海島棉GbHCT13基因的功能驗(yàn)證

滕 露，鄭 凱，曲延英，陳全家

(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院/農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊 830052)

棉花為錦葵科(Malvaceae)棉屬(Gossypium)植物的種籽纖維，是世界性重要經(jīng)濟(jì)作物。世界主要棉產(chǎn)國(guó)有中國(guó)、美國(guó)、印度和巴基斯坦及中亞地區(qū)，主要栽培品種為陸地棉。在新中國(guó)成立70年以來(lái)的生產(chǎn)實(shí)踐中，棉花生產(chǎn)取得的長(zhǎng)足進(jìn)步為實(shí)現(xiàn)國(guó)家富強(qiáng)、改善和提高人民生活水平做出了巨大貢獻(xiàn)。依靠科技進(jìn)步實(shí)現(xiàn)棉花生產(chǎn)的可持續(xù)發(fā)展尤為重要[1]。中國(guó)是世界上主要棉花生產(chǎn)和消費(fèi)國(guó)之一，棉纖維作為其主要產(chǎn)品而倍受關(guān)注。然而，廣泛種植的陸地棉其纖維品質(zhì)較差，不能滿足現(xiàn)代紡織工業(yè)對(duì)原棉多樣性的要求[2]，高品質(zhì)棉纖維仍需進(jìn)口，成為制約棉花相關(guān)產(chǎn)業(yè)發(fā)展的瓶頸之一。故改良纖維品質(zhì)已成為棉花育種行業(yè)的主要目標(biāo)。而海島棉纖維品質(zhì)優(yōu)良，研究其纖維發(fā)育相關(guān)基因，用以改善纖維品質(zhì)并滿足生產(chǎn)需求具有重要理論意義和應(yīng)用價(jià)值。

目前廣泛認(rèn)同的棉纖維發(fā)育模式是由Jasdanwala于1977年提出的纖維起始、伸長(zhǎng)、次生壁加厚和脫水成熟4個(gè)時(shí)期[3]，該時(shí)期的確定對(duì)后來(lái)纖維的發(fā)育調(diào)控研究具有重要指導(dǎo)意義[4]。棉花纖維發(fā)育是一個(gè)高度程序化的過(guò)程，期間經(jīng)歷多種化學(xué)物質(zhì)的復(fù)雜生理生化變化。該歷程也受到多種基因的調(diào)控[5-6]，纖維發(fā)育的4個(gè)時(shí)期沒(méi)有明顯的分界線又互相交疊，并且這種現(xiàn)象在品種間也存在差異。棉花纖維與人民生活緊密相關(guān)，纖維品質(zhì)的優(yōu)劣對(duì)于農(nóng)業(yè)工業(yè)生產(chǎn)也影響巨大[7]，故研究棉花纖維發(fā)育的分子機(jī)制具有重要的生物學(xué)意義以及實(shí)踐生產(chǎn)價(jià)值。木質(zhì)素是苯丙烷代謝途徑的重要產(chǎn)物之一[8]，是進(jìn)行植物體物質(zhì)運(yùn)輸?shù)闹匾獔?chǎng)所，被稱為植物生理學(xué)的支柱[9]。其合成過(guò)程需要大量酶的參與，這些合成酶在植物不同組織中存在表達(dá)差異[10]，其中HCT基因位于合成木質(zhì)素途徑中的上游位置，是G/S木質(zhì)素單體合成的主要控制基因，因此可以通過(guò)調(diào)控HCT基因來(lái)實(shí)現(xiàn)木質(zhì)素單體的生物轉(zhuǎn)化，從而達(dá)到改變植物木質(zhì)素單體組成以及降低木質(zhì)素含量的目的。HCT基因在木質(zhì)素合成過(guò)程研究得較晚，隨著研究深入，該基因越來(lái)越受到重視。轉(zhuǎn)HCT的楊樹(shù)莖桿木質(zhì)部細(xì)胞發(fā)生形態(tài)結(jié)構(gòu)改變，細(xì)胞壁薄而中腔增大，纖維絲排列方向改變[11]；下調(diào)HCT引起植株木纖維細(xì)胞和導(dǎo)管分子細(xì)胞顯著減小[12]；前人通過(guò)沉默煙草中HCT探究該基因?qū)χ仓昴举|(zhì)化的影響發(fā)現(xiàn)，HCT蛋白在煙草莖稈中的活性較根和其他組織高，主要分布在木質(zhì)化組織中，證實(shí)了HCT抑制對(duì)木質(zhì)素合成有直接影響，其中莖稈和根組織中最幼嫩的組織受影響最大[13]。進(jìn)一步研究了HCT基因沉默對(duì)木質(zhì)素結(jié)構(gòu)的影響發(fā)現(xiàn)，沉默植物木質(zhì)素結(jié)構(gòu)的變化主要是S單元的減少和H單元的增加，表明HCT在不同木質(zhì)素單體轉(zhuǎn)化之間的作用。對(duì)成熟棉纖維中的木質(zhì)素含量測(cè)定發(fā)現(xiàn)，不同發(fā)育時(shí)期單位棉鈴纖維的木質(zhì)素含量變化具有一定規(guī)律性，木質(zhì)素會(huì)隨著發(fā)育時(shí)期的變化逐步增加，同時(shí)在纖維的超微結(jié)構(gòu)中，次生壁加厚也具有相同的趨勢(shì)，即木質(zhì)素積累的變化與纖維素的沉積具有相同的趨勢(shì)[14]。范玲等[15]通過(guò)多種研究方法證實(shí)了棉花纖維發(fā)育過(guò)程中存在苯丙烷代謝途徑，并且證實(shí)了該代謝途徑的中間產(chǎn)物與細(xì)胞壁相關(guān)。棉纖維細(xì)胞壁的組分含量，直接關(guān)系到棉花纖維的品質(zhì)和產(chǎn)量。因此，了解棉纖維發(fā)育過(guò)程及該過(guò)程中纖維細(xì)胞壁組分的變化對(duì)于正確認(rèn)識(shí)棉纖維品質(zhì)形成的分子生物學(xué)基礎(chǔ)有著重要的意義。

