不同Sap酶活性的白假絲酵母菌對陰道上皮細(xì)胞表達(dá)NLRP3炎性小體的影響

侯夢瑤，邵明琨，羅丹丹，祁文瑾

外陰陰道假絲酵母菌病(vulvovaginal candidiasis, VVC)是由假絲酵母菌引起的女性下生殖道最常見的感染性疾病之一，居女性生殖道炎癥第二位病因，白假絲酵母菌是最常見的致病菌種，屬于機(jī)會致病菌，健康狀態(tài)下，在陰道的微環(huán)境中與宿主和其他局部微生物群處于共生狀態(tài)，其中某個因素改變都容易導(dǎo)致平衡被打破，假絲酵母菌由酵母相變?yōu)榫z相而致病，對陰道黏膜造成損傷。陰道局部免疫系統(tǒng)被激活，發(fā)動先天性和適應(yīng)性免疫保護(hù)機(jī)體。核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3[nucleotide-binding oligomerization domain (NOD)-like receptor family pyrin domain containing 3, NLRP3]炎性小體就是其中關(guān)鍵的因子，可以被白假絲酵母菌的主要毒力因子之一分泌型天冬氨酸蛋白酶(secreted of aspartic proteases, Sap)所激活。它是一種蛋白復(fù)合體，屬于機(jī)體先天免疫的一部分。當(dāng)受到損傷因子刺激后，NLRP3蛋白與銜接子凋亡相關(guān)斑點樣蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing a caspase activation and recruitment domain, ASC)相互作用啟動炎性小體形成，ASC同時募集并激活效應(yīng)子半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶-1(cysteiny aspartate specific protease-1, caspase-1)前體以產(chǎn)生活性的caspase-1，caspase-1剪切白細(xì)胞介素(interleukin, IL)-1β前體和IL-18前體形成具有生物學(xué)活性的IL-1β和IL-18，從而觸發(fā)一系列的炎癥反應(yīng)。該研究主要探索不同Sap酶活性的白假絲酵母菌對人和小鼠陰道上皮細(xì)胞表達(dá)NLRP3炎性小體、IL-1β和IL-18的影響，期望能為進(jìn)一步明確VVC的發(fā)病機(jī)制提供新的研究理論。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

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生物材料 白假絲酵母菌來源于昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科門診的VVC患者；人陰道上皮組織來自同一醫(yī)院的婦科子宮肌瘤或子宮腺肌癥行全子宮切除患者，患者未絕經(jīng)且既往身體健康，以上均取得患者知情同意，通過本院倫理委員會批準(zhǔn)。小鼠購自昆明醫(yī)科大學(xué)SPF動物房，雌性昆明小鼠，6～8周齡，體質(zhì)量22～28 g。

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主要試劑 沙堡羅氯霉素培養(yǎng)基(法國生物梅里埃公司)；念珠菌顯色平板(上海安圖生物公司)；無菌脫脂奶粉(上海生物工程股份有限公司)；角化細(xì)胞無血清培養(yǎng)基(K-SFM，美國Gibco公司)； DMEM/F12完全培養(yǎng)基(美國Gibco公司)；中性蛋白酶(DispaseⅡ，美國Sigma公司)；胰酶(美國Gibco公司)；NLRP3炎性小體抗體(anti-NLRP3 antibody，杭州華安生物技術(shù)有限公司)；牛血清白蛋白V(美國Solarbio公司)；免疫熒光二抗、DAPI(美國Invitrogen公司)；人IL-1β、IL-18 ELISA試劑盒及小鼠IL-1β、IL-18 ELISA試劑盒(深圳欣博盛科技有限公司)；改良HE染色試劑盒(美國Solarbio公司)。

1.2 實驗方法

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假絲酵母菌純化、菌種鑒定及Sap酶活性檢測 純化：用無菌棉拭子將VVC患者陰道分泌物接種到沙堡羅培養(yǎng)皿上，培養(yǎng)48 h后分離單菌落擴(kuò)增保存。菌種鑒定：嚴(yán)格按安圖念珠菌顯色平板說明書進(jìn)行鑒定。Sap酶活性測定：將配成5×10CFU/ml濃度的菌液滴到牛奶培養(yǎng)皿固定位置，長出菌落圈和沉淀圈后用游標(biāo)卡尺測量直徑并計算出比值，以PA值(菌落圈直徑/菌落圈直徑+沉淀圈直徑)表示，每個菌以3個結(jié)果的平均值來計算Sap酶活性。

