水晶冰菜總黃酮分級(jí)萃取及其抗氧化活性

孫美玲，馮曉光，常希光，陳湘寧*

(1.北京農(nóng)學(xué)院 食品科學(xué)與工程學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品有害微生物及農(nóng)殘安全檢測(cè)與控制北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 102206； 2.北京裕農(nóng)優(yōu)質(zhì)農(nóng)產(chǎn)品有限公司，北京 101400)

水晶冰菜 (Mesembryanthemumcrystallinum) 為番杏科 (Aizoaceae) 日中花屬 (Mesembryanthemum) 中一種一年生或二年生矮生肉質(zhì)草本植物，又稱冰葉日中花、冰草、冰花等，其原產(chǎn)自南非納米比亞沙漠等干旱地區(qū)，此后廣泛分布于加勒比海周邊、環(huán)地中海沿岸和澳大利亞西部等國(guó)家和地區(qū)，近年來才逐漸引入中國(guó)，成為了一款倍受消費(fèi)者青睞的新型綠色蔬菜[1-2]。水晶冰菜的莖葉鮮食有淡淡的咸味，具有生津止渴、清熱解毒、利濕助消化的功效[3]，含有鈉、鈣、鉀、胡蘿卜素等礦物質(zhì)和氨基酸、多酚、黃酮、抗酸化物等功能性物質(zhì)[4]，其中黃酮類化合物在生物活性方面發(fā)揮了重要作用。李婷婷[5]的研究表明：水晶冰菜總黃酮具有心血管保護(hù)功能、增強(qiáng)機(jī)體免疫力功能、抗氧化、抗腫瘤和抑菌功能等，具有廣闊的應(yīng)用前景。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

水晶冰菜購(gòu)自永旺超市(永旺國(guó)際北清路店)；亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、鹽酸、甲醇、無水乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、鄰苯三酚、水楊酸、硫酸鐵、過氧化氫均為分析純，購(gòu)自北京暢華志誠(chéng)科技有限公司。蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(HPLC≥98%)，購(gòu)自北京中科生邦有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 水晶冰菜總黃酮的制備 參考高林曉等[10]的方法稍作修改，將新鮮的水晶冰菜清洗干凈，烘干水分后碾碎，過孔徑0.25 mm的篩子得水晶冰菜干粉末。按照1∶25的料液比加入體積分?jǐn)?shù)為70%乙醇溶液，磁力攪拌30 min，在60 ℃的超聲機(jī)中以250 W的功率超聲120 min，10 000 r/min離心15 min，殘?jiān)貜?fù)提取2次，合并上清液即為水晶冰菜總黃酮粗提液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至無醇味，低溫冷凍干燥24 h，得水晶冰菜總黃酮粗提物M1(以下簡(jiǎn)稱粗提物)，稱量。

1.2.2 水晶冰菜總黃酮萃取物的制備 參考李現(xiàn)日等[11]的方法稍作修改，按照1.2.1的方法制得水晶冰菜總黃酮粗提液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至無醇味，在分液漏斗中加入等量石油醚充分搖勻，30 min后收集懸于上層的石油醚組分，下層依照上述方法重復(fù)萃取2～3次。將剩余部分按上述步驟依次用乙酸乙酯、正丁醇萃取，即得不同極性萃取組分和水相，收集相同組分分別旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)以除去有機(jī)溶劑，低溫冷凍干燥24 h，得到不同極性萃取物M2、M3、M4、M5，稱量。

1.2.3 不同極性萃取組分總黃酮含量的測(cè)定 參考荊常亮[12]的方法加以修改，采用NANO2-AL(NO3)3比色法，得到蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程：y=0.102 1x+0.000 2，R2=0.999 8。參考李亞軍[13]等的方法，按下式計(jì)算不同萃取組分中總黃酮含量：

式中，C為黃酮的質(zhì)量濃度，mg/mL；V為復(fù)溶液體積mL；W為凍干粉質(zhì)量g；Y為總黃酮的含量mg/g。

1.2.4 水晶冰菜總黃酮抗氧化活性試驗(yàn)

1)DPPH·清除率的測(cè)定。參考陳建福等[14]的方法稍作修改，將M1、M2、M3、M4、M5用去離子水配置成不同濃度的樣品溶液，以同等濃度的維生素C標(biāo)準(zhǔn)品做陽(yáng)性對(duì)照，分別測(cè)定各組樣品溶液對(duì)DPPH·的清除率。