本研究通過(guò)克隆海島棉HCT基因，并構(gòu)建過(guò)表達(dá)和基因沉默載體轉(zhuǎn)化擬南芥和棉花，觀察轉(zhuǎn)基因植株的表型并測(cè)定相關(guān)指標(biāo)，進(jìn)而分析HCT基因在棉花纖維發(fā)育中的表達(dá)情況，為了探索苯丙烷類化合物對(duì)發(fā)育中的棉纖維的影響，進(jìn)一步檢測(cè)該途徑中關(guān)鍵基因在纖維中的表達(dá)情況，對(duì)研究纖維發(fā)育相關(guān)基因的作用及其分子機(jī)制奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材 料

本實(shí)驗(yàn)材料為海島棉‘新海21’、陸地棉ND203和哥倫比亞野生型擬南芥(col)，種子均保存于新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。本研究所用大腸桿菌菌株是(Escherichiacoli)DH5α，載體轉(zhuǎn)化采用根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)菌株GV3101，植物表達(dá)載體是pCAMBIA3301，VIGS基因沉默所用病毒載體pTRV1和pTRV2,以及CLA基因均由新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 方 法

1.2.1GbHCT13基因轉(zhuǎn)化擬南芥及棉花1)GbHCT13植物過(guò)表達(dá)載體構(gòu)建。設(shè)計(jì)雙酶切引物GbHCT13-F和GbHCT13-R擴(kuò)增GbHCT13基因(表1)，反應(yīng)體系為：DNA 2 μL，10×HiFi-緩沖液 5 μL，上下游引物各1 μL，ddH2O 11 μL，dNTP混合物4 μL，HiFi酶1 μL。將測(cè)序結(jié)果正確的GbHCT13基因片段與pCAMBIA3301質(zhì)粒經(jīng)限制性內(nèi)切酶BglⅡ和Eco91 Ⅱ經(jīng)37 ℃酶切40 min，反應(yīng)體系為：目的片段7 μL，酶均為1 μL，10×PCR 緩沖液 4 μL，ddH2O 7 μL。檢測(cè)后連接GbHCT13基因與載體大片段，并轉(zhuǎn)化DH5α。利用pCAMBIA3301載體通用引物bar-F和bar-R對(duì)轉(zhuǎn)化后的陽(yáng)性菌落進(jìn)行PCR檢測(cè)，將正確重組質(zhì)粒命名為pCAMBIA3301-GbHCT13。

表1 實(shí)驗(yàn)中所用引物序列表

2) 菌液的準(zhǔn)備。將含有pCAMBIA3301-GbHCT13質(zhì)粒的農(nóng)桿菌菌液，于28 ℃、200 r/min恒溫?fù)u床中培養(yǎng)至OD為0.6，培養(yǎng)時(shí)添加50 mg/mL的抗生素卡那霉素和利福平；轉(zhuǎn)接入新鮮LB培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)至菌液OD為1.0～1.2；制備好的菌液4 000 r/min離心10 min，棄上清后用10%蔗糖溶液重懸菌體沉淀至OD為0.6～0.8。

3) 轉(zhuǎn)基因操作。轉(zhuǎn)化前一天標(biāo)記即將開(kāi)花的棉花花朵，次日上午對(duì)標(biāo)記的花朵進(jìn)行菌液噴施，保證噴霧覆蓋整個(gè)花冠，菌液能完全侵染花藥和柱頭；用小皮筋輕柔捆扎噴施后的花朵，以防止菌液快速蒸發(fā)。擬南芥轉(zhuǎn)化操作前修剪多余果夾，保留頂端花序用于侵染；目標(biāo)菌液侵染植株整個(gè)花序時(shí)間不超過(guò)60 s；侵染完成后先經(jīng)25 ℃黑暗培養(yǎng)24 h；再轉(zhuǎn)為16 h/8 h光照條件下正常培養(yǎng)至收獲種子；根據(jù)實(shí)際轉(zhuǎn)化情況，于1周之后開(kāi)展第2次侵染，步驟同上。

4) 轉(zhuǎn)GbHCT13基因擬南芥與棉花植株篩選與鑒定。設(shè)置3種濃度(0.06%、0.07%和0.08%)的除草劑用于轉(zhuǎn)基因棉花抗性篩選及PCR樣品檢測(cè)，引物為bar-F/R。待轉(zhuǎn)化后的擬南芥T0代種子幼苗的2片子葉完全展開(kāi)即可進(jìn)行抗性篩選，將200 μL 10%的除草劑原液和400 μL表面活性劑吐溫20，溶于400 mL水中，連續(xù)噴施3次，1周后觀察幼苗表型，分離黃化與正常綠色植株，常綠植株移栽至新的營(yíng)養(yǎng)土中培養(yǎng)至收獲種子。

