馬源芽孢桿菌的分離與初步鑒定

周珍輝，向雙云

試驗(yàn)研究

馬源芽孢桿菌的分離與初步鑒定

周珍輝，向雙云

（北京農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院畜牧獸醫(yī)系，北京 102442）

為了從健康成年馬腸道分離芽孢桿菌，為獸用益生菌制劑的研究提供豐富的菌株來源。試驗(yàn)采用從健康成年馬糞便，使用營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基增菌培養(yǎng)后，入90 ℃ 水浴鍋中恒溫水浴20 min，將高溫處理后的肉湯培養(yǎng)物在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上進(jìn)行劃線分離，挑起單個(gè)菌落經(jīng)3～5次多次劃線分離后，獲得純菌株5株。對分離菌株的培養(yǎng)特性、形態(tài)特征、生化特性及運(yùn)動(dòng)性進(jìn)行觀察，結(jié)果表明分離菌均符合芽孢桿菌的特征，說明分離菌均為芽孢桿菌。

成年馬；芽孢桿菌；糞便；分離；鑒定

動(dòng)物腸道中益生菌的種類繁多，芽孢桿菌是其中的一大類，能產(chǎn)生蛋白酶、纖維素酶等多種消化酶及產(chǎn)生維生素、氨基酸多種營養(yǎng)物質(zhì)，促進(jìn)動(dòng)物的生長發(fā)育及免疫力的形成。益生芽孢桿菌能夠產(chǎn)生芽孢，因芽孢對外界不良環(huán)境具有強(qiáng)大的抵抗力，能抵抗胃酸進(jìn)入腸道定植，故益生芽孢桿菌在養(yǎng)殖業(yè)中應(yīng)用廣泛[1-4]。馬的腸道十分發(fā)達(dá)，盲腸是馬屬動(dòng)物的主要發(fā)酵室，含有大量的微生物，在消化中占有重要地位[5]。國內(nèi)文獻(xiàn)對豬源[6-9]、禽源[10]、山羊源[11]、牛源[12-13]腸道芽孢桿菌均有大量研究報(bào)道，但對馬源腸道芽孢桿菌的研究鮮見報(bào)道[5]。本研究旨在從健康馬糞便中分離益生芽孢桿菌，為動(dòng)物微生態(tài)制劑的開發(fā)提供菌株來源。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)用糞便 試驗(yàn)用糞便來自北京農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院畜牧場的5匹健康成年馬。5匹健康成年馬依次為汗血寶馬（學(xué)名阿哈爾捷金馬），毛色為棕黑色，原產(chǎn)于土庫曼斯坦，其糞樣命名為F1（賽馬）。安達(dá)盧西亞馬，毛色為白色，原產(chǎn)地西班牙，其糞樣命名為F2（白馬）；德保矮馬1、德保矮馬2、德保矮馬3，原產(chǎn)地中國廣西德?？h，其糞樣分別命名為F3（矮馬1）、F4（矮馬2）、F5（矮馬3）。

1.1.2 對照用菌種 馬大腸桿菌來自微生物實(shí)驗(yàn)室。

1.1.3 主要試劑 從青島高科園海博生物技術(shù)有限公司購買營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、半固體培養(yǎng)基、生化鑒定所用全部試劑等。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌分離 （1）樣品采集與處理：清晨自牧場采集F1（賽馬）、F2（白馬）、F3（矮馬1）、F4（矮馬2）、F5（矮馬3）的新鮮糞便，4 ℃ 保存?zhèn)溆?。?）增菌培養(yǎng)：無菌操作從上述5匹馬新鮮糞便的中心取糞樣適量，放入營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，用接種環(huán)打散混勻，做好標(biāo)記，置37 ℃ 恒溫培養(yǎng)4～5 d。（3）分離芽孢菌：將營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)物放入90 ℃ 水浴鍋中恒溫水浴20 min，將水浴后的培養(yǎng)物分別接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂平板培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂平板培養(yǎng)基37 ℃ 恒溫培養(yǎng)24 h后，在營養(yǎng)瓊脂平板培養(yǎng)基反復(fù)劃線分離至獲得純菌株。

