基因組編輯技術(shù)在水稻育種中的應(yīng)用進(jìn)展

陳 峰，朱文銀，焦曉真，姜明松，張士永，周學(xué)標(biāo)，徐建第*

（1.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院濕地農(nóng)業(yè)與生態(tài)研究所，山東 濟(jì)南 250100；2.中國水稻研究所，浙江 杭州 311006）

基因組編輯技術(shù)已經(jīng)在單子葉模式作物水稻中得到成功應(yīng)用，主要包括鋅指核酸酶（ZFNs）系統(tǒng)、類轉(zhuǎn)錄激活效應(yīng)因子核酸酶（TALEN）系統(tǒng)、成簇規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列/核酸內(nèi)切酶（CRISPR/Cas）系統(tǒng)以及近年來快速發(fā)展的單堿基編輯技術(shù)[1]。

利用基因組編輯技術(shù)可實(shí)現(xiàn)對基因組的高效精準(zhǔn)修飾，其巨大的技術(shù)優(yōu)勢將會成為現(xiàn)代作物育種和農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研發(fā)的一項(xiàng)革命，成為作物遺傳育種研究的重要手段[2]。水稻是主要的糧食作物以及重要的單子葉模式作物，基因組編輯技術(shù)已成為水稻農(nóng)藝性狀改良及基因功能研究的重要手段。本文介紹了基因組編輯技術(shù)及其在水稻性狀改良與基因功能研究中的應(yīng)用進(jìn)展。

1 基因組編輯技術(shù)概述

鋅指核酸酶（ZFNs）[3]和類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶（TALENs）[4]最先被應(yīng)用于基因組定點(diǎn)編輯。ZFN特異性較低，并且操作較為繁瑣，費(fèi)用較高。TALEN技術(shù)與ZFN相比，操作較為簡單、成本較低。

CRISPR/Cas9系統(tǒng)是通過一段向?qū)NA和配套的核酸酶對特定的基因組序列進(jìn)行定點(diǎn)編輯。CRISPR/Cas9具有載體構(gòu)建簡單易行、成本低、能夠?qū)崿F(xiàn)多個(gè)靶點(diǎn)的同時(shí)定點(diǎn)編輯以及效率高等優(yōu)點(diǎn)。Hu等對spCas9蛋白進(jìn)行了改進(jìn)，改進(jìn)后可以識別不同的原間隔基序結(jié)構(gòu)（protospacer adjacent motif,PAM），使CRISPR/Cas9系統(tǒng)能識別范圍更為廣泛的靶點(diǎn)[5]。表1列出了3種工程核酸酶的特點(diǎn)。

表1 3種工程核酸酶ZFN、TELEN、CRISPR/Cas9的比較

Zetsche等研究發(fā)現(xiàn)，Cpf1核酸內(nèi)切酶包括AsCpf1、FnCpf1和LbCpf1 3種[6]。相比于CRISPR/Cas9系統(tǒng)，Cpf1更簡單、更小、更容易進(jìn)入細(xì)胞；Cpf1的PAM是靶序列為5′端連續(xù)的2個(gè)或3個(gè)胸腺嘧啶（T），擴(kuò)大了基因組編輯的范圍；Cpf1不僅可以切割DNA，還可以切割RNA，有利于構(gòu)建多基因編輯的載體。

Komor等開發(fā)了3種不同的堿基編輯器，分別是胞嘧啶堿基編輯器（cytosine base editor,CBE）、腺嘌呤堿基編輯器（adenine base editor,ABE）和先導(dǎo)編輯器（prime editor），這些堿基編輯器在工作時(shí)不依賴雙鏈DNA斷裂（double strand breaks,DSB）的產(chǎn)生，也不需要供體DNA的參與[7]。朱健康團(tuán)隊(duì)在水稻中首次應(yīng)用了腺嘌呤堿基編輯器（ABE）[8]，利用用于大腸桿菌的ABE結(jié)構(gòu)能顯著提高腺嘌呤堿基編輯器在水稻中的編輯效率[9]。