5) 轉(zhuǎn)基因植株表型鑒定及相關(guān)檢測(cè)。轉(zhuǎn)基因棉花采取梳絨方法并測(cè)定纖維長(zhǎng)度，纖維樣品送公司測(cè)定指標(biāo)。對(duì)GbHCT13轉(zhuǎn)基因擬南芥進(jìn)行表型拍照，統(tǒng)計(jì)其莖稈表皮毛數(shù)量、6～8葉期的葉片數(shù)量、抽薹數(shù)量。莖稈截取2～3 cm用FAA固定液保存，進(jìn)行番紅-固綠染色，用ImageJ軟件進(jìn)行圖片分析。利用qRT-PCR檢測(cè)苯丙烷代謝通路上相關(guān)基因的表達(dá)變化。

1.2.2 轉(zhuǎn)GbHCT13基因棉花VIGS沉默1)GbHCT13基因沉默載體構(gòu)建。根據(jù)GbHCT13全長(zhǎng)序列，選取非保守區(qū)大小為328 bp插入序列與pTRV2載體連接，設(shè)計(jì)帶酶切位點(diǎn)的特異性引物VIGS-GbHCT13-F和VIGS-GbHCT13-R(表1)進(jìn)行PCR擴(kuò)增(退火溫度為62 ℃)，分別用EcoRⅠ與BamHⅠ對(duì)質(zhì)粒和PCR純化產(chǎn)物進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)純化后，用T4連接酶將酶切產(chǎn)物于22 ℃連接20 min，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，菌液PCR檢測(cè)陽(yáng)性克隆，再送至北京華大測(cè)序有限公司測(cè)序。

2)GbHCT13基因沉默操作步驟。將制備好的pTRV1、pTRV2、pTRV2-CLA和pTRV2-GbHCT13分別轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101中，活化后離心重懸菌體，調(diào)節(jié)OD600為1.0～1.5；將3種菌液按照1∶1比例混合后注射完全展開(kāi)的棉株子葉背面，注射菌液覆蓋葉片80%以上；注射的植株暗培養(yǎng)24 h后置于28 ℃恒溫培養(yǎng)。

3)GbHCT13基因沉默效率檢測(cè)。注射2周后隨機(jī)選取2個(gè)品種的基因沉默植株與對(duì)照植株，用植物多糖多酚RNA提取試劑盒提取新生葉片RNA(北京天根)，并用RNase-free DNase I試劑盒合成cDNA第一鏈，經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后作為PCR模板。使用SYBR Green Master Mix(美國(guó)ABI)在ABI Prism7500系統(tǒng)中進(jìn)行qRT-PCR，以棉花ubiquitin 7(UBQ7)基因作為內(nèi)參，每個(gè)樣品進(jìn)行3次重復(fù)檢測(cè)，結(jié)果采用2-ΔΔCt法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

4)GbHCT13沉默植株表型觀察。拍照觀察GbHCT13基因沉默植株長(zhǎng)勢(shì)變化，采用體式顯微鏡觀察其莖稈和葉柄表皮毛數(shù)量及密度變化，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和顯著性分析采用Graphpad Prism軟件。

5)GbHCT13沉默植株莖稈組織切片分析。截取GbHCT13基因沉默的2個(gè)品種植株子葉節(jié)點(diǎn)以上的整段莖稈，切分為2～3 cm的小段后保存于FAA固定液中，送至武漢賽維爾生物公司進(jìn)行切片和番紅固綠染色處理。

6)GbHCT13沉默植株木質(zhì)素含量測(cè)定。本實(shí)驗(yàn)參考曹雙瑜等[16]的硫酸木質(zhì)素(Klason)方法，在此基礎(chǔ)上略有改動(dòng)。稱取待測(cè)植株莖稈各2 g，經(jīng)緩沖液(50 mmol/L Tris-HCl，10 g/L Triton X-100，1 mol/L NaCl)清洗2次，80%丙酮洗2次，純丙酮洗1次，烘干備用；將定量濾紙用3%硫酸浸潤(rùn)后烘干至恒重W1(g)；將烘干的莖稈樣品置于50 mL離心管內(nèi)，加15 mL 4 ℃下預(yù)冷的72%硫酸，室溫靜止2 h，期間每隔10 min充分混勻1次，直至莖稈完全被降解；加水稀釋至硫酸終濃度為3%；經(jīng)0.1 Mpa，121 ℃的滅菌鍋降解1 h；冷卻至室溫后用處理好的濾紙過(guò)濾殘?jiān)?；濾紙及殘?jiān)娓芍梁阒赜洖閃2(g)；灼燒后測(cè)定過(guò)濾物的灰分W3(g)；計(jì)算酸不溶木質(zhì)素量%=(W2-W1-W3)/2×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 擬南芥中GbHCT13基因功能驗(yàn)證

