合成酶(FLS)等一系列酶的催化作用下，合成黃酮類、木質(zhì)素及花青素等多種次生代謝產(chǎn)物[14-15]，而F3H是其中的關(guān)鍵酶之一，催化柚皮素生成二氫山奈酚。F3H的克隆與功能研究已有一些報(bào)道[7-10]，煙草中超表達(dá)枸杞LcF3H提高了黃烷-3-醇的含量和對(duì)干旱脅迫的耐受性[16]；轉(zhuǎn)基因高粱胚軸中，SbF3H將部分碳流轉(zhuǎn)移到了3-羥基黃酮的生產(chǎn)上[17]。

該研究從斑地錦中克隆了一個(gè)F3H基因編碼區(qū)及其啟動(dòng)子。蛋白質(zhì)EmF3H與油桐VfF3H、烏桕TsF3H的序列相似性分別為85.5%、85.4%，初步證明EmF3H屬于F3H基因家族，氨基酸序列聚類分析結(jié)果表明其為相對(duì)獨(dú)立的一個(gè)分支，說明EmF3H在進(jìn)化上有明顯的種屬特性。研究表明F3H基因在不同植物不同生長(zhǎng)期和不同組織中表達(dá)水平有差異，檸條錦雞兒CkF3H在根、莖和葉中均有表達(dá)，沒有組織特異性[18]，而茶菊CmF3H在花中表達(dá)量最高，其次為莖、葉，根中表達(dá)量最低[10]；EmF3H在花期的根和果期的果實(shí)中表達(dá)量最高，隨著植物的生長(zhǎng)，表達(dá)量在莖中逐漸上升，在葉內(nèi)一直較低，說明該基因表達(dá)在斑地錦中存在組織特異性，同時(shí)預(yù)示著F3H可能參與多種物質(zhì)的生物合成，且在不同植物中功能側(cè)重點(diǎn)不同，其具體功能有待于進(jìn)一步挖掘。在EmF3H啟動(dòng)子序列內(nèi)預(yù)測(cè)有TAAT-box等基本啟動(dòng)子序列和光反應(yīng)元件、應(yīng)激反應(yīng)元件、激素反應(yīng)元件等，表明EmF3H可能參與脅迫應(yīng)答，但是否能夠響應(yīng)不同脅迫，進(jìn)而影響槲皮素等黃酮類化合物的合成，還需進(jìn)一步研究基因表達(dá)調(diào)控。因此，該研究結(jié)果豐富了F3H基因資源，也對(duì)探討斑地錦苯丙烷類次生代謝途徑(包括黃酮類化合物生物合成途徑)奠定了一定的基礎(chǔ)。