2 基因組編輯技術(shù)在水稻遺傳育種中的應(yīng)用

利用基因編輯技術(shù)對水稻進(jìn)行改良，在保證其原有優(yōu)良性狀的基礎(chǔ)上，可以快速獲得具有高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、多抗等優(yōu)良性狀的水稻種質(zhì)。

TALEN技術(shù)可以用于水稻抗病及優(yōu)質(zhì)材料的創(chuàng)制。Li等應(yīng)用TALEN技術(shù)對蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因OsSWEET14啟動子區(qū)與白葉枯病原菌效應(yīng)蛋白結(jié)合順式元件定點(diǎn)突變，降低OsSWEET14的啟動子與白葉枯病原菌分泌的效應(yīng)蛋白的結(jié)合能力，獲得了對白葉枯病原菌的抗性[10]。Cai等利用TALEN技術(shù)編輯Os09g29100基因啟動子中的Tal7結(jié)合位點(diǎn)，提高了水稻細(xì)菌性條斑病的抗性[11]。Shan等在水稻原生質(zhì)體及愈傷組織中共轉(zhuǎn)化2對TALENs，實(shí)現(xiàn)了OsBADH2a和OsBADH2 b2個(gè)基因雙突變，得到了同一染色體上2個(gè)位點(diǎn)間大片段缺失的突變體[12]。

在水稻品質(zhì)性狀編輯方面，利用CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了直鏈淀粉含量、香味等基因的突變。周鑫等利用CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)，獲得了新型糯稻種質(zhì)[13-15]。Huang等挖掘出一個(gè)稀有Wx等位基因waxyabe2，利用2種堿基編輯系統(tǒng)（ABE-NG和CBE-NG），獲得了直鏈淀粉含量（amylose content,AC)范圍為0.30%～29.43%（野生型對照為19.87%）的一系列新的Wx等位基因，其中waxyabe2等位基因編碼的GBSSI蛋白上第237位氨基酸由T突變?yōu)锳，使稻米表現(xiàn)出“軟米”的表型，改善了蒸煮食味品質(zhì)（eating and cooking quality，ECQ）和外觀品質(zhì)[16]。Huang等通過CRISPR/Cas9技術(shù)編輯Wx基因啟動子上的關(guān)鍵順式作用元件，創(chuàng)制了多個(gè)可微調(diào)直鏈淀粉含量的新Wx等位基因，為水稻優(yōu)質(zhì)育種提供了新種質(zhì)與新方法[17]。邵高能等通過CRISPR/Cas9技術(shù)對香味基因Badh2進(jìn)行了編輯，實(shí)現(xiàn)對稻米香味性狀的定向改良[18-21]。周文甲等利用CRISPR/Cas9技術(shù)對綏粳14的抽穗期基因Hd2、香味基因Badh2進(jìn)行編輯，獲得了抽穗期縮短的香稻種質(zhì)[22]。