2.1.1 pcAMBIA3301-GbHCT13重組載體檢測(cè)雙酶切驗(yàn)證以前期克隆完成的T5-GbHCT13質(zhì)粒為模板，連接GbHCT13與pCAMBIA3301載體，轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌GV3101后篩選含有正確連接GbHCT13片段的陽(yáng)性重組載體菌液，結(jié)果表明重組載體成功轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌(圖1，A)。采用BglⅡ和Eco91 Ⅰ酶對(duì)重組載體進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證(圖1，B)，GbHCT13片段大小為1 311 bp，pCAMBIA3301載體大片段9 264 bp，將片段大小正確的重組載體命名為pCAMBIA3301-GbHCT13保存?zhèn)溆谩?/p>

2.1.2 轉(zhuǎn)GbHCT13基因擬南芥植株篩選鑒定如圖2所示，轉(zhuǎn)GbHCT13基因的擬南芥經(jīng)除草劑篩選，部分幼苗出現(xiàn)枯黃死亡現(xiàn)象，移栽正常生長(zhǎng)的綠色幼苗至新鮮營(yíng)養(yǎng)土(珍珠巖∶蛭石∶有機(jī)質(zhì)=1∶2∶2)中繼續(xù)培養(yǎng)至收獲T2代種子，經(jīng)50 mg/mL抗性培養(yǎng)基進(jìn)一步篩選，移栽能夠正常生長(zhǎng)的綠色幼苗，白化苗拔除。經(jīng)過(guò)每次均單株收獲種子的多代篩選，獲得T3代植株，培養(yǎng)后開(kāi)展表型及分子鑒定。

M.DL2000; A. 1-5. 重組載體；B. 1. 重組載體雙酶切圖1 pCAMBIA3301-GbHCT13重組載體篩選及雙酶切驗(yàn)證M. DL2000; A. 1-5. Recombinant vectors； B. 1. Recombinant vector with double enzyme cutFig.1 pCAMBIA3301-GbHCT13 recombinant vector screening and double enzyme verification

2.1.3 擬南芥分子檢測(cè)及表型觀察qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因植株中目的基因表達(dá)量較野生型極顯著增加。T3代植株生長(zhǎng)至6～8片蓮座葉時(shí)期，摘取葉片進(jìn)行DNA分子檢測(cè)表明，4株苗均檢測(cè)到抗除草劑bar基因的目的條帶(圖3，A)，與pCAMBIA3301空載體質(zhì)粒DNA對(duì)照相比，條帶清晰且單一，表明重組載體轉(zhuǎn)入擬南芥中，初步獲得轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株(圖3，B)。轉(zhuǎn)基因植株同一時(shí)期整體的生長(zhǎng)情況較野生型旺盛，株形與野生型不同，在同一生長(zhǎng)時(shí)期的葉片數(shù)、抽薹數(shù)和莖稈表皮毛的數(shù)量(圖3，C-E)較野生型存在差異。

分別對(duì)轉(zhuǎn)GbHCT13基因和野生型擬南芥植株進(jìn)行2次抽薹、葉片和莖稈表皮毛等的數(shù)量統(tǒng)計(jì)，發(fā)現(xiàn)6葉期轉(zhuǎn)基因植株的抽薹數(shù)和葉片數(shù)量較野生型增加，達(dá)到極顯著差異，而8葉期則無(wú)顯著差異；轉(zhuǎn)GbHCT13基因植株花期的莖稈表皮毛數(shù)量也極顯著高于對(duì)照(圖4)。

2.1.4 轉(zhuǎn)GbHCT13基因擬南芥植株切片觀察及相關(guān)基因表達(dá)檢測(cè)為了進(jìn)一步觀察GbHCT13基因在擬南芥中過(guò)表達(dá)對(duì)植株生長(zhǎng)變化的影響，選取轉(zhuǎn)基因待測(cè)植株的莖稈進(jìn)行切片及染色分析，觀察其內(nèi)部組織變化，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株較野生型莖稈初生木質(zhì)部生長(zhǎng)活躍，次生木質(zhì)部導(dǎo)管細(xì)胞壁橫截面積變大，表明GbHCT13基因在擬南芥中過(guò)量表達(dá)使導(dǎo)管增粗，髓質(zhì)細(xì)胞無(wú)明顯變化。

基因的表達(dá)對(duì)植株生長(zhǎng)變化的調(diào)控作用往往是通過(guò)多種基因的協(xié)調(diào)配合而實(shí)現(xiàn)的，通過(guò)觀察GbHCT13的過(guò)表達(dá)對(duì)該基因代謝途徑上相關(guān)基因的影響，對(duì)擬南芥篩選出HCT基因合成與代謝通路上的5個(gè)相關(guān)基因，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)CAD、CCoAOMT、CCR、PAL和4CL這5個(gè)關(guān)鍵基因較對(duì)照存在不同的表達(dá)趨勢(shì)(圖5)，過(guò)表達(dá)擬南芥植株CAD、CCoAOMT、PAL和4CL的表達(dá)量分別是對(duì)照的25.28倍、1.57倍、3.12倍和4.29倍，其中CAD表達(dá)量極顯著增加，而CCR表達(dá)量顯著下降，表明擬南芥中GbHCT13基因過(guò)量表達(dá)使木質(zhì)素合成途徑基因發(fā)生不同程度改變，其中CAD、CCoAOMT、PAL和4CL與GbHCT13基因的表達(dá)呈正相關(guān)。