1.2.2 細(xì)菌鑒定 （1）菌落及菌體形態(tài)學(xué)觀察：從健康成年馬糞便，使用營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基增菌培養(yǎng)后，入90 ℃ 水浴鍋中恒溫水浴20 min，將高溫處理后的肉湯培養(yǎng)物在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上進(jìn)行劃線分離，挑起單個(gè)菌落經(jīng)3～5次多次劃線分離后，獲得純菌株5株。仔細(xì)觀察并記錄5株菌的菌落形態(tài)。將5株純菌株分別制片革蘭氏染色后，用顯微鏡油鏡觀察細(xì)菌的形態(tài)特點(diǎn)。（2）生化試驗(yàn)：將分離的5株純菌株進(jìn)行糖發(fā)酵試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)、甲基紅試驗(yàn)、明膠液化試驗(yàn)、淀粉水解試驗(yàn)，37 ℃ 培養(yǎng)1～3 d，觀察結(jié)果。同時(shí)用大腸桿菌為對照株進(jìn)行上述生化試驗(yàn)。（3）麥康凱瓊脂平板生長試驗(yàn)：將分離純化的菌株和對照株大腸桿菌在麥康凱瓊脂平板上進(jìn)行劃線分離，37 ℃ 培養(yǎng)1～3 d，觀察結(jié)果。（4）運(yùn)動(dòng)性檢查：將分離純化的菌株和對照株大腸桿菌在半固體培養(yǎng)基穿刺接種，37 ℃ 培養(yǎng)1～3 d，觀察結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌分離結(jié)果

分離菌株在營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中生長表現(xiàn)為肉湯均勻混濁，管底有黏性沉淀，振搖后能均勻分散。分離菌株在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基形成扁平、粗糙、干燥的灰白色菌落。分離菌在麥康凱瓊脂平板培養(yǎng)基上均不生長。

2.2 細(xì)菌鑒定結(jié)果

2.2.1 菌落形態(tài) 分離菌株在營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中生長表現(xiàn)為肉湯均勻混濁。管底有黏性沉淀，振搖后測能均勻分散。F1（賽馬）、F2（白馬）、F3（矮馬1）、F4（矮馬2）、F5（矮馬3）液面形成菌膜。F1（賽馬）、F2（白馬）、F3（矮馬1）、F4（矮馬2）菌株在營養(yǎng)瓊脂平板培養(yǎng)基形成菌落特征相似，為圓形、扁平、較粗糙、干燥、表面無皺縮的灰白色菌落。F5（矮馬3）菌株在營養(yǎng)瓊脂平板培養(yǎng)基形成扁平、粗糙、干燥、表面明顯皺縮的灰白色菌落。分離菌株在營養(yǎng)瓊脂平板培養(yǎng)基上生長的菌落特點(diǎn)（圖1），符合芽孢桿菌的特征。

2.2.2 革蘭氏染色鏡檢 菌體形態(tài)可見：從F1（賽馬）、F2（白馬）、F3（矮馬1）、F4（矮馬2）、F5（矮馬3）分離到的細(xì)菌均為Ｇ＋桿菌，為長桿狀，菌體粗，菌體間形成短鏈狀，產(chǎn)生芽孢，芽孢為橢圓形，位于菌體的中央，不大于菌體。符合芽孢桿菌的特征。

2.2.3 細(xì)菌生化試驗(yàn) 5株分離菌的生化試驗(yàn)結(jié)果見表1。

圖1 分離菌株在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上生長的菌落特點(diǎn)

