美洲型與歐洲型PRRSV雙重RT-PCR檢測方法的建立

高 雅，武欣欣，蔣小玲，賀曉霜，肖 興*，周雙海*

(1. 北京農(nóng)學院 動物科學技術(shù)學院，北京 102206；2. 衡陽市畜牧水產(chǎn)事務中心，湖南 衡陽 421001)

豬繁殖與呼吸綜合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)是一種基因組大小約為15 kb的具有囊膜的RNA病毒，現(xiàn)有兩種血清型，即美洲型和歐洲型，兩者不僅在形態(tài)與理化方面相似，在致病性方面也基本相似，都引起同一種疾病，即豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS)，這是一種以母豬出現(xiàn)早產(chǎn)、流產(chǎn)、死產(chǎn)、產(chǎn)出木乃伊胎等繁殖障礙、仔豬與育成豬出現(xiàn)呼吸系統(tǒng)癥狀和較高病死率的危害很大的主要傳染病[1, 2]。但是，二者在全基因組核苷酸序列同源性方面僅為80%左右，顯示出很大差異[3, 4]。中國于1996年首次分離到PRRSV美洲型毒株[5]，在2010年首次分離鑒定出PRRSV歐洲型毒株[6]。PRRSV流行毒株在臨床上的多樣性給疫病的診斷和防控帶來了很大困難?，F(xiàn)階段，病毒基因分型檢測主要使用RT-PCR技術(shù)，為了提高檢測時效而多采用多重RT-PCR方法。國內(nèi)已有少量研究者建立了關(guān)于PRRSV美洲型與歐洲型毒株多重RT-PCR檢測方法，但其最低檢測都超過103copies/μL[7, 8]，這些方法的敏感性明顯不夠高，在應用于臨床檢測時會導致不少假陰性結(jié)果。因此，本研究目的是建立一種具有高敏感性的針對美洲型和歐洲型PRRSV的雙重RT-PCR檢測方法。

1 材料與方法

1.1 病毒核酸模板

美洲型PRRSV、歐洲型PRRSV和豬瘟病毒(CSFV)、豬流行性腹瀉(PEDV)、豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)等病毒核酸模板由北京農(nóng)學院動物疫病研究室保存。

1.2 病毒重組質(zhì)粒模板的構(gòu)建

比對分析PRRSV美洲型毒株、歐洲型毒株的基因序列，之后用分子生物學軟件primer5.0設(shè)計出AU與AF、EU與EF等2對特異性引物，序列分別為 AU(5′-GACACCACCACCCCCTCC-3′)與AF(5′-CGATGATGGCTTGAG CTGAGT-3′)、EU(5′-TTGACTCCGCACTCTTGCTTCT-3′)與EF(5′-GCCCGCCAACAAATCCTG-3′)，預期目的片段大小分別為650 bp與289 bp。參考文獻[9]中的方法來分別構(gòu)建美洲型PRRSV和歐洲型PRRSV基因片段重組質(zhì)粒。

1.3 單項RT-PCR方法條件篩選

單項PCR反應的基礎(chǔ)體系是：10 pmol上游引物、10 pmol下游引物、2 μL濃度為105copies/μL數(shù)量級的病毒重組質(zhì)粒模板、總體積為20 μL。單項PCR反應的基礎(chǔ)程序是：95 ℃ 200 s；95 ℃ 35 s，58 ℃ 35 s，72 ℃ 35 s，32次循環(huán)；72 ℃ 600 s。將PCR擴增產(chǎn)物置于20 g/L瓊脂糖凝膠上進行電泳檢測。以此單項PCR反應的基礎(chǔ)體系與基礎(chǔ)程序為基礎(chǔ)，從退火溫度與引物濃度兩個因素來分別篩選美洲型PRRSV和歐洲型PRRSV的單項PCR反應條件。

1.4 雙重RT-PCR方法條件篩選

綜合優(yōu)化后的美洲型PRRSV和歐洲型PRRSV的單項PCR反應條件為基礎(chǔ)，從退火溫度與引物濃度比例兩個因素來篩選美洲型PRRSV和歐洲型PRRSV的雙重PCR反應條件。

1.5 雙重RT-PCR方法的特異性與敏感性檢測

用美洲型PRRSV、歐洲型PRRSV和當前臨床比較常見的CSFV、PEDV及TGEV等3種RNA病毒的核酸作為模板，檢測此雙重RT-PCR方法的特異性。之后進行雙重RT-PCR方法的敏感性檢測，將PRRSV基因片段重組質(zhì)粒模板進行10倍梯度稀釋，美洲型質(zhì)粒濃度依次為(6.6×107)～(6.6×100) copies/μL，歐洲型質(zhì)粒濃度依次為(4.0×107)～(4.0×100)copies/μL，并將循環(huán)擴增次數(shù)增加至40次。

