基于轉(zhuǎn)錄組信息的葉用萵苣MADS-box轉(zhuǎn)錄因子家族分析

郝新迪，許夢男，董波波，陳 麗，劉超杰，范雙喜，韓瑩琰

(北京農(nóng)學(xué)院 植物科學(xué)技術(shù)學(xué)院/農(nóng)業(yè)應(yīng)用新技術(shù)北京市重點實驗室，北京 102206)

葉用萵苣(LactucasativaL.)，俗稱生菜，是北京地區(qū)種植面積最大的葉類蔬菜，其性喜冷涼氣候，夏季高溫造成“先期抽薹”，嚴重影響食用品質(zhì)和商品價值[1,2]。抽薹開花是植物從營養(yǎng)生長向生殖生長轉(zhuǎn)變的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，稱為成花轉(zhuǎn)變。植物成花轉(zhuǎn)變時間受到復(fù)雜的遺傳調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的嚴格控制，到目前為止，在模式植物擬南芥中，已經(jīng)確定了春化途徑、自主途徑、環(huán)境溫度途徑、赤霉素途徑、光周期途徑、年齡途徑和糖途徑等7條控制開花的遺傳途徑[3,4]，這7條途徑彼此獨立又相互交織，它們激活了一套開花途徑整合子基因[包括MADS-box家族基因SUPPRESSOROFOVEREXPRESSIONOFCONSTANS(SOC1)和AGAMOUS-LIKE24(AGL24)]，進而激活花分生組織特征基因[包含MADS-box家族基因APETALA1(AP1)，CAULIFLOWER(CAL)和FRUITFULL(FUL)]，最終啟動擬南芥開花[4-6]。在擬南芥光誘導(dǎo)開花途徑中，CONSTANS(CO)在擬南芥韌皮部伴細胞中表達并激活FT在葉片維管組織中表達，隨后FT轉(zhuǎn)運至頂端分生組織中激活FUL和SOC1在莖頂端分生組織中表達，從而開啟花發(fā)育[7,8]。此外，春化途徑通過抑制MADS-box基因FLOWERINGLOCUSC(FLC)表達來激活開花[3]。與擬南芥、大白菜、甘藍、蘿卜等“低溫春化”型蔬菜不同，葉用萵苣從種子發(fā)芽到花芽分化前的高溫環(huán)境關(guān)系到其花芽形成從而影響抽薹，氣溫越高抽薹越早[9]。前期研究發(fā)現(xiàn)赤霉素調(diào)節(jié)葉用萵苣的抽薹，但也許是MADS-box基因，而不是赤霉素，在表現(xiàn)不同抽薹效果中起到重要作用[10]。

目前，關(guān)于葉用萵苣MADS-box基因的研究鮮有報道。前期課題組研究過程中在葉用萵苣基因組中共鑒定了82個MADS-box家族基因[11]，后續(xù)利用2個具有高溫抽薹性差異的品種：耐抽薹品種‘S24’和易抽薹品種‘S39’進行轉(zhuǎn)錄組分析，發(fā)現(xiàn)9個促進開花的MADS-box家族基因被特異性誘導(dǎo)[10]。對高溫和常溫下生長的品種‘S39’進行轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)5個MADS-box基因差異表達[12]。

本研究對葉用萵苣中上述14個MADS-box家族轉(zhuǎn)錄因子進行鑒定分析，以葉用萵苣品種‘S39’為試驗材料，采用qRT-PCR技術(shù)檢測在高溫處理下14個MADS-box家族基因的表達模式，篩選在葉用萵苣高溫抽薹過程中發(fā)揮重要作用的MADS-box家族基因。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與處理

以葉用萵苣早抽薹品種‘S39’為試驗材料。將種子催芽24 h 后播種于50孔穴盤(草炭∶珍珠巖∶蛭石=3∶2∶1)中，在人工氣候室中生長，1周后定植于直徑10 cm營養(yǎng)缽中：白天25 ℃，夜晚15 ℃，光照強度12000 lx，光照時間16 h/d，相對濕度為60%；，植株生長至5葉1心時進行高溫處理：白天35 ℃，夜晚25 ℃，其余條件不變。高溫處理1 d，3 d，5 d，7 d，9 d，11 d，13 d，15 d后分別隨機選取3株長勢一致的幼苗，取其第4片真葉，液氮速凍后-80 ℃保存。