表1 乳酸菌生化試驗(yàn)結(jié)果

注：+表示陽性，-表示陰性。糖發(fā)酵試驗(yàn)中，+表示只產(chǎn)酸，⊕表示產(chǎn)酸產(chǎn)氣，-表示不發(fā)酵。

由表1可見，分離菌能分解葡萄糖、乳糖、蔗糖（F1不分解）、麥芽糖（F4不分解）、甘露醇和果糖，不產(chǎn)酸，不產(chǎn)生吲哚，淀粉水解試驗(yàn)陽性，明膠液化試驗(yàn)均為陰性。對照菌大腸桿菌能分解葡萄糖、乳糖、蔗糖、麥芽糖、甘露醇和果糖，并產(chǎn)酸產(chǎn)氣，產(chǎn)生吲哚，甲基紅試驗(yàn)陽性，淀粉水解試驗(yàn)和明膠液化試驗(yàn)均為陰性。分離菌的生化試驗(yàn)基本符合芽孢桿菌的特征。

2.2.4 麥康凱瓊脂平板生長試驗(yàn)結(jié)果 將分離純化的菌株在麥康凱瓊脂平板進(jìn)行劃線分離，37 ℃ 培養(yǎng)1～3 d，均無細(xì)菌生長。而對照的大腸桿菌在麥康凱瓊脂平板上生長良好，菌落呈粉紅色。

圖2 半固體培養(yǎng)基穿刺培養(yǎng)

左為分離菌；右為大腸桿菌

2.2.5 運(yùn)動(dòng)性檢查結(jié)果 在半固體培養(yǎng)基穿刺培養(yǎng)過程中，分離菌株（見圖2中左邊試管）穿刺線清晰，四周未見云霧狀擴(kuò)散生長，說明均不產(chǎn)生鞭毛，無運(yùn)動(dòng)性，符合芽孢菌的特點(diǎn)。而對照的大腸桿菌（見圖2中右邊試管）有鞭毛能運(yùn)動(dòng)，在培養(yǎng)基中沿四周呈云霧狀擴(kuò)散生長。

3 討論與結(jié)論

根據(jù)細(xì)菌分離、革蘭氏染色鏡檢、培養(yǎng)特性、生化試驗(yàn)、運(yùn)動(dòng)性檢查結(jié)果可知，分離得到的5 株腸道菌均符合芽孢桿菌的特征，故F1（賽馬）、F2（白馬）、F3（矮馬1）、F4（矮馬2）、F5（矮馬3）初步鑒定為芽孢桿菌。在后續(xù)的工作中將用16SrDNA序列分析法對所分離的細(xì)菌進(jìn)行鑒定，以確定其分類學(xué)地位。

試驗(yàn)過程中，分離的芽孢桿菌在營養(yǎng)瓊脂斜面上保存3個(gè)月后仍然存活，但大腸桿菌已經(jīng)失去活性。說明分離的芽孢桿菌生命力強(qiáng)，易于在營養(yǎng)瓊脂斜面上長期保存。為了獲得純菌株或有雜菌污染時(shí)，可用芽孢桿菌的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)物放入90 ℃ 水浴鍋中恒溫水浴20 min殺滅雜菌后再進(jìn)行培養(yǎng)即可。

在細(xì)菌分離過程中，分離的芽孢桿菌在營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂平板培養(yǎng)基等基礎(chǔ)培養(yǎng)基上生長良好，說明芽孢桿菌對營養(yǎng)要求不高，易于培養(yǎng)。分離芽孢桿菌在麥康凱瓊脂平板上不生長、半固體培養(yǎng)基上沒有運(yùn)動(dòng)性，可以和有鞭毛的大腸桿菌相區(qū)別。

在生化試驗(yàn)過程中，大腸桿菌的糖發(fā)酵試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)、甲基紅試驗(yàn)均呈陽性，淀粉水解試驗(yàn)和明膠液化試驗(yàn)均呈陰性，芽孢桿菌在糖發(fā)酵試驗(yàn)中只產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，在吲哚試驗(yàn)、甲基紅試驗(yàn)淀粉水解試驗(yàn)中均呈陰性，故以大腸桿菌作為對照菌進(jìn)行，有利于試驗(yàn)的觀察。

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（2021–06–01）

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