1.6 臨床應用檢測與統(tǒng)計分析

采集2020年北京、遼寧、湖南等地區(qū)5個豬場的200份仔豬與育成豬的血清，參考文獻[7]中的方法來提取病毒RNA與進行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，用建立的雙重RT-PCR方法來檢測美洲型PRRSV與歐洲型PRRSV，并從檢測陽性樣品中隨機選取3個來回收其RT-PCR產(chǎn)物進行克隆與測序鑒定。與此同時，用各自的單項RT-PCR方法對200份臨床樣品進行平行檢測。統(tǒng)計分析用卡方檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組質(zhì)粒構(gòu)建

以美洲型PRRSV、歐洲型PRRSV為模板，RT-PCR擴增出相應預期大小的特異性目的條帶(圖1)，分別為約650 bp、約289 bp。之后分別構(gòu)建出美洲型PRRSV與歐洲型PRRSV的基因片段重組質(zhì)粒，序列測定后的核苷酸序列比對結(jié)果顯示與各自相應的參考基因片段序列的同源性完全一致，表明兩種基因型PRRSV的基因片段重組質(zhì)粒都構(gòu)建成功。

2.2 單項RT-PCR方法條件優(yōu)化

不同退火溫度進行的單項PCR擴增結(jié)果(圖2)顯示，美洲型和歐洲型PRRSV的目的條帶分別在54～58 ℃、56～58 ℃之間較亮，故將兩者的退火溫度范圍確定為56～58 ℃。

以57 ℃為退火溫度，不同引物濃度的單項PCR擴增結(jié)果(圖3)顯示，美洲型與歐洲型PRRSV的目的條帶都是在10 pmol,15 pmol,20 pmol時較亮，故將兩者引物濃度范圍確定為10～20 pmol。

2.3 雙重RT-PCR方法的條件優(yōu)化

以優(yōu)化后的歐洲型與美洲型PRRSV的單項RT-PCR檢測方法條件為基礎(chǔ)，在56～58 ℃之間采取3個退火溫度來進行RT-PCR擴增，電泳結(jié)果(圖4)顯示在57 ℃時擴增出的兩個目的條帶相對更亮，故將57 ℃確定為最佳退火溫度。

以優(yōu)化后的歐洲型與美洲型PRRSV的單項RT-PCR檢測方法條件為基礎(chǔ)，取57 ℃為退火溫度來進行RT-PCR擴增，電泳結(jié)果(圖5)顯示，在兩者引物濃度比例為15 pmol : 15 pmol時擴增出的兩個目的條帶相對更亮，故將15 pmol : 15 pmol確定為最佳引物濃度比例。

2.4 特異性與敏感性檢測結(jié)果

以優(yōu)化后的歐洲型與美洲型PRRSV的雙重RT-PCR檢測方法條件來進行特異性檢測，從圖6可清晰看出，以CSFV,PEDV及TGEV的核酸為模板時均無任何條帶，而以歐洲型PRRSV與美洲型PRRSV的核酸為模板時則有且只有1條相符合的特異性目的條帶，說明建立的歐洲型與美洲型PRRSV的雙重RT-PCR檢測方法有良好的特異性。

以優(yōu)化后的歐洲型與美洲型PRRSV的雙重RT-PCR檢測方法條件來進行敏感性試驗，并將循環(huán)擴增次數(shù)增加為40次，結(jié)果(圖7)顯示，能夠擴增出歐洲型與美洲型PRRSV的特異目的條帶的最低濃度分別為6.6×101,4.0×101copies/μL，故確定歐洲型與美洲型PRRSV雙重RT-PCR檢測方法的靈敏度分別為66,40copies/μL。

2.5 臨床檢測結(jié)果

初步臨床檢測結(jié)果顯示，美洲型和歐洲型PRRSV的雙重RT-PCR檢出率都與其各自的單項RT-PCR檢出率完全一致，符合率都是100%。從檢測陽性樣品中隨機選取3個來回收其RT-PCR產(chǎn)物進行克隆與測序鑒定，結(jié)果顯示其核苷酸序列與預期目的片段基因的核苷酸序列的同源性都超過99%，表明此方法檢出的臨床陽性樣品是準確可靠的。同時發(fā)現(xiàn)，不管是單項RT-PCR檢測還是雙重RT-PCR檢測，美洲型PRRSV檢出率都極顯著(P<0.01)高于歐洲型PRRSV。美洲型與歐洲型PRRSV的個體陽性率分別為44.0%和0，美洲型PRRSV檢出率超過40%，說明在這些臨床樣品中美洲型PRRSV感染比較普遍。