2.2 GbHCT13基因在棉花中功能驗(yàn)證

2.2.1 轉(zhuǎn)GbHCT13基因植株田間篩選與鑒定轉(zhuǎn)基因T1代成鈴率為26.5%，GbHCT13轉(zhuǎn)基因T2代植株田間種植350株，篩選后存活43株，存活率為12.29%，單株收獲種子，采用檢測(cè)到的陽(yáng)性植株開(kāi)展后續(xù)鑒定工作。

2.2.2 轉(zhuǎn)GbHCT13基因棉株分子檢測(cè)分別對(duì)T1、T2代轉(zhuǎn)GbHCT13基因植株進(jìn)行隨機(jī)采樣，帶回室內(nèi)提取葉片DNA進(jìn)行PCR分子檢測(cè)，樣品中均檢測(cè)到包含抗除草劑bar基因的475 bp目的帶，做好標(biāo)記待收獲單株種子。T3植株經(jīng)半定量檢測(cè)到明亮單一的目的條帶，認(rèn)為初步獲得轉(zhuǎn)基因植株(圖6)。

2.2.3 轉(zhuǎn)GbHCT13基因T2代植株纖維表型分析隨機(jī)選取轉(zhuǎn)GbHCT13基因的T2代棉花纖維，進(jìn)行3組重復(fù)，每組5個(gè)樣本，梳理發(fā)現(xiàn)，對(duì)照棉纖維長(zhǎng)度均值2.58 cm，轉(zhuǎn)基因棉纖維長(zhǎng)度均值2.60 cm，并無(wú)明顯增長(zhǎng)(圖7)。

纖維5項(xiàng)指標(biāo)測(cè)定結(jié)果表明，GbHCT13轉(zhuǎn)基因T2代棉花纖維長(zhǎng)度較對(duì)照無(wú)明顯增加，這與前期手工梳絨結(jié)果一致，但伸長(zhǎng)率顯著增加，說(shuō)明測(cè)定的轉(zhuǎn)纖維樣品較非轉(zhuǎn)基因而言，纖維有增長(zhǎng)趨勢(shì)；轉(zhuǎn)基因前后纖維整齊度均良好；馬克隆值顯著降低，在纖維品質(zhì)分類上可由原來(lái)的C2級(jí)達(dá)到B2級(jí)；斷裂比強(qiáng)度增加，但未達(dá)到顯著差異(圖8)。

2.2.4GbHCT13基因沉默載體構(gòu)建將GbHCT13與pTRV2載體連接后通過(guò)菌液PCR篩選陽(yáng)性克隆(圖9)，檢測(cè)到預(yù)期大小相符的328 bp目的基因插入序列，對(duì)檢測(cè)含有目的片段的陽(yáng)性菌液提取質(zhì)粒，經(jīng)EcoRⅠ與BamHⅠ雙酶切驗(yàn)證(圖10)，酶切正確的質(zhì)粒送測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果與所選片段序列完全吻合的質(zhì)粒命名為pTRV2-GbHCT13。

A.T2代幼苗；B.T3代幼苗篩選前；C.T3代幼苗篩選后；D.轉(zhuǎn)基因存活植株移栽圖2 噴施除草劑后轉(zhuǎn)基因擬南芥幼苗狀態(tài)A. T2 generation seedlings； B. T3 generation seedlings before screening； C. Screening of T3 generation seedlings；D. Transplanting viable transgenic plantsFig.2 Seedling status of transgenic Arabidopsis thaliana after herbicide spraying

A. T3代轉(zhuǎn)基因擬南芥DNA檢測(cè)：M. DL2000；1. 陰性對(duì)照(野生型擬南芥)；2. 陽(yáng)性對(duì)照(pCAMBIA3301空載體)；3. 空白對(duì)照(水)；4-7. 轉(zhuǎn)基因擬南芥；B. 轉(zhuǎn)基因擬南芥中GbHCT13基因表達(dá)檢測(cè)：WT. 野生型col(對(duì)照)；1-4. 轉(zhuǎn)基因擬南芥；*和** 表示處理與對(duì)照之間顯著(P<0.05)和極顯著差異(P<0.01)，下同；C. 植株表型；D. 莖稈表皮毛；E. 抽薹前植株葉片；C-E圖中左為對(duì)照(野生型col)，右為轉(zhuǎn)基因擬南芥(T3)圖3 轉(zhuǎn)基因擬南芥T3代分子檢測(cè)及表型分析A. DNA detection of transgenic T3 generation Arabidopsis thaliana： M. DL2000; 1. Negative control (wild-type Arabidopsis thaliana); 2. Positive control (pCAMBIA3301 empty plasmid DNA); 3. Blank control (water); 4-7. Transgenic Arabidopsis thaliana; B. Detection of GbHCT13 gene expression in transgenic Arabidopsis thaliana; col. Wild-type(control); 1-4. Transgenic Arabidopsis; * and ** indicate significant (P<0.05) and extremely significant differences (P<0.01) between control and treatment, the same as below; C. Phenotypic observation of the whole plant; D. Observation of stem surface fur; E. Observation of plant leaves before mossing; C-E Control on the left is wild Arabidopsis thaliana, experimental group on the right is transgenic Arabidopsis in FigureFig.3 Molecular detection and phenotypic analysis of transgenic Arabidopsis thaliana T3 generation