利用CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)創(chuàng)制了多種水稻株型發(fā)育及產(chǎn)量相關(guān)性狀的突變材料。Miao等通過密碼子優(yōu)化Cas9蛋白在水稻中高效獲得了葉綠素合成基因CAO1和分蘗夾角控制基因LAZYJ突變的植株[23]。Shan等對水稻不同性狀的多個(gè)基因進(jìn)行突變，包括OsBADH2、OsDEP1、OsCKX2、OsSD1，獲得了可以用于水稻育種的種質(zhì)材料[24]。Feng等對水稻ROC5、OsWaxy基因進(jìn)行突變，創(chuàng)制出卷葉及糯性種質(zhì)[25]。盛夏冰等利用CRISPR/Cas9技術(shù)對水稻落粒性主效基因qSH1定點(diǎn)編輯，降低了受體品種的落粒性[26]。Huang等通過CRISPR/Cas9技術(shù)對水稻高產(chǎn)基因（Gn1a和DEP1）進(jìn)行編輯，對Gn1a和DEP1基因隨機(jī)突變進(jìn)行表型篩選，獲得了多個(gè)高產(chǎn)Gn1a和DEP1等位基因[27]。王加峰等應(yīng)用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對調(diào)控水稻產(chǎn)量基因TGW6定點(diǎn)編輯，部分tgw6的缺失突變能顯著提高千粒質(zhì)量（幅度大于5%），為水稻的高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)奠定了重要的材料基礎(chǔ)[28]。沈蘭等利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)，構(gòu)建了共敲除載體pC1300-2×35S::Cas9-gGS3-gGn1a，成功地實(shí)現(xiàn)了對粒型基因GS3和每穗粒數(shù)基因Gn1a的定點(diǎn)編輯[29]。孟帥等利用CRISPR/Cas9技術(shù)編輯粒長基因GS3，獲得了花時(shí)早于短粒粳稻野生型的材料[30]。張浩等利用CRISPR/Cas9技術(shù)編輯DTH8基因改良了粳稻99-25的抽穗期，獲得了抽穗期提前的DTH8突變體材料[31]。胡雪嬌等利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)，以SD1基因?yàn)榘谢?，?gòu)建基因編輯載體CRISPR-SD1，定向改良了恢復(fù)系申繁17和申繁24的株高[32]。

利用CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)創(chuàng)制了多種水稻抗病突變材料，為水稻抗性改良提供了種質(zhì)。卿冬進(jìn)等利用CRISPR/Cas9基因編輯方法敲除水稻恢復(fù)系“GH998”的Bsr-d1基因，獲得無轉(zhuǎn)基因成分的純合突變株系，為進(jìn)一步研究Bsr-d1基因在雜交水稻上的功能提供了理論依據(jù)和種質(zhì)資源[33]。劉維等利用CRISPR/Cas9技術(shù)，靶向編輯抗病基因OsCOL9的CDS起始區(qū)域以及外顯子末端，在T1代獲得了類型豐富的OsCOL9（CONSTANS-Like 9）突變體，為水稻抗病育種奠定了重要材料基礎(chǔ)[34]。徐鵬應(yīng)用CRISPR/Cas9系統(tǒng)，以稻瘟病抗性基因Pita、Pi21和ERF922為靶基因，構(gòu)建共編輯載體，獲得了具有較高稻瘟病抗性的長粒粳稻恢復(fù)系L1014純合突變株系，為稻瘟病抗性改良提供了良好的材料[35]。楊海河等應(yīng)用CRISPR/Cas9技術(shù)對日本晴稻瘟病基因pi21進(jìn)行編輯，獲得了pi21隱性突變株系，稻瘟病抗性得到提高[36]。王芳權(quán)等針對Pi21基因的2個(gè)靶位點(diǎn)構(gòu)建基因敲除載體，轉(zhuǎn)化南粳9108，利用CRISPR/Cas9技術(shù)成功敲除了水稻Pi21基因，為培育廣譜抗稻瘟病的水稻新品系奠定了基礎(chǔ)[37]。Wang等利用CRISPR/Cas9技術(shù)編輯編碼AP2/ERF類轉(zhuǎn)錄因子的基因OsERF922，獲得了抗稻瘟病空育131株系[38]。

利用CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)創(chuàng)制了抗除草劑、低鎘積累種質(zhì)。Li等利用CRISPR/Cas9技術(shù)對5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶基因OsEPSPS進(jìn)行編輯，獲得了具有草甘膦除草劑抗性的水稻種質(zhì)[39]。Sun等利用CRISPR/Cas9技術(shù)對乙酰乳酸合酶基因OsJiS進(jìn)行了定點(diǎn)編輯，獲得了抗嘧啶羧酸類除草劑的水稻種質(zhì)[40]。Xu等應(yīng)用CRISPR/Cas9系統(tǒng)編輯苯達(dá)松抗性基因BEL，獲得了對苯達(dá)松敏感的水稻材料[41]。Tang等利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)，敲除金屬轉(zhuǎn)運(yùn)基因OsNramp5，創(chuàng)制出低鎘積累秈稻新種質(zhì)[42]。

