百合LbCAT和LbGPX基因的克隆與表達分析

遲博文，劉 立，謝 天，閻俊卉，趙子賢，文錦芬

(昆明理工大學 建筑與城市規(guī)劃學院，昆明 650500)

過氧化氫酶 (catalases，CAT) 是一種含有亞鐵血紅素的四聚體催化酶，作為抗氧化酶系統(tǒng)中重要的一員，在過氧化物酶體中將H2O2分解成H2O和O2[1]。CAT在植物逆境、衰老以及生長發(fā)育等過程中起著關(guān)鍵作用[2]。研究表明擬南芥中AtCAT1參與消除各種脅迫產(chǎn)生的 H2O2[3]。在桃樹葉片也觀察到中度干旱脅迫誘導CAT、SOD和GR等抗氧化酶活性呈上升趨勢[4]。不僅干旱、高鹽、重金屬等非生物脅迫都可以影響CAT基因的表達[5-7]，而且過表達該基因可以提高植物抗性[8-9]。

在植物抗氧化酶系統(tǒng)中另一個重要的成員是谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GPX)[10]，屬于非血紅素硫醇過氧化物酶，通過催化還原型谷胱甘肽(GSH)轉(zhuǎn)化為氧化型谷胱甘肽(GSSG)，使H2O2分解進而保護植物[11]。擬南芥中有8個GPX基因，對不同的非生物性脅迫均有應答[12]。在番茄中表達LePHGPX基因明顯增強了其對鹽、高溫等非生物脅迫的耐受性[13]。

百合(Liliumbrowniivar.viridulum)為百合科(Liliaceae)百合屬(Lilium)多年生單子葉草本球根類植物，主要分布在北半球的溫帶與寒帶地區(qū)[14]。百合不僅有很好的觀賞性，還能作為食材、藥材，具有極好的市場前景。中國百合切花種植面積約為933.33 hm2，主要集中在云南，每年增幅在20%以上，昆明是中國百合切花種植面積最大且質(zhì)量最好的產(chǎn)地之一[15-16]。但切花百合在采后及隨后的長距離干運輸中均會受到失水脅迫，從而可能導致花的畸形及早衰；因此，對于百合抗性基因資源的深入研究，并且從分子生物技術(shù)層面增強其抗逆性具有極重要的意義。本研究從百合中分別克隆了1個CAT基因和1個GPX基因，進行生物信息學分析，并對這2個基因在百合的不同器官、花蕾不同發(fā)育時期、PEG模擬干旱處理及獨角金內(nèi)酯(SLs)處理下的表達進行了分析，為進一步研究百合中這2個基因的作用機制提供理論基礎。

1 材料和方法

1.1 實驗材料和材料處理

實驗材料為‘卡瓦納’紅色香水切花百合。在研究百合花蕾生長發(fā)育過程中基因的表達情況時，將百合花蕾劃分為5個階段取材?，F(xiàn)蕾期：植株剛開始出現(xiàn)花蕾；綠蕾期：植株開始出現(xiàn)大部分花蕾，并且整個花蕾呈現(xiàn)為綠色；紅蕾期：植株的所有花蕾都會變成紅色，花蕾蓬松、不緊實，花瓣剛剛開始彼此分離但尚未完全開放；開花期：植株的花瓣都已經(jīng)完全開放，花瓣顏色最鮮艷，具有典型的百合花冠花瓣形狀和顏色特點；枯萎期：植株部分花瓣開始枯萎。

(1)取盆花百合的不同器官(根、鱗莖、葉和花)和不同發(fā)育期花蕾(其中包括綠蕾期、紅蕾期、開花期和枯萎期)的花瓣，取材后立即置于液氮中，然后保存在-80 ℃的超低溫冰箱中備用。