A. 6葉期抽薹數(shù)；B. 6葉期葉片數(shù)；C. 8葉期抽薹數(shù)；D. 8葉期葉片數(shù)；E. 花期莖稈表皮毛數(shù)量圖4 轉(zhuǎn)GbHCT13基因擬南芥T3代植株生物學(xué)統(tǒng)計(jì)A. Number of bolting at 6 leaf stage; B. Number of leaf at 6 leaf stage; C. Number of bolting at 8 leaf stage; D. Number of leaf at 8 leaf stage; E. Number of fur at stem in flossomFig.4 Biological statistics of T3 generation transgenic Arabidopsis thaliana with GbHCT13 gene

A.對(duì)照(野生型col)；B. 轉(zhuǎn)基因擬南芥； pi. 髓；s-Xy. 次生木質(zhì)部；p-Xy. 初生木質(zhì)部；標(biāo)尺=100 μm; C. 相關(guān)基因表達(dá)圖5 轉(zhuǎn)GbHCT13基因擬南芥T3代植株切片觀察A. Control (wild type col); B. Transgenic Arabidopsis thaliana; pi. Pith; s-Xy. Secondary Xylem; p-Xy. Primary Xylem; Bar=100 μm; C. Related gene expressionFig.5 Section observation of T3 generation Arabidopsis thaliana transgenic with GbHCT13 gene

2.2.5GbHCT13基因沉默效率檢測(cè)基因表達(dá)檢測(cè)表明，實(shí)驗(yàn)組GbHCT13基因表達(dá)量較對(duì)照極顯著降低，‘新海21’中沉默效率分別為63.05%、72.92%和80.04%(圖11，A)，ND203中沉默效率分別為63.11%、4.08%和45.80%(圖11，E)。沉默組較陰性對(duì)照植株株高明顯降低，陽(yáng)性對(duì)照白化苗的株高低于陰性對(duì)照，可能由于CLA基因沉默影響葉綠色合成從而造成植株矮化與培養(yǎng)條件無(wú)關(guān)(圖11，B、F)。由于‘新海21’植株表皮毛極不明顯(圖11，C、D)，對(duì)更具有代表性的ND203品種進(jìn)行莖稈表皮毛觀察與統(tǒng)計(jì)(圖11，G、H)，表明GbHCT13基因沉默使ND203植株莖稈和葉柄表皮毛數(shù)量顯著減少(圖12)。

A、B. T1和T2代植株DNA檢測(cè)：M. DL2000；1. 陰性對(duì)照(水)；2. 陽(yáng)性對(duì)照(pCAMBIA3301)；3-17. 轉(zhuǎn)基因棉花; C. T3代植株半定量檢測(cè)：1. 陰性對(duì)照(水)；2. 陽(yáng)性對(duì)照(pCAMBIA3301)；3-5. 轉(zhuǎn)基因棉花圖6 轉(zhuǎn)GbHCT13基因棉花后代PCR檢測(cè)A, B. DNA detection of T1 and T2 generation plants; M. DL2000; 1. Negative control (water); 2. Positive control (pCAMBIA3301); 3-17. Transgenic cotton; C. Semi-quantitative detection of T3 generation plants: 1. Negative control (water); 2. Positive control (pCAMBIA3301); 3-5. Transgenic cottonFig.6 PCR detection of transgenic cotton with GbHCT13 gene

A. 非轉(zhuǎn)基因棉纖維；B. 轉(zhuǎn)基因T2代棉纖維；C. 棉纖維長(zhǎng)度比較：對(duì)照. 非轉(zhuǎn)基因棉花；處理. 轉(zhuǎn)基因棉花；下同圖7 轉(zhuǎn)GbHCT13基因棉花T2代纖維觀察A. Non-genetically modified cotton fibers; B. Transgenic T2 cotton fiber; C. Cotton fiber length compared： Control. Non-transgenic cotton; Treatment. Transgenic cotton； The same as belowFig.7 Observation of GbHCT13 transgenic T2 cotton fiber

A. 纖維上半部平均長(zhǎng)度；B. 纖維整齊度；C. 馬克隆值；D. 纖維斷裂比強(qiáng)度；E. 纖維伸長(zhǎng)率圖8 轉(zhuǎn)GbHCT13基因棉花T2代纖維指標(biāo)測(cè)定A. Average length of the upper half of the fiber; B. Fiber uniformity; C. Incompatible micronaire; D. Fiber breaking strength; E. Elongation of fiberFig.8 Determination of fiber index of GbHCT13 transgenic T2 cotton

M. DL2000； 1-10為檢測(cè)菌液樣品圖9 VIGS-GbHCT13菌液PCR檢測(cè)M. DL2000; 1-10 For detecting the sample of the fungusFig.9 PCR detection of VIGS-GbHCT13 bacterial fluid

M1. DL15000；M2. DL2000；1. pTRV2載體大片段9 335 bp，VIGS-GbHCT13片段328 bp圖10 VIGS-GbHCT13重組載體雙酶切驗(yàn)證M1. DL15000; M2. DL2000; 1. The pTRV2 vector is a large segment of 9 335 bp; VIGS-GbHCT13 segment of 328 bpFig.10 Determination of VIGS-GbHCT13 plasmid by double enzyme digestion

