溫肺疏風(fēng)方治療咳嗽變異性哮喘作用機(jī)制的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究*

范榮榮 張 瞳 張忠德

（廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，廣東省中醫(yī)院，廣東 廣州 510120）

咳嗽變異性哮喘（CVA）多因風(fēng)邪致病，而“六氣皆令人咳，風(fēng)寒為主”，其夾雜致病中，又多以風(fēng)寒之邪居多。CVA起病之初，邪在衛(wèi)表，但由于失治誤治，患者服用中藥或抗生素等寒涼藥物，或過(guò)早使用鎮(zhèn)咳藥，或過(guò)食寒涼食物，壅遏肺氣，邪反入里，郁結(jié)于肺內(nèi)，肺氣不得宣泄，病情遷延，久病傷肺，肺氣虛弱，衛(wèi)陽(yáng)不足。因此，風(fēng)寒外襲，肺失宣肅，是CVA發(fā)病的外因，肺衛(wèi)陽(yáng)不足，易感外邪是CVA發(fā)病的內(nèi)因?！胺尾〔贿h(yuǎn)溫”，治療應(yīng)該以溫肺散寒、宣肺疏風(fēng)止咳為法，肺衛(wèi)陽(yáng)不足得以改善，則能從根本上解決反復(fù)易感邪發(fā)病的問(wèn)題。廣東省名中醫(yī)張忠德教授善用溫肺散寒、宣肺疏風(fēng)止咳的方法治療CVA，其創(chuàng)立的溫肺疏風(fēng)方由蜜麻黃、細(xì)辛、五味子、紫蘇葉等組成。臨床研究發(fā)現(xiàn)溫肺疏風(fēng)方可能與沙美特羅/替卡松粉協(xié)同發(fā)揮減輕氣道炎癥反應(yīng)的作用［1］。本研究借鑒網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究的方法，對(duì)尚缺乏基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究的溫肺疏風(fēng)方進(jìn)行靶點(diǎn)的挖掘和分析，進(jìn)而預(yù)測(cè)其治療CVA可能的作用通路，為后續(xù)開(kāi)展該處方治療CVA的機(jī)制研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 溫肺疏風(fēng)方化學(xué)成分及靶點(diǎn)挖掘 基于中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)（TCMSP）數(shù)據(jù)庫(kù)查找溫肺疏風(fēng)方中各味中藥的化學(xué)成分，通過(guò)ADME參數(shù)（OB≥30%，DL＞0.18）進(jìn)行篩選。對(duì)于不滿足篩選條件，但在中藥中含量高或相關(guān)藥物活性的化合物通過(guò)查閱文獻(xiàn)進(jìn)行手動(dòng)篩選添加。然后基于TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)，將溫肺疏風(fēng)方中的有效成分逐一配對(duì)潛在靶點(diǎn)，再通過(guò)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.uniprot.org/）篩選出物種為“人”的靶點(diǎn)，即為溫肺疏風(fēng)方候選化合物的預(yù)測(cè)作用靶點(diǎn)。

1.2 哮喘相關(guān)靶點(diǎn)獲取 以“asthma”作為檢索詞先分別從Drugbank、OMIM、KEGG及DisGeNET 4個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索哮喘相關(guān)靶點(diǎn)，再合并4個(gè)數(shù)據(jù)所得靶點(diǎn)，重復(fù)的靶點(diǎn)保留1個(gè)，所得靶點(diǎn)即為哮喘相關(guān)靶點(diǎn)。

1.3 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及分析 將候選化合物的預(yù)測(cè)靶點(diǎn)與哮喘相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行映射，即兩者取交集，所得的靶點(diǎn)即為溫肺疏風(fēng)方作用于哮喘的預(yù)測(cè)靶點(diǎn)。采用String數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建溫肺疏風(fēng)方作用于哮喘的蛋白質(zhì)相互作用體內(nèi)反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)圖，再選取評(píng)分＞0.9分的相互作用關(guān)系利用Cytoscape軟件構(gòu)建蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)，并進(jìn)行拓?fù)浞治?。其中自由度和中心介?shù)均大于平均值的靶點(diǎn)，可認(rèn)為溫肺疏風(fēng)方作用于哮喘的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

1.4 靶點(diǎn)通路富集分析 利用DAVID 6.8（https：//david.ncifcrf.gov/）對(duì)溫肺疏風(fēng)方作用于哮喘的預(yù)測(cè)靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG信號(hào)通路分析，以P＜0.05為截點(diǎn)，獲得顯著富集的信號(hào)通路，分析與哮喘相關(guān)的信號(hào)通路。

2 結(jié)果

2.1 候選化合物及其靶點(diǎn)的篩選 以O(shè)B≥30%，DL≥0.18作為篩選條件，結(jié)合手動(dòng)篩選，共得到溫肺疏風(fēng)方中化合物防風(fēng)18個(gè)、細(xì)辛8個(gè)、橘紅9個(gè)、枇杷葉18個(gè)、浙貝母7個(gè)、前胡24個(gè)、紫菀19個(gè)、紫蘇子14個(gè)、五味子8個(gè)、麻黃25個(gè)，刪除重復(fù)部分后共得到97個(gè)候選化合物。基于TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)查詢化合物的靶點(diǎn)，重復(fù)靶點(diǎn)僅保留1個(gè)，共得到239個(gè)化合物靶點(diǎn)。