1.2 試驗方法

1.2.1 葉用萵苣MADS-box家族轉(zhuǎn)錄因子的篩選和理化性質(zhì)分析 基于實驗室已有的轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)[10,11]，篩選到14個差異表達的MADS-box家族轉(zhuǎn)錄因子，利用DNAMAN將14個MADS-box轉(zhuǎn)錄因子序列比對到此前課題組鑒定的82個MADS-box轉(zhuǎn)錄因子序列中[9]，采用ExPASy ProtParam(https://web.expasy.org/protparam/)在線工具預(yù)測葉用萵苣MADS-box蛋白理化性質(zhì)，采用在線網(wǎng)站 Cell-PLoc 2.0 (http://www.csbio.sjtu.edu.cn/cgi-bin/PlantmPLoc.cgi)預(yù)測亞細胞定位。

1.2.2 樣品總RNA提取和反轉(zhuǎn)錄 葉用萵苣總RNA提取參照快速通用植物RNA提取試劑盒(北京興華越洋生物科技有限公司)說明書。利用Thermo NanoDrop2000紫外分光光度計檢測 RNA樣品濃度；用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測 RNA 質(zhì)量。總RNA反轉(zhuǎn)錄參照TransScript?One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix試劑盒(北京全式金生物技術(shù)有限公司)說明書。

1.2.3 qRT-PCR 以高溫處理1 d，3 d，5 d，7 d，9 d，11 d，13 d，15 d后葉用萵苣‘S39’葉片cDNA為模板，利用Primer 5.0 設(shè)計引物(表1)，以葉用萵苣18SribosomalRNA(HMO047292.1)為內(nèi)參基因(表1)。使用 TB Green?Premix Ex TaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus)試劑盒(北京寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司)進行qRT-PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系10 μL，包括5 μL TB Green?Premix Ex TaqⅡ(Tli RNaseH Plus)，2 μL ddH2O，1 μL cDNA模板，上、下游引物各1 μL。反應(yīng)程序為：95 ℃ 3 min；95 ℃ 10 s，56 ℃ 30 s，共39個循環(huán)。反應(yīng)在Bio-Rad CFX96實時熒光定量PCR儀上進行。每個樣本設(shè)置3次重復(fù)。采用2-△△Ct法計算基因的相對表達量。

表1 引物序列Tab.1 Primers for sequences

2 結(jié)果與分析

2.1 相關(guān)MADS-box基因的篩選和理化性質(zhì)分析

根據(jù)實驗室前期轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析，對MADS-box相關(guān)基因功能和亞細胞定位進行預(yù)測，發(fā)現(xiàn)9個MADS-box基因在‘S24’和‘S39’中差異表達(表2)，5個MADS-box基因在常溫和高溫處理下的‘S39’中差異表達(表3)。

表2 ‘S39’中9個上調(diào)的MADS-box基因[10]Tab.2 List of 9 MADS-box genes that were significantly up-regulated in lettuce line ‘S39’

表3 高溫下‘S39’莖尖中5個上調(diào)的MADS-box基因[12]

利用ExPASy protparam tool對14個葉用萵苣MADS-box蛋白進行理化性質(zhì)分析，由表4可知，14個MADS-box編碼蛋白的氨基酸數(shù)量為212(LsMADS39和LsMADS45)～253(LsMADS14)個，理論等電點范圍為5.27(LsMADS39)～9.44(LsMADS32)，表明不同的MADS-box家族蛋白質(zhì)在不同的微環(huán)境中發(fā)揮的功能存在差異。除LsMADS16和LsMADS39為穩(wěn)定蛋白外，其余均屬于不穩(wěn)定蛋白(不穩(wěn)定系數(shù)小于40為穩(wěn)定蛋白)。14個MAD-box蛋白的脂肪系數(shù)為71.36(LsMADS48)～92.88(LsMADS39)，均小于100，平均親水性均小于0，為親水性蛋白。通過在線軟件Cell-PLoc 2.0對14個MADS-box基因家族成員的氨基酸序列進行亞細胞定位預(yù)測，結(jié)果顯示14個MADS-box家族蛋白均定位于細胞核內(nèi)。