2.2.6 棉花莖稈組織切片分析為了進(jìn)一步了解GbHCT13基因沉默對(duì)棉花植株內(nèi)部組織結(jié)構(gòu)的影響，對(duì)兩品種的棉花莖稈進(jìn)行切片處理(圖13，A、B、D、E)，對(duì)照中木質(zhì)部被染成紅色細(xì)胞數(shù)量是沉默植株的2.78倍，細(xì)胞壁染色厚度是沉默植株的1.56倍，差異極顯著，此外沉默植株中木質(zhì)部管狀分子的排布不規(guī)則，導(dǎo)管細(xì)胞形狀發(fā)生明顯改變，整個(gè)木質(zhì)部減小(圖13，B、E)。

A 和E.對(duì)照. 非轉(zhuǎn)基因棉花；1-3. 基因沉默棉花；A-D. ‘新海21’基因表達(dá)、植株表型、莖稈和葉柄；E-H. ND203基因表達(dá)、植株表型、莖稈和葉柄；C、D、G、H中左為對(duì)照，右為基因沉默棉花圖11 基因沉默效率檢測(cè)及2周后植株生長(zhǎng)表型觀察與統(tǒng)計(jì)A and E. Control. Non-transgenic cotton; 1-3. Gene silenced cotton; A-D. Gene expression of XH21; Plant growth performance; Stem and Petiole of XH21; E-H. Gene expression of ND203; Plant growth performance; Stem and Petiole of ND203; C, D, G and H. The left is the control; The right is the gene silenced cottonFig.11 Detection and statistics of GbHCT13 gene silencing efficiency and observation of plant growth phenotype after two weeks

對(duì)照. 非轉(zhuǎn)基因棉花；1-3. 基因沉默棉花圖12 GbHCT13基因沉默ND203植株表皮毛數(shù)量統(tǒng)計(jì)Control. Non-transgenic cotton; 1-3. Gene silenced cottonFig.12 GbHCT13 gene silencing ND203 plant surface fur number statistics

ND203植株切片結(jié)果顯示，對(duì)照植株中木質(zhì)部導(dǎo)管細(xì)胞排列規(guī)則整齊，被染色細(xì)胞數(shù)量及細(xì)胞壁厚度分別是沉默植株的4.29倍和1.71倍，差異極顯著，沉默GbHCT13基因之后植株的木質(zhì)部染色面積減少，導(dǎo)管變細(xì)，排列較對(duì)照不規(guī)則(圖13，E)。

木質(zhì)素測(cè)定結(jié)果表明，沉默GbHCT13基因的植株中木質(zhì)素含量較對(duì)照極顯著降低(圖14，A)。檢測(cè)了GbHCT13沉默植株中HCT基因通路相關(guān)基因的表達(dá)量變化發(fā)現(xiàn)‘新海21’和ND203兩品種中CAD、CCoAOMT、CCR、PAL和4CL這5個(gè)關(guān)鍵基因均表現(xiàn)出相同的趨勢(shì)，除4CL基因表達(dá)量極顯著增加以外，其他4基因的表達(dá)呈現(xiàn)降低的趨勢(shì)(圖14，B、C)。GbHCT13基因沉默引起‘新海21’中4CL基因表達(dá)量增加到對(duì)照的10.29倍，兩基因的表達(dá)呈現(xiàn)極顯著負(fù)相關(guān)。

對(duì)照. 非轉(zhuǎn)基因棉花；處理. 基因沉默棉花；A-D. ‘新海21’對(duì)照、處理、染色細(xì)胞數(shù)量和細(xì)胞壁厚度；E-H. ND203對(duì)照、處理、染色細(xì)胞數(shù)量和細(xì)胞壁厚度；ca. 形成層；pi. 髓；te. 管狀分子；s-Xy. 次生木質(zhì)部；p-Xy. 初生木質(zhì)部；標(biāo)尺=50 μm圖13 GbHCT13基因沉默對(duì)木質(zhì)素影響的組織化學(xué)分析Control. Non-transgenic cotton; Treatment. Gene silenced cotton; A-D. Control and treatment plant of Xinhai 21; Statistics on the number of cells and cell wall thickness of Xinhai 21; E-H. ND203 control and treatment plant; Number of ND203 staining cells and cell wall thickness; ca. Cambium; pi. Pith; te: Tracheary element; s-Xy. Secondary Xylem; p-Xy. Primary Xylem; Bar=50 μmFig.13 Histochemical analysis of the effect of GbHCT13 gene silencing on lignin in cotton

A.木質(zhì)素含量變化； B. 新海21；C. ND203；對(duì)照. 非轉(zhuǎn)基因棉花；處理. 基因沉默棉花圖14 棉花GbHCT13基因沉默植株的木質(zhì)素含量變化及其代謝通路相關(guān)基因表達(dá)A. Change of lignin content; B. Xinhai 21; C. ND203; Control. Non-transgenic cotton; Treatment. Gene silenced cottonFig.14 Expression of GbHCT13 pathway related gene and the changes of lignin content

