在線凈化液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定茶葉中11種磺胺類抗生素

羅漪漣 王雨晴 朱佳明 唐媛媛

磺胺類抗生素屬于廣譜抗菌藥物，具有價格低廉、療效顯著等特點(diǎn)，廣泛用于畜牧水產(chǎn)養(yǎng)殖行業(yè)?？股亟?jīng)人體或動物攝入后，大部分以原形或代謝產(chǎn)物的形式排放進(jìn)入環(huán)境，對生態(tài)系統(tǒng)和人類健康造成威脅。茶葉在種植過程中通常會施用有機(jī)肥，可能存在磺胺類抗生素殘留的風(fēng)險(xiǎn)。目前，對于環(huán)境中抗生素的檢測方法相對成熟，而茶葉中抗生素的檢測方法較少。

本文采用在線凈化液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法，對茶葉中11種磺胺類抗生素進(jìn)行了研究分析，建立了在線凈化液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定茶葉中11種磺胺類抗生素的方法。樣品經(jīng)提取液（乙腈︰0.1mol/L的Na2EDTA-Mcllvaine緩沖液）提取、在線凈化柱Cyclone-P凈化、Hypersil Gold色譜柱分離，用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測。結(jié)果表明，11種磺胺類抗生素在茶葉中的回收率為79.7%-116.6%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為2.37%-13.4%，并且在10-500μg/kg濃度范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系。本檢測方法簡便快捷，靈敏度高，定性定量結(jié)果準(zhǔn)確可靠，為茶葉質(zhì)量安全提供了技術(shù)保障。

一、儀器與試劑

1.儀器。TurboFlow在線凈化液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