(2)實驗挑選花莖長而挺直，處于開花期、花蕾直徑約8～9 cm的百合切花，分別置于蒸餾水(CK)、10%PEG-6000培養(yǎng)液(PEG)和5 μmol/L SLs+10% PEG-6000培養(yǎng)液(PEG+SLs)中處理。分別在0 d、1 d、3 d、5 d收集花瓣樣品，立即液氮速凍并于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方 法

1.2.1 RNA提取和cDNA第一鏈合成百合RNA使用trizol法提取[17]，cDNA鏈合成用賽默飛世爾公司(RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit)試劑盒，參照說明書的步驟進行。

1.2.2 基因克隆根據(jù)前期轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果和在NCBI上的同源比對，用Primer5.0軟件設計引物序列，引物序列見表1。PCR擴增用大連寶生物公司Taq酶(TaKaRa TaqTM)。PCR反應程序：94 ℃預變性5 min，94 ℃變性30 s，退火30 s(退火溫度分別為55和53 ℃)，72 ℃延伸1 min，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。將PCR產(chǎn)物送生物公司測序。

表1 基因克隆和qRT-PCR的引物序列

1.2.3 序列分析用NCBI網(wǎng)站(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov)中的ORF Finder(https://blast.ncbi.nlm. nih.gov/orffinder)找出基因的開放式閱讀框架(Open reading frame；ORF)和用NCBI網(wǎng)站(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)的Blastp功能，對序列進行同源性和保守結(jié)構(gòu)域分析。用生物學軟件DNAMAN7.0 以及ClustalX2.0.11對核酸進行翻譯和多序列比對。用MEGA7.0軟件的Neighbor-joining(NJ)計算方法，進行進化樹的系統(tǒng)構(gòu)建與應用分析。

1.2.4 qRT-PCR分析根據(jù)克隆結(jié)果設計引物，內(nèi)參基因為Lbaction，引物序列見表1。實時熒光定量PCR使用愛必夢生物科技有限公司的qRT-PCR熒光定量試劑盒(EvaGreen 2X qPCR MasterMix)。反應體系為：10 μL EvaGreen 2× qPCR MasterMix，0.6 μLLbCAT(LbGPX)-qF與0.6 μLLbCAT(LbGPX)-qR，2 μL cDNA模板，加6.8 μL dd H2O至20 μL體系。qRT-PCR反應條件為：95 ℃預變性 10 min，95 ℃變性15 s，退火 60 s(退火溫度分別為59和60 ℃)，60 ℃延伸 60 s，40個循環(huán)。在Bio-Rad CFX96 Optics Module系統(tǒng)上進行反應。每個材料進行3次或多次獨立重復。利用2-ΔΔCT算法計算相對表達量，用SPSS進行顯著性分析和 SigmaPlot12.5軟件作圖。

M. DL2000；1. LbCAT；2. LbGPX圖1 百合LbCAT和LbGPX基因PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.1 The electrophoretic map of PCR products of LbCAT and LbGPX in lily

2 結(jié)果與分析

2.1 百合LbCAT和LbGPX基因克隆

以百合cDNA為模板，用RT-PCR方法對LbCAT和LbGPX進行特異性引物擴增，分別得到大約1 500和 500 bp的產(chǎn)物(圖1)。利用軟件ORF finder進行分析LbCAT和LbGPX基因編碼的氨基酸序列，其完整的ORF分別為1 479和519 bp，編碼的蛋白大小分別為492和172個氨基酸(圖2)。

圖2 LbCAT(A)和LbGPX(B)全長序列及其推導的氨基酸序列Fig.2 Nucleotides and deduced amino acid sequences of LbCAT (A) and LbGPX (B)

2.2 同源和進化分析

通過NCBI Blast序列比對后發(fā)現(xiàn)，LbCAT與岷江百合(Liliumregale)ART33464.1序列相似性最高，為99.19%，與大部分植物序列相似性為77%～99%(圖3，A)。LbGPX與油棕(Elaeisguineensis)XP_010938757.1序列相似性最高，為78.61%，與大部分植物序列相似性為67%～78%(圖3，B)。LbGPX和LbCAT基因與不同種類植物序列相似性較高說明這2個基因在進化中保守度較高。