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陰道上皮細(xì)胞培養(yǎng) 取人和小鼠新鮮陰道組織后采用DispaseⅡ和胰酶分步消化法，DispaseⅡ浸泡4 ℃冰箱過夜。分離陰道黏膜層并剪碎，0.25%胰酶37 ℃消化、DMEM/F12完全培養(yǎng)基終止消化，離心后K-SFM培養(yǎng)液重懸細(xì)胞并計數(shù)，按1×10個/ml的濃度將細(xì)胞接種于25 cm細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置于37 ℃、5%CO培養(yǎng)箱培養(yǎng)。48 h后觀察細(xì)胞生長情況并首次換液，每隔2～3 d換液并觀察細(xì)胞。當(dāng)貼壁細(xì)胞數(shù)達(dá)70%～80%時進(jìn)行傳代，按1×10個/ml的濃度將細(xì)胞接種于24孔板內(nèi)培養(yǎng)，貼壁細(xì)胞數(shù)達(dá)70%～80%時進(jìn)行下一步。

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陰道上皮細(xì)胞與白假絲酵母菌共培養(yǎng) 白假絲酵母菌菌液配置：K-SFM培養(yǎng)液配置菌液，濃度為1×10CFU/ml。細(xì)胞與菌共培養(yǎng)：實驗分為3組進(jìn)行，分別為空白對照組(只加K-SFM培養(yǎng)液)、Sap酶活性強(qiáng)組和Sap酶活性弱組。分別于6、12、24、48 h將配好的菌液加入到相應(yīng)孔內(nèi)，空白對照孔由K-SFM培養(yǎng)液代替，37 ℃、5%CO培養(yǎng)箱培養(yǎng)。48 h后同時收取上清液，-80 ℃冰箱避光保存，24孔板內(nèi)的細(xì)胞用PBS清洗后加入4%多聚甲醛固定,4 ℃冰箱保存。

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免疫熒光法檢測陰道上皮細(xì)胞NLRP3炎性小體的表達(dá) 取已用4%多聚甲醛固定的細(xì)胞，檸檬酸鹽修復(fù)液修復(fù)后加通透液，PBS清洗，5%牛血清白蛋白37 ℃封閉，再加NLRP3炎性小體抗體(1 ∶100稀釋)4 ℃冰箱過夜，復(fù)溫后PBS清洗，按說明加入稀釋熒光二抗(1 ∶500稀釋)，37 ℃孵育，加入DAPI染色9 min，PBS清洗后熒光顯微鏡下觀察并拍照。每個組選7～8張圖用Image Pro Plus軟件做熒光定量，并根據(jù)細(xì)胞核的數(shù)量進(jìn)行熒光均一化處理后再做統(tǒng)計學(xué)分析。

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ELISA法檢測上清液中細(xì)胞因子IL-1β、IL-18的表達(dá) 復(fù)溶已收取的細(xì)胞上清液,分別取100 μl并嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說明書操作，作出標(biāo)準(zhǔn)曲線并根據(jù)其最后計算出IL-1β、IL-18的實際濃度。

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HE染色觀察細(xì)胞形態(tài) 取已用4%多聚甲醛固定的細(xì)胞，PBS清洗后用蘇木精染色2 min，蒸餾水清洗，分化液分化后加反藍(lán)液，自來水清洗，伊紅染色20 s后95%乙醇溶液2～3 s，無水乙醇3 min(重復(fù)2次)，鏡下觀察細(xì)胞并拍照。

2 結(jié)果

2.1 假絲酵母菌鑒定情況及Sap酶活性檢測結(jié)果

在念珠菌顯色平板上長出的菌落顯色為綠色或翠綠色則為白假絲酵母菌。牛奶培養(yǎng)基平皿上可看到菌落圈和沉淀圈即為Sap陽性菌株，PA值越低，表明菌株Sap酶活性越強(qiáng)，反之則越弱。挑選Sap酶活性弱(PA=0.634±0.019)與Sap酶活性強(qiáng)(PA=0.254±0.003)的白假絲酵母菌各8株，測定的Sap酶活性強(qiáng)弱差異有統(tǒng)計學(xué)意義(

F

=380.44，

P

<0.05)。見圖1。

圖1 純化鑒定及Sap酶活性測定A：用安圖念珠菌顯色培養(yǎng)板進(jìn)行菌種鑒定；B：牛奶培養(yǎng)基進(jìn)行Sap酶活性測定；藍(lán)色圈：菌落圈；紅色圈：沉淀圈