2.2 疾病靶點(diǎn)獲取結(jié)果 從OMIM、Drugbank、KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)分別獲取到48、93、10個(gè)哮喘相關(guān)靶點(diǎn)，從Disgenet數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取到1 369個(gè)哮喘相關(guān)靶點(diǎn)，將4個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取的所有靶點(diǎn)合并，重復(fù)靶點(diǎn)僅保留1個(gè)，共得到哮喘相關(guān)靶點(diǎn)1 413個(gè)。

2.3 化合物靶點(diǎn)和哮喘靶點(diǎn)映射 將239個(gè)化合物靶點(diǎn)與1 413個(gè)哮喘相關(guān)的靶點(diǎn)進(jìn)行映射，得到110個(gè)溫肺疏風(fēng)方作用于哮喘的靶點(diǎn)。

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 采用String數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建溫肺疏風(fēng)方作用于哮喘的體內(nèi)反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)圖，如圖1所示，線條越粗代表相互作用關(guān)系越強(qiáng)。選取評(píng)分＞0.9分的相互作用關(guān)系利用Cytoscape軟件構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)如圖2所示，該網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點(diǎn)的平均自由度為6.8，平均介數(shù)為0.028，其中自由度及中心介數(shù)均大于平均值的靶點(diǎn)共17個(gè)，可視為溫肺疏風(fēng)方作用于哮喘的關(guān)鍵靶點(diǎn)，其信息詳見(jiàn)表1。

表1 關(guān)鍵靶點(diǎn)基本信息

圖1 溫肺疏風(fēng)方作用于哮喘的體內(nèi)網(wǎng)絡(luò)反應(yīng)圖

圖2 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖

2.5 DAVID通路富集分析 將110個(gè)映射所得靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行KEGG信號(hào)通路富集分析，共得到24條通路，以P＜0.05作為截點(diǎn)，顯著富集的通路有20條，其中與哮喘相關(guān)的通路有11條，以氣泡圖直觀表示與哮喘相關(guān)的通路（圖3）。

圖3 溫肺疏風(fēng)方作用于哮喘的KEGG信號(hào)通路富集氣泡圖

3 討論

通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，預(yù)測(cè)得出溫肺疏風(fēng)方作用于哮喘的關(guān)鍵靶點(diǎn)有17個(gè)，包括JUN、STAT3、QBHIJ4、TNF、EDN1、MAPK等。溫肺疏風(fēng)方作用哮喘的可能通路有11條，由氣泡圖可以看出，11條通路中富集程度較高的通路包括TNF信號(hào)通路、Toll樣受體信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路、cAMP信號(hào)通路、NOD樣受體信號(hào)通路等。通過(guò)對(duì)溫肺疏風(fēng)方作用于哮喘的關(guān)鍵靶點(diǎn)和通路富集結(jié)果進(jìn)行綜合分析，我們發(fā)現(xiàn)溫肺疏風(fēng)方關(guān)鍵靶點(diǎn)中 JUN、MAPK1、TNF、MAPK8、RELA、MAPK14、CLCX8均在Toll樣受體信號(hào)通路中，且集中在 TLR4-NFκB/MAPK 通路上（圖 4），提示 TLR4-NFκB/MAPK通路是溫肺疏風(fēng)方對(duì)哮喘發(fā)揮抗炎作用的關(guān)鍵通路。

圖4 Toll樣受體信號(hào)通路

溫肺疏風(fēng)方由蜜麻黃、細(xì)辛、五味子、紫蘇葉等組成。研究發(fā)現(xiàn)，麻黃能降低白細(xì)胞介素-5（IL-5）、白細(xì)胞介素-13（IL-13）和白細(xì)胞介素-8（IL-8）的分泌，減輕嗜酸性粒細(xì)胞在支氣管肺泡灌洗液中的浸潤(rùn)，抑制氣道重塑［2-5］。五味子和細(xì)辛是常用的中藥藥對(duì)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，這兩種中藥的有效成分可延長(zhǎng)咳嗽潛伏期，降低咳嗽頻率［6］。五味子提取物還可以提高抗氧化水平、減少氧化損傷、抑制氣道平滑肌細(xì)胞增殖，這可能是其治療哮喘的作用機(jī)制之一［7］。據(jù)研究報(bào)道，枇杷葉有抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用［8-9］。枇杷葉注射液可以減少CD4+細(xì)胞的數(shù)量，增強(qiáng)CD8+細(xì)胞的功能，調(diào)節(jié)CD4+/CD8的失衡［10］。研究發(fā)現(xiàn)前胡可通過(guò)調(diào)節(jié)Th17/Treg細(xì)胞的失衡，減輕氣道炎癥，降低氣道高反應(yīng)性［11］。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明，橘紅可以祛痰止咳，同時(shí)有抗炎、抗氧化和免疫調(diào)節(jié)作用［12］。另外，溫肺疏風(fēng)方中的枇杷葉、防風(fēng)、紫菀也具有抗炎的作用［13-17］。綜上所述，溫肺疏風(fēng)方全方可能具有抗炎、抗氧化、減輕氣道高反應(yīng)、調(diào)節(jié)免疫及抑制氣道重塑的作用，其中抗炎是其主要作用。結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析結(jié)果，后期我們將對(duì)溫肺疏風(fēng)方通過(guò)TLR4-NFκB/MAPK通路治療哮喘的作用機(jī)制進(jìn)行驗(yàn)證。