3 討 論

有研究表明棉花纖維發(fā)育中有苯丙烷類物質(zhì)-木質(zhì)素的合成，HCT基因在木質(zhì)素合成中扮演關(guān)鍵作用。本研究對(duì)前期克隆的GbHCT13(GenBank 登錄號(hào)：MW048849)進(jìn)行基因功能驗(yàn)證，結(jié)果顯示，該基因在擬南芥中異位表達(dá)使其表型發(fā)生改變，轉(zhuǎn)基因擬南芥中GbHCT13基因表達(dá)量較野生型明顯增加，植株生長(zhǎng)旺盛，能夠顯著增加擬南芥抽薹數(shù)和蓮座葉片數(shù)量，使其莖稈初生木質(zhì)部細(xì)胞發(fā)生改變。棉花中過(guò)表達(dá)GbHCT13基因使纖維伸長(zhǎng)率增加，比強(qiáng)度增加，馬克隆值降低，表明纖維品質(zhì)有所提升。棉花中沉默GbHCT13基因使植株莖稈表皮毛數(shù)量減少，而植物表皮毛的形成受到苯丙烷途徑物質(zhì)合成的影響[17]，暗示GbHCT13基因抑制了苯丙烷代謝；木質(zhì)素含量減低，初生木質(zhì)部生長(zhǎng)受到抑制，導(dǎo)管數(shù)量減少，細(xì)胞壁染色厚度降低，通路上關(guān)鍵基因表達(dá)量出現(xiàn)不同表達(dá)變化，而植株株高未發(fā)生明顯矮化現(xiàn)象。鑒于HCT位于苯丙烷代謝通路的上游位置，它的抑制可能不僅影響木質(zhì)素，而且影響其他代謝物，通過(guò)與該途徑上其他基因的協(xié)調(diào)配合實(shí)現(xiàn)纖維品質(zhì)改變。由此可以推測(cè)HCT基因主要參與棉花纖維細(xì)胞次生壁的合成，并且能調(diào)控棉纖維中的木質(zhì)素含量。本實(shí)驗(yàn)中擬南芥植株木質(zhì)素含量不便測(cè)定，后續(xù)有待選用合適的方法測(cè)定其含量。木質(zhì)素由苯丙烷途徑產(chǎn)生，其上游調(diào)控主要涉及3種酶：PAL，C4H[18]和4CL[19]，它們表達(dá)活性的高低與木質(zhì)素的總量密切相關(guān)[20]。在煙草中抑制PAL和C4H的表達(dá)均會(huì)不同程度降低木質(zhì)素的含量，反義抑制PAL活性使木質(zhì)素的含量下降并伴隨S/G比值升高，嚴(yán)重影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育[21]；抑制煙草中C4H的活性則發(fā)現(xiàn)S/G比值降低，但未對(duì)植物生長(zhǎng)造成不良影響[22]。這種現(xiàn)象表明C4H可能參與S/G木質(zhì)素單體的合成調(diào)控。Hu等通過(guò)反義RNA技術(shù)抑制黑楊4CL基因表達(dá)，90%以上的轉(zhuǎn)基因株系中木質(zhì)素含量下降達(dá)45%，且伴隨纖維素含量增加了15%[23]；楊雪萍等將4CL1基因反義轉(zhuǎn)入到煙草中，發(fā)現(xiàn)植株的纖維素含量比對(duì)照提高了11.4%，而木質(zhì)素含量比對(duì)照降低了19.1%[24]，證明4CL可能是木質(zhì)素合成中的限速酶之一，并且植物體內(nèi)木質(zhì)素和纖維素的合成具有一定的內(nèi)在聯(lián)系。植物本身的自我調(diào)節(jié)機(jī)制使其在改變某單一性狀時(shí)對(duì)其他性狀也產(chǎn)生影響。木質(zhì)素合成的苯丙烷途徑中包含HCT在內(nèi)的多種關(guān)鍵酶基因的表達(dá)差異對(duì)木質(zhì)素合成存在影響，通過(guò)調(diào)控相關(guān)基因活性的改變來(lái)分析木質(zhì)部微觀結(jié)構(gòu)變化具有可行性。位于木質(zhì)素合成途徑中的關(guān)鍵基因通過(guò)互相調(diào)節(jié)實(shí)現(xiàn)木質(zhì)素的合成，其中PAL和4CL位于木質(zhì)素合成上游，決定碳元素流向，CAD、CCoAOMT、CCR則通過(guò)對(duì)木質(zhì)素單體含量的改變來(lái)影響其總含量。本研究分析GbHCT13沉默植株中木質(zhì)素合成相關(guān)基因表達(dá)變化，4CL基因表達(dá)量極顯著增加，CAD、CCoAOMT、CCR降低，表明GbHCT13的沉默引起4CL補(bǔ)償性增加，而植株中木質(zhì)素含量降低則是由于CAD、CCoAOMT、CCR引起的單體含量減少，這對(duì)于通過(guò)代謝手段探究GbHCT13功能提供理論基礎(chǔ)。

本研究表明，GbHCT13基因主要參與纖維發(fā)育伸長(zhǎng)期，可能在胚珠纖維起始期促進(jìn)棉纖維的生長(zhǎng)，其他時(shí)期幾乎不表達(dá)。棉花中沉默GbHCT13基因結(jié)果表明，抑制GbHCT13使棉花生長(zhǎng)代謝受阻，影響纖維發(fā)育起始。GbHCT13基因能增加棉纖維伸長(zhǎng)率，增加纖維強(qiáng)度，進(jìn)而改善棉纖維品質(zhì)。通過(guò)對(duì)GbHCT13基因表達(dá)的調(diào)控，可實(shí)現(xiàn)在不影響棉花植株正常營(yíng)養(yǎng)和生殖生長(zhǎng)的情況下，改善纖維品質(zhì)。本實(shí)驗(yàn)為后續(xù)利用海島棉優(yōu)良基因改善陸地棉纖維品質(zhì)提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論支持。