2.2 陰道上皮細(xì)胞培養(yǎng)情況

人陰道上皮細(xì)胞消化后傳到培養(yǎng)瓶中，6～7 d時貼壁細(xì)胞數(shù)可達(dá)70%～80%，而小鼠陰道上皮細(xì)胞只需4～5 d；細(xì)胞呈鋪路石樣生長，形態(tài)為多角形，輪廓清晰，折光線好，確認(rèn)為陰道上皮細(xì)胞。見圖2。

圖2 光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞培養(yǎng)第6天的形態(tài) ×100A：人陰道上皮細(xì)胞；B：小鼠陰道上皮細(xì)胞

2.3 NLRP3炎性小體檢測結(jié)果

人陰道上皮細(xì)胞與白假絲酵母菌共培養(yǎng)后，陰道上皮細(xì)胞表達(dá)的NLRP3炎性小體水平從6 h開始升高，12 h達(dá)高峰后逐漸下降；同時熒光圖片顯示共培養(yǎng)24 h后，陰道上皮細(xì)胞開始裂解，至48 h時可看到細(xì)胞破裂死亡，熒光隨之減弱，而空白對照組的細(xì)胞形態(tài)從始至終都是完整的，熒光量保持相對穩(wěn)定，Sap酶活性強(qiáng)組NLRP3炎性小體水平下降趨勢更明顯。此外，人陰道上皮細(xì)胞與白假絲酵母菌共培養(yǎng)6、12、48 h，Sap酶活性弱組和Sap酶活性強(qiáng)組與空白對照組的NLRP3炎性小體水平相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(

P

<0.05)。Sap酶活性強(qiáng)組在12 h時與Sap酶活性弱組的NLRP3炎性小體水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義(

F

=8.05，

P

<0.05)，但6、24、48 h兩組間的NLRP3炎性小體表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見圖3。

圖3 人陰道上皮細(xì)胞NLRP3炎性小體表達(dá)量 ×400A：空白對照組；B：Sap酶活性弱組；C：Sap酶活性強(qiáng)組；D：三組熒光表達(dá)；綠色熒光：NLRP3炎性小體；藍(lán)色熒光：DAPI核染色；與空白對照組比較：*P<0.05；與Sap酶活性弱組比較： #P<0.05

2.4 IL-1β、IL-18的測定結(jié)果

白假絲酵母菌與人陰道上皮細(xì)胞共培養(yǎng)6、12、24、48 h，IL-1β和IL-18水平均在6 h達(dá)峰值后逐漸下降趨勢，至48 h時隨著細(xì)胞膜的破裂，細(xì)胞內(nèi)IL-1β和IL-18全部被釋放出來，又出現(xiàn)了小幅度的回升。Sap酶活性強(qiáng)組IL-1β和IL-18水平在6、12、48 h與空白對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(

F

=24.40、8.38，

P

<0.05)，兩因子3組間

F

值分別為24.40、8.38；而Sap酶活性弱組僅有IL-1β水平在6、12、24 h與空白對照組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(

P

<0.05)，Sap酶活性強(qiáng)組IL-1β和IL-18水平在6、12、48 h與Sap酶活性弱組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(

P

<0.05)。見圖4。

圖4 人陰道上皮細(xì)胞IL-1β和IL-18的表達(dá)量與空白對照組比較：*P<0.05；與Sap酶活性弱組比較：#P<0.05

2.5 HE染色結(jié)果

空白對照組的細(xì)胞邊界清晰，飽滿，折光性好；而陰道上皮細(xì)胞與白假絲酵母菌共培養(yǎng)48 h后可看到大部分細(xì)胞邊界模糊，部分已裂解，活力較差。見圖5。

圖5 光學(xué)顯微鏡觀察HE染色人陰道上皮細(xì)胞形態(tài) × 400A：空白對照組B：白假絲酵母菌與陰道上皮細(xì)胞共培養(yǎng)48 h