另外，CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)在水稻生長發(fā)育調(diào)控的分子機(jī)制方面也取得了重要進(jìn)展。楊宏等根據(jù)OsSUTs基因序列信息設(shè)計(jì)靶位點(diǎn)，構(gòu)建CRISPR/Cas9載體，獲得5個(gè)OsSUTs基因的陽性敲除苗，為研究OsSUTs基因的分子功能及其調(diào)節(jié)關(guān)系提供了良好材料[43]。彭廷等利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)，得到miR1866的CRISPR/Cas9表達(dá)載體，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法導(dǎo)入日本晴，研究了miR1866對水稻生長發(fā)育的調(diào)節(jié)作用，對研究miRNA調(diào)控途徑和分子機(jī)制具有重要的意義[44]。陳會杰等利用CRISPR/Cas9技術(shù)原理，構(gòu)制PHYB的CRISPR/Cas9表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化粳稻品種日本晴，對PHYB基因進(jìn)行了定點(diǎn)編輯，為進(jìn)一步研究PHYB在水稻中的功能提供了依據(jù)[45]。黃小貞等利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)，分別構(gòu)建TIFYlb及其同源基因TIFYla（LOC_Os03g47970）的單基因和雙基因敲除載體，成功實(shí)現(xiàn)了轉(zhuǎn)錄因子TIFYla和TIFYlb的基因編輯，獲得不同類型單基因突變株系以及雙基因突變株系，為研究TIFY1響應(yīng)低溫應(yīng)答的機(jī)制提供了依據(jù)[46]。張宗飛等采用CRISPR/Cas9技術(shù)，成功創(chuàng)建了2個(gè)已鑒定了的水稻果糖激酶OsFRK家族基因的敲除突變體，為研究OsFRK1和OsFRK2的生物學(xué)功能提供了材料[47]。沈蘭等利用CRISPR/Cas9多基因編輯系統(tǒng)成功構(gòu)建共敲除水稻中8個(gè)農(nóng)藝性狀基因的載體，還在T0代獲得了純合的六突突變株、七突突變株、八突突變株，表明CRISPR/Cas9系統(tǒng)在作物育種過程中可快速引入遺傳多樣性[48]。中國水稻研究所王克劍團(tuán)隊(duì)利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)在雜交水稻春優(yōu)84中同時(shí)敲除PAIR1、REC8、OSD1和MTL4個(gè)生殖相關(guān)基因，得到了雜交稻的克隆種子，完成了雜合基因型的固定，實(shí)現(xiàn)了雜交稻無融合生殖從0到1的關(guān)鍵突破，具有重要的理論和實(shí)踐意義[49]。

3 問題與展望

以CRISPR/Cas9系統(tǒng)為代表的基因組編輯技術(shù)提高了作物定向遺傳改良效率，廣泛地應(yīng)用于作物的精準(zhǔn)遺傳改良。當(dāng)然，基因組編輯技術(shù)也面臨技術(shù)以及監(jiān)管方面的一些問題，目前的研究多局限于理論研究及新材料的創(chuàng)制，隨著基因組編輯技術(shù)的完善可望在生產(chǎn)應(yīng)用方面發(fā)揮重要作用。