3 討 論

豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS)是危害當前養(yǎng)豬業(yè)的一種主要疫病，其病原PRRSV存在美洲型與歐洲型之分，兩種基因型PRRSV毒株在中國現(xiàn)階段都有相關(guān)臨床報道[10]。因此，一種實用的高敏感性的能夠快速鑒別PRRSV的美洲型與歐洲型毒株的多重RT-PCR檢測方法具有良好臨床價值。

雖然多重RT-PCR方法能夠顯著提高檢測效率，但與單項RT-PCR方法相比，最需要考慮的是如何將其檢測靈敏度盡可能提高至與后者接近甚至相同。國內(nèi)已有少量關(guān)于PRRSV美洲型與歐洲型毒株多重RT-PCR檢測方法的報道，施開創(chuàng)等[7]建立的多重RT-PCR方法的最低檢測濃度1.67×103copies/μL質(zhì)粒濃度，李冰等[8]建立的多重RT-PCR方法的最低檢測濃度1.93×103copies/μL質(zhì)粒濃度?？梢钥闯?，二者的檢測靈敏度都不太高、都還有較大提升空間。本研究根據(jù)PRRSV基因組序列在ORF5基因變異較大的特點，設(shè)計不同特異性引物來區(qū)分美洲型和歐洲型毒株，根據(jù)實驗室多年來的PCR擴增經(jīng)驗，主要從退火溫度與引物濃度這兩個條件進行篩選與優(yōu)化，建立了一種PRRSV美洲型與歐洲型毒株雙重RT-PCR檢測方法。此方法對PRRSV美洲型、歐洲型毒株的檢測靈敏度分別是6.6×101、4.0×101copies/μL，達到101數(shù)量級copies/μL，不僅較國內(nèi)已有方法的103數(shù)量級copies/μL靈敏度[7, 8]提高了24～47倍，而且與各自的單項RT-PCR檢測方法一致，顯示出非常高的敏感性；初步臨床檢測顯示，兩種基因型PRRSV的雙重RT-PCR檢測結(jié)果與其各自的單項RT-PCR檢測結(jié)果也完全一致，表明在用于臨床檢測時會明顯減少假陰性結(jié)果，顯示出很高的敏感性。對當前流行相對較廣的豬瘟病毒、豬流行性腹瀉病毒等RNA病毒，不管是單項RT-PCR方法，還是雙重RT-PCR方法，都不能檢出；同時，隨機測序鑒定結(jié)果也顯示臨床檢測陽性樣品都符合此雙重RT-PCR方法的檢測結(jié)果，說明此雙重RT-PCR檢測方法具有良好特異性、完全可用于臨床檢測。由此表明，建立了1種高特異性與高敏感性的PRRSV美洲型與歐洲型雙重RT-PCR檢測方法，能夠較國內(nèi)已有方法大幅度降低檢測結(jié)果的假陰性率。

PRRSV傳入中國已有二十多年，美洲型毒株在臨床中經(jīng)常被檢出和分離鑒定，直到2010年后才有歐洲型毒株被檢出和分離鑒定的報道，之后關(guān)于歐洲型毒株的報道逐漸增多[11-12]。施開創(chuàng)等[7]報道用多重RT-PCR方法從廣西地區(qū)176份樣品中發(fā)現(xiàn)美洲型與歐洲型PRRSV的檢出率分別為25.57%和0%，李冰等[8]報道用多重RT-PCR方法從遼寧地區(qū)183份樣品中發(fā)現(xiàn)美洲型與歐洲型PRRSV的檢出率分別為18.03%和1.64%。本研究用建立的雙重RT-PCR方法檢測2020年全國部分地區(qū)的200份血清樣品后發(fā)現(xiàn)，美洲型PRRSV的陽性率為44%，歐洲型PRRSV的陽性率為0%。不同研究者報道的歐洲型與美洲型PRRSV的臨床檢出率不盡一致，這可能與臨床樣品的采集時間與地區(qū)等因素有關(guān)。綜合已有報道數(shù)據(jù)來看，美洲型PRRSV的臨床感染普遍顯著高于歐洲型PRRSV感染，部分地區(qū)的歐洲型PRRSV感染率甚至為0，提示當前國內(nèi)對PRRS的防控重點仍然要著力于美洲型PRRSV。