一株益生性植物乳桿菌的體外安全性評(píng)價(jià)

關(guān)仁梅 羅強(qiáng) 生龍納雍 馬倩寧 羅璠

牦牛酸乳是青藏高原地區(qū)的人們經(jīng)常食用的乳制品，只有了解該地區(qū)優(yōu)勢(shì)乳酸菌的安全性，才能更好的對(duì)其進(jìn)行開發(fā)利用。本試驗(yàn)所采用的植物乳桿菌11是分離自西藏地區(qū)的自然發(fā)酵牦牛乳，前期經(jīng)本實(shí)驗(yàn)室測(cè)定益生性良好，現(xiàn)通過體外安全評(píng)價(jià)來評(píng)定其安全性，包括溶血試驗(yàn)、明膠液化試驗(yàn)、有害代謝產(chǎn)物測(cè)定和耐藥性評(píng)價(jià)試驗(yàn)，旨在為其作為益生菌應(yīng)用提供依據(jù)。

一、材料與方法

1.材料。實(shí)驗(yàn)菌株是植物乳桿菌11（Lactobacillus plantarum），質(zhì)控菌株大腸桿菌ATCC8099、金黃色葡萄球菌ATCC25923購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院微生物研究所。

2.方法。（1）溶血試驗(yàn)。菌種活化后劃線接種于哥倫比亞血平板上，30℃恒溫倒置培養(yǎng)48h，觀察記錄菌落周圍的變化情況，以具有溶血性質(zhì)的金黃色葡萄球菌ATCC25923作為陽性對(duì)照。

（2）明膠液化試驗(yàn)。將活化后的菌株穿刺接種于5mL明膠培養(yǎng)基中，30℃恒溫培養(yǎng)48h后，置于4℃條件下，使培養(yǎng)基完全凝固。將生理鹽水穿刺于明膠培養(yǎng)基中，作為陰性對(duì)照。

（3）有害代謝產(chǎn)物試驗(yàn)。一是氨基酸脫羧酶檢測(cè)。菌種活化后分別在添加了前體氨基酸的氨基脫羧酶篩選培養(yǎng)基和未添加前體氨基酸的培養(yǎng)基劃線，30℃恒溫培養(yǎng)24h和48h，觀察培養(yǎng)基的顏色變化。二是偶氮還原酶的測(cè)定。將活化后的實(shí)驗(yàn)菌株涂布于含有直接藍(lán)71的瓊脂培養(yǎng)基上（5mg/L），30℃恒溫培養(yǎng)72h，觀察是否有水解圈產(chǎn)生。三是吲哚實(shí)驗(yàn)。以1%接種量將活化后的實(shí)驗(yàn)菌株接種于蛋白胨水培養(yǎng)基中，30℃恒溫培養(yǎng)48h，加入吲哚試劑觀察顏色變化。以大腸桿菌ATCC8099為陽性對(duì)照菌株，以蛋白胨水培養(yǎng)基為空白對(duì)照。

（4）耐藥性評(píng)價(jià)。藥敏試驗(yàn)按照美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)（Clinical and Laboratory StandardsInstitute，CLSI）2020-M100所指導(dǎo)的Kirby-Bauer紙片擴(kuò)散法進(jìn)行試驗(yàn)，以CLSI 2020-M100第30版公布的數(shù)據(jù)作為標(biāo)準(zhǔn)，判定該藥物對(duì)腸球菌是耐藥（R）、中介（I）或是敏感（S）。

（5）數(shù)據(jù)處理與分析。試驗(yàn)均重復(fù)3次，數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用Excel 2010和SPSS20.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

二、結(jié)果與分析

1.溶血試驗(yàn)結(jié)果。如圖1所示，陽性對(duì)照金黃色葡萄球菌菌落周圍出現(xiàn)了透明圈，發(fā)生了β-溶血;實(shí)驗(yàn)菌株周圍無溶血環(huán)出現(xiàn)，為γ-溶血，即不溶血。

2.明膠液化試驗(yàn)結(jié)果。實(shí)驗(yàn)菌株沒有使明膠固體培養(yǎng)基表面發(fā)生液化，表現(xiàn)為陰性。

3.有毒代謝產(chǎn)物試驗(yàn)結(jié)果。第一，實(shí)驗(yàn)菌株在空白實(shí)驗(yàn)和添加L-酪氨酸、L-組氨酸、L-賴氨酸和L-鳥氨酸的平板顏色均未改變，為陰性結(jié)果，表明實(shí)驗(yàn)菌株并不產(chǎn)生測(cè)定的這4種生物胺。第二，實(shí)驗(yàn)菌株也不產(chǎn)生偶氮還原酶。第三，如圖2所示，大腸桿菌ATCC8099發(fā)酵液液面出現(xiàn)玫瑰紅色，為陽性結(jié)果;實(shí)驗(yàn)菌株的發(fā)酵液液面顏色無變化，為陰性結(jié)果，表明實(shí)驗(yàn)菌株不會(huì)代謝產(chǎn)生色氨酸酶而分解蛋白胨中的色氨酸生成吲哚。

4.耐藥性評(píng)價(jià)。本實(shí)驗(yàn)采用藥敏紙片法檢測(cè)了7種臨床常用抗生素的藥物敏感性，表1展示了實(shí)驗(yàn)菌株對(duì)不同抗生素的耐藥情況，對(duì)紅霉素、阿奇霉素和四環(huán)素表現(xiàn)出敏感性，對(duì)鏈霉素、卡那霉素、諾氟沙星表現(xiàn)出明顯的抗藥性。

三、結(jié)論與討論

乳酸菌或有潛在的安全性問題，因此需確定菌株的耐藥性等問題。研究發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)革蘭氏陽性菌對(duì)阿奇霉素、紅霉素類藥物敏感，鏈霉素與青霉素使用廣泛，耐藥問題非常普遍，本試驗(yàn)結(jié)果與相關(guān)報(bào)道一致。乳酸菌的抗性主要是固有和獲得性，若菌株具有獲得性抗體，則具有將毒力基因轉(zhuǎn)移到腸道中的風(fēng)險(xiǎn)，因此后續(xù)需要檢測(cè)實(shí)驗(yàn)菌株對(duì)抗生素的抗性是否具有轉(zhuǎn)移性。在本研究中，實(shí)驗(yàn)菌株無溶血現(xiàn)象，不融化明膠，沒有產(chǎn)生有毒代謝產(chǎn)物，這與目前一些對(duì)植物乳桿菌的研究一致。

本研究通過對(duì)植物乳桿菌11進(jìn)行的體外安全性評(píng)價(jià)發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)菌株有害代謝產(chǎn)物測(cè)定均為陰性，不溶血，不溶解明膠，對(duì)阿奇霉素、紅霉素和四環(huán)素敏感，對(duì)青霉素、諾氟沙星、鏈霉素、卡那霉素具有不同程度的耐藥性。綜合試驗(yàn)結(jié)果可以初步判斷，植物乳桿菌11是一株安全的益生性菌株，這為植物乳桿菌11進(jìn)一步的開發(fā)與應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)。

作者簡(jiǎn)介：關(guān)仁梅（1996-），女，漢族，安徽淮北人，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称肺⑸飳W(xué)。