2.6 小鼠陰道上皮細(xì)胞3種因子表達(dá)情況

小鼠陰道上皮細(xì)胞與不同Sap酶活性的白假絲酵母菌共培養(yǎng)12 h，NLRP3炎性小體、IL-1β、IL-18 3種因子水平均高于空白對照組(

F

=32.3、10.39、11.13，

P

<0.05)，各個因子3組間

F

值分別為32.03、10.39、11.13，Sap酶活性強(qiáng)組的表達(dá)水平均高于Sap酶活性弱組(

P

<0.05)。趨勢與人陰道上皮細(xì)胞一致。見圖6。

圖6 小鼠陰道上皮細(xì)胞12 h時間點各因子表達(dá)量A：空白對照組；b：Sap酶活性弱組；c：Sap酶活性強(qiáng)組；與空白對照組比較：*P<0.05；與Sap酶活性弱組比較： #P<0.05

3 討論

Sap是由白假絲酵母菌分泌的一種胞外水解酶，有助于致病菌黏附、侵入宿主黏膜屏障和逃逸宿主免疫的攻擊。有研究表明，Sap基因缺失的突變菌造成的上皮損傷較輕且產(chǎn)生的細(xì)胞因子也會下降。因此Sap酶活性長期以來都被認(rèn)為是致病白假絲酵母菌的重要毒力特征，且對激活NLRP3炎性小體至關(guān)重要。本研究選取白假絲酵母菌與體外陰道上皮細(xì)胞共培養(yǎng)，結(jié)果顯示NLRP3炎性小體水平早期即達(dá)高峰，之后隨著細(xì)胞的破壞、死亡，表達(dá)量逐漸下降。由此活化的IL-1β和IL-18可分別驅(qū)動Th17和Th1細(xì)胞的早期分化，Th1主要通過分泌IFN-γ募集巨噬細(xì)胞等發(fā)揮抗感染作用，Th17分泌IL-17和IL-23等細(xì)胞因子抵御假絲酵母菌感染，NLRP3炎性小體缺陷的小鼠對白假絲酵母菌的播散性和易感性都增加了。所以，NLRP3炎性小體作為先天免疫系統(tǒng)的重要成員，在感染早期可立即啟動保護(hù)性適應(yīng)性免疫反應(yīng)抵御病菌。

然而，NLRP3炎性小體若被過度激活,一方面，引發(fā)的炎癥細(xì)胞因子和趨化因子不僅不能充分殺滅真菌降低陰道上皮細(xì)胞的損傷，反而使陰道上皮處于高炎癥狀態(tài)，導(dǎo)致免疫病理性炎癥。另一方面， NLRP3炎性小體可裂解并激活成孔蛋白gasdermin D，從而在質(zhì)膜上形成孔導(dǎo)致細(xì)胞焦亡，該機(jī)制可能造成細(xì)胞大量死亡。本研究選取不同Sap酶活性的白假絲酵母菌與陰道上皮細(xì)胞共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)NLRP3炎性小體、IL-1β和IL-18的水平均高于空白對照組，說明白假絲酵母菌能刺激陰道上皮細(xì)胞表達(dá)更多的NLRP3炎性小體及相關(guān)因子，且這個表達(dá)量與白假絲酵母菌的Sap酶活性成正比。推測Sap酶活性強(qiáng)的菌可能誘導(dǎo)NLRP3炎性小體的過度表達(dá)，引發(fā)高炎癥反應(yīng)及細(xì)胞死亡，從而導(dǎo)致陰道的局部病理損傷更嚴(yán)重。最后，本研究還發(fā)現(xiàn)不同Sap酶活性的白假絲酵母菌感染小鼠陰道上皮細(xì)胞后，與人陰道上皮細(xì)胞免疫因子表達(dá)的趨勢基本一致，因此可以用小鼠代替人進(jìn)行VVC體內(nèi)實驗。

綜上所述，在VVC的發(fā)病機(jī)制中，NLRP3炎性小體可能是一把雙刃劍，激活后既能通過活化IL-1β和IL-18啟動機(jī)體的保護(hù)性免疫應(yīng)答，又可能因過度激活而造成機(jī)體的免疫病理狀態(tài)。不同Sap酶活性的白假絲酵母菌與陰道上皮細(xì)胞共培養(yǎng)后，對NLRP3炎性小體的激活程度不完全一致，所以Sap酶活性強(qiáng)的菌可能更容易造成免疫病理損傷，引起的臨床癥狀可能更嚴(yán)重，這也許是臨床上不同VVC患者臨床癥狀和體征存在差異的原因。但體外實驗并不能完全反映體內(nèi)陰道黏膜局部的免疫狀態(tài)，還需進(jìn)一步的體內(nèi)實驗來論證這一觀點，從本研究結(jié)果來看，小鼠可以代替人進(jìn)行這一部分的體內(nèi)實驗。