3.1 擴(kuò)大基因組編輯范圍

最常用的Cas9來自于產(chǎn)胺鏈球菌（Streptococcus pyogenes），被稱為SpCas9。SpCas9能夠識別的PAM序列主要是NGG，限制了CRISPR/Cas9系統(tǒng)在基因組的可編輯范圍[50]。Hu等通過定點(diǎn)突變的方法對SpCas9蛋白進(jìn)行改造，獲得2種SpCas9變體VQR和VRER，可以識別NGA以及NGCG 2個(gè)PAM序列，在水稻中可編輯范圍拓展到現(xiàn)有的2倍以上，2種變體也可以同時(shí)對多基因進(jìn)行有效的編輯，為進(jìn)行更廣泛的基因組編輯提供了新的可選工具[5]。辛高偉等利用改進(jìn)后的CRISPR/VQR系統(tǒng)對水稻中3個(gè)相對低效的VQR靶位點(diǎn)NAL1-Q1、NAL1-Q2和LPA1-Q進(jìn)行了編輯，結(jié)果表明，改進(jìn)的CRISPR/VQR系統(tǒng)可以高效編輯NGAC PAM位點(diǎn)，并產(chǎn)生豐富的突變類型[51]。這為水稻及其他植物相關(guān)基因NGAC PAM位點(diǎn)的編輯提供了理論依據(jù)。

Zetsche等通過生物信息學(xué)手段發(fā)現(xiàn)了新的V型CRISPR基因編輯系統(tǒng)CRISPR/Cpf1，有效地?cái)U(kuò)展了基因組編輯范圍[6]。研究結(jié)果表明，CRISPR/Cpf1在植物基因組編輯上具有廣闊的應(yīng)用前景。除了SpCas9，還有一些不同來源的CRISPR/Cas系統(tǒng)，也具有基因編輯能力[45]。

3.2 無外源DNA污染的植物基因編輯技術(shù)應(yīng)用

常規(guī)植物基因組編輯手段存在脫靶效應(yīng)及外源DNA污染的風(fēng)險(xiǎn)[50]。Woo等將Cas9蛋白和gRNA在體外組裝成核糖核蛋白復(fù)合體，再通過聚乙二醇轉(zhuǎn)化法將核糖核蛋白復(fù)合體轉(zhuǎn)入原生質(zhì)體，成功對目的基因進(jìn)行了編輯，T0代獲得了無外源DNA殘留的基因編輯植株[52]。Liu等報(bào)道了一種對外源成份進(jìn)行精確分析的工具FED（foreign element detector），有望為全球基因組編輯生物的應(yīng)用和安全監(jiān)管提供重要工具平臺[53]。

3.3 監(jiān)管政策方面的問題

基因編輯技術(shù)的出現(xiàn)為作物分子育種提供了極好的機(jī)遇，但對于基因編輯作物是否屬于轉(zhuǎn)基因生物，目前國際上尚未有明確一致的定論，其監(jiān)管標(biāo)準(zhǔn)存在較大爭議[54]。美國農(nóng)業(yè)監(jiān)管部門認(rèn)為，基因編輯作物是通過細(xì)胞自我修復(fù)機(jī)制產(chǎn)生的突變體，不被定義為轉(zhuǎn)基因生物[55]。2020年6月，美國農(nóng)業(yè)部給出了對基因編輯技術(shù)的支持性指南，可通過監(jiān)管豁免和未來豁免決定監(jiān)管狀況程序來監(jiān)管基因編輯產(chǎn)品。截止到2020年底，美國農(nóng)業(yè)部已批準(zhǔn)了70種以上的基因編輯作物，不再額外實(shí)施監(jiān)管。除美國以外，采用類似政策的國家有加拿大、巴西、阿根廷、澳大利亞、智利、哥倫比亞、以色列等。日本和俄羅斯原本都是反對轉(zhuǎn)基因作物種植的國家，但都對基因編輯技術(shù)持積極態(tài)度。2020年，日本批準(zhǔn)其國內(nèi)第一個(gè)基因編輯西紅柿可以商業(yè)化生產(chǎn)和食用。

鑒于基因編輯技術(shù)在農(nóng)業(yè)生物育種中的巨大優(yōu)勢和潛力，建議相關(guān)部門加強(qiáng)基因編輯作物研發(fā)支持力度，同時(shí)盡快出臺更科學(xué)合理的基因編輯作物監(jiān)管政策，從而有序推進(jìn)生物育種產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用。