2)·OH清除率的測(cè)定。參考李彩云等[15]的方法稍作修改，將M1、M2、M3、M4、M5用去離子水配置成不同濃度的樣品溶液，以同等濃度的維生素C標(biāo)準(zhǔn)品做陽(yáng)性對(duì)照，分別測(cè)定各組樣品溶液對(duì)·OH的清除率。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同極性萃取組分的質(zhì)量和總黃酮含量

由圖1可知，粗提物的質(zhì)量顯著高于各極性萃取組，可能是其中含有大極性的成分，各萃取組分的質(zhì)量從大到小依次為：水相、正丁醇相、乙酸乙酯相、石油醚相，該結(jié)果與李現(xiàn)日等[11]對(duì)金花葵花黃酮不同溶劑萃取物質(zhì)量的對(duì)比結(jié)果大致相同。練冬梅[17]等采用傳統(tǒng)方法測(cè)定了水晶冰菜中總黃酮成分為24.5 mg/g，本試驗(yàn)先對(duì)原料進(jìn)行反復(fù)凍融處理再用超聲輔助法提取到的黃酮含量為27.76 mg/g，這可能與原料來源不同相關(guān)；大部分原因在于試驗(yàn)方法，反復(fù)凍融處理能夠有效裂解細(xì)胞，利于細(xì)胞內(nèi)溶物的溶出，同時(shí)在超聲波產(chǎn)生的空化、振動(dòng)、粉碎等綜合效應(yīng)的影響下，植物細(xì)胞壁遭到破壞，細(xì)胞通透性增加，不僅加速黃酮類化合物成分的擴(kuò)散速度，也增加了提取溶劑的穿透能力，導(dǎo)致總黃酮提取率顯著提升[18]。由圖1折線圖走勢(shì)可知，經(jīng)不同極性溶劑萃取后各相中總黃酮含量差異顯著，其中正丁醇相中總黃酮含量最高，是粗提物總黃酮含量的1.31倍；其次是乙酸乙酯相，是粗提物的1.26倍，水相中總黃酮含量最低，該結(jié)果與余付香[19]等對(duì)趕黃草不同溶劑萃取物黃酮含量的研究結(jié)果不一致，原因可能是不同原料所含黃酮類化合物的極性部分與極性溶劑的極性不同，本試驗(yàn)結(jié)果表明水晶冰菜總黃酮的極性部分與正丁醇的極性最相似。

2.2 不同極性萃取組分對(duì)DPPH·清除率分析

由圖2可知，在0～0.12 mg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，不同極性萃取組分對(duì)DPPH·的清除能力逐漸加強(qiáng)，這也進(jìn)一步說明植物中總黃酮的抗氧化活性與其含量相關(guān)[20]。同一濃度下，不同極性萃取組分對(duì)DPPH·的清除率從大到小依次為正丁醇相、乙酸乙酯相、粗提物、石油醚相，與組分中總黃酮含量趨勢(shì)一致。當(dāng)質(zhì)量濃度為0.10 mg/mL時(shí)，各組分對(duì)DPPH·的清除率分別為83.58%、75.16%、68.32%和53.43%，而且在0.04 mg/mL時(shí)，正丁醇相和乙酸乙酯相就已經(jīng)分別達(dá)到了64.99%、60.68%的清除率，而石油醚相的清除率僅為正丁醇相的一半，原因可能是水晶冰菜不同極性萃取組分中黃酮類化合物的結(jié)構(gòu)、種類和含量存在差異。粗提物的清除率明顯低于正丁醇相和乙酸乙酯相，推測(cè)原因是粗提物中含有大量雜質(zhì)，可能會(huì)與抗氧化成分發(fā)生拮抗作用[21]。

2.3 不同極性萃取組分·OH清除率分析

由圖3可知，在0～0.12 mg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，不同極性萃取組分對(duì)·OH清除率的趨勢(shì)和DPPH·一致，而且正丁醇相的清除率和維生素C無限接近，顯著高于其余相，原因可能是該相萃取組分中還含有抗氧化能力較強(qiáng)的多糖、多酚、萜類化合物，并且純度要高于粗提物[22]。

2.4 不同極性萃取組分清除率分析

2.5 不同極性萃取組分抗氧化活性對(duì)比分析

表1 不同極性萃取組分的抗氧化活性評(píng)價(jià)Tab.1 Antioxidant activities of extracts with different polarity

3 結(jié) 論