表4 14個葉用萵苣MADS-box基因理化性質(zhì)分析Tab.4 Analysis of physicochemical properties of 14 MADS-box genesin lettuce

2.2 對MADS-box相關(guān)基因進行qRT-PCR分析

在葉用萵苣‘S39’中不同時間高溫處理下，MADS-box相關(guān)基因表達量如圖1所示，LsMADS32表達量無顯著規(guī)律；LsMADS16和LsMADS37表達總體呈下降趨勢；LsMADS5，LsMADS14，LsMADS15，LsMADS29，LsMADS35，LsMADS39，LsMADS43，LsMADS45，LsMADS48，LsMADS54和LsMADS56表達趨勢基本相同，呈先上升后下降趨勢，LsMADS15在高溫處理7 d后達到峰值，其他基因在高溫處理5 d后達到峰值，其中LsMADS54在高溫處理5 d后驟升1 000倍，LsMADS56在高溫處理5 d后驟升70倍。

3 討 論

MADS-box是一類重要的轉(zhuǎn)錄因子，在植物根[13]和葉片[14]發(fā)育、果實發(fā)育[15]和成熟[16,17]、開花和花發(fā)育[11]等生長發(fā)育過程和逆境脅迫[18]中發(fā)揮著重要作用。前期課題組研究發(fā)現(xiàn)，在易抽薹品種‘S39’中9個MADS-box相關(guān)基因能夠明顯的誘導(dǎo)開花，這表明MADS-box基因在表現(xiàn)不同抽薹效果中可能起到重要作用[10]。

本研究通過對葉用萵苣轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行挖掘，共鑒定出14個與高溫促進抽薹相關(guān)的MADS-box家族轉(zhuǎn)錄因子。理化性質(zhì)研究結(jié)果表明，不同MADS-box蛋白的理化性質(zhì)存在一定差異，說明其發(fā)揮的生物學(xué)功能也不相同。亞細胞定位預(yù)測結(jié)果顯示14個MADS-box蛋白均定位于細胞核，這符合其作為轉(zhuǎn)錄因子的特征，可能通過調(diào)控細胞核基因的轉(zhuǎn)錄來發(fā)揮其功能[19]。

本研究通過對14個葉用萵苣中MADS-box相關(guān)基因在高溫處理下的表達量分析得出：LsMADS32表達量無顯著規(guī)律，推測其與葉用萵苣高溫抽薹無關(guān)；LsMADS16和LsMADS37表達總體呈下降趨勢，推測其對葉用萵苣高溫抽薹具有負調(diào)控作用；LsMADS5，LsMADS14，LsMADS15，LsMADS29，LsMADS35，LsMADS39，LsMADS43，LsMADS45，LsMADS48，LsMADS54和LsMADS56表達呈先上升后下降趨勢，LsMADS15在高溫處理7 d后達到峰值，其他基因在高溫處理5 d后達到峰值，其響應(yīng)高溫脅迫的表達模式與‘S39’在高溫處理后7 d左右頂端分生組織呈拱形狀，隨后發(fā)生從營養(yǎng)生長向生殖生長轉(zhuǎn)變的細胞學(xué)觀察結(jié)果一致[12,20]。LsMADS54在高溫處理5 d后驟升1 000倍，LsMADS56在高溫處理5 d后驟升70倍，推測其為葉用萵苣響應(yīng)高溫誘導(dǎo)后抽薹開花調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵基因。

綜上所述，本研究分析了高溫處理下14個葉用萵苣高溫促進抽薹的相關(guān)MADS-box基因的表達模式，發(fā)現(xiàn)LsMADS54和LsMADS56可能在葉用萵苣響應(yīng)高溫誘導(dǎo)后抽薹開花中起關(guān)鍵作用，但其作用機制還有待進一步研究。