用MEGA7.0軟件對LbCAT和LbGPX氨基酸序列和其他植物的CAT和GPX進行分析，兩種基因都具有顯著的種屬特征，進化符合植物分類學分類(圖4)。整個系統(tǒng)發(fā)育樹存在兩個大分支，其中LbCAT與同科植物的親緣關(guān)系最近，其次是鐵皮石斛和小蘭嶼蝴蝶蘭等其他科植物相對較近，與大麥和紫花針茅等的親緣關(guān)系最遠(圖4，A)。而對LbGPX分析結(jié)果顯示，整個系統(tǒng)發(fā)育進化樹存在兩個分支，LbGPX與油棕親緣關(guān)系最近，與紅梅和水蜜桃等種屬關(guān)系最遠(圖4，B)。

A：XP_020092953. 菠蘿；XP_020702876. 石斛蘭；ART33464. 百合；XP_008791900. 海棗；NP_001306842. 油棕；B：XP_010938757. 油棕；XP_010524011. 醉蝶花；XP_020108868. 菠蘿；XP_020267646. 蘆筍；XP_020685583. 鏈狀石斛圖3 LbCAT(A)和LbGPX(B)分別與不同物種CAT和GPX蛋白氨基酸序列比對A： XP_020092953. Ananas comosus; XP_020702876. Dendrobium catenatum; ART33464. Lilium regale; XP_008791900. Phoenix dactylifera; NP_001306842. Elaeis guineensis; B： XP_010938757. Elaeis guineensis; XP_010524011. Tarenaya hassleriana; XP_020108868. Ananas comosus; XP_020267646. Asparagus officinalis; XP_020685583. Dendrobium catenatumFig.3 Multiple alignment of LbCAT (A) and LbGPX (B) with those of other species

圖4 LbCAT(A)和LbGPX(B)蛋白系統(tǒng)進化分析Fig.4 Phylogenetic analysis of LbCAT (A) and LbGPX (B)

2.3 LbCAT和 LbGPX表達分析

2.3.1LbCAT和LbGPX器官和花蕾不同時期的表達分析以Lbactin作為內(nèi)參，對LbCAT和LbGPX在百合不同器官和花蕾不同發(fā)育階段的表達情況進行qRT-PCR分析。結(jié)果表明，LbCAT基因在根、鱗莖、葉和花中都有表達，其中在葉片中的表達最高，根次之。LbGPX在百合的各器官中也均有表達，其中在花中的表達量最高，為鱗莖中表達量的40倍左右(P<0.01)(圖5, A)。

* 、**分別表示同一基因在不同器官相對鱗莖(同一基因在不同花蕾發(fā)育階段相對綠蕾期)的表達差異顯著或極顯著圖5 百合不同組織(A)和花蕾不同發(fā)育階段(B)中LbCAT和LbGPX的表達* and ** stand for the same gene’s expression level in different organ is significantly different relative to the bulb’s (the same gene’s expression level at different bud development stage) at 0.05 and 0.01 levelFig.5 Expression levels of LbCAT and LbGPX in different organs (A) and different bud development stages (B) of Lily

* 、**分別表示同一時期不同處理與對照差異顯著或極顯著圖6 LbCAT (A)和LbGPX (B)在不同處理下的表達* and ** stand for the gene’s expression level in different treatments is significantly different relative to the control’s on the same time at 0.05 and 0.01 levelFig.6 Expression levels of LbCAT (A) and LbGPX (B) under different treatments

在花蕾的不同生長發(fā)育階段(圖5, B)，LbCAT和LbGPX都有表達，其中LbCAT在枯萎期表達量最高，約為綠蕾期表達量的8倍左右，差異極顯著(P<0.01)。LbGPX的表達水平則隨著花蕾的發(fā)育，總體呈現(xiàn)增長的趨勢(圖5,B)。

2.3.2 SLs對PEG處理下百合切花LbCAT和LbGPX表達的影響LbCAT和LbGPX基因在不同處理下的表達情況如圖6所示。LbCAT表達在第1天最高。PEG處理下LbCAT基因的表達量第1天約為CK的5倍；但SLs+PEG處理的表達量卻顯著低于PEG處理組，表明SLs處理降低了LbCAT的轉(zhuǎn)錄水平(圖6，A)。

不同處理下，LbGPX表達量呈先上升后下降的趨勢。在PEG處理下，LbGPX的表達量在第3天達到了峰值，約為CK組的4倍；在PEG+ SLs處理下LbGPX的表達量低于PEG處理(圖6，B)。

3 討 論

本研究通過RT-PCR從百合中分別克隆了LbCAT和LbGPX基因，氨基酸序列比對結(jié)果表明兩種基因在進化中高度保守。qRT-PCR定量分析結(jié)果說明，LbCAT和LbGPX在百合不同器官中表達都有特異性，其中分別以在葉片和花中的表達量最高；而在花蕾的不同發(fā)育階段，兩個基因表達量均隨花蕾的發(fā)育而增加。在橡膠中的研究結(jié)果表明HbCAT2隨著橡膠樹的發(fā)育其表達量逐漸升高[18]，而在香蕉的研究中發(fā)現(xiàn)MaGPX在其花中的表達情況與LbGPX一致[19]；這種抗氧化酶基因的器官表達差異,可能與不同的器官中活性氧分布的差異有關(guān)聯(lián)[20-22]。

進一步用PEG模擬干旱處理百合切花發(fā)現(xiàn)，LbCAT和LbGPX的表達在經(jīng)過PEG處理后表現(xiàn)出明顯的上調(diào)。有研究發(fā)現(xiàn)水稻葉片組織中的OsCATB基因轉(zhuǎn)錄水平能夠在受到嚴重干旱脅迫時升高[23]；而在對木薯的研究中也觀察到4個木薯栽培種中有3個在干旱誘導下，CAT轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)[24]。

此外，在香蕉、野生近緣種小麥和桑樹中也發(fā)現(xiàn)GPX基因在干旱脅迫下表達上調(diào)[20，25-26]。因此，干旱脅迫誘導CAT和GPX表達上調(diào)似乎是植物的普遍反應。

已有文獻報道表明，SLs能有效提高植物的抗逆性，如SLs能增強鼠尾草中抗鹽脅迫的能力[26]，提高羽扇豆幼苗在熱脅迫下抗氧化系統(tǒng)和乙二醛酶系統(tǒng)的活性而減輕對種子萌發(fā)和光系統(tǒng)Ⅱ功能的不利影響[27]；但本研究發(fā)現(xiàn)，在轉(zhuǎn)錄水平SLs并不能提高LbCAT和LbGPX的表達，這與Parisa Sharifi等在鼠尾草中發(fā)現(xiàn)SLs不能提高抗氧化酶活性似乎是一致的[26]。導致這些結(jié)果的差異一方面可能是因為物種的不同，另一方面在逆境脅迫下SLs可能在不同的水平調(diào)控植物的抗逆性。

本研究結(jié)果表明，LbCAT和LbGPX基因在百合中參與了對百合不同器官和花蕾生長發(fā)育的調(diào)控，以及對水分脅迫的應答。后續(xù)對這2個基因的研究主要是通過基因的過表達和沉默進行功能驗證，以及克隆啟動子及短截實驗研究它們的調(diào)控位點。百合花蕾是百合全株最具觀賞價值的部位，目前關(guān)于調(diào)控百合抗逆機制的研究較少，本研究為更有效了解百合的抗逆機制和進一步改善百合鮮切花瓶插壽命和培育抗性品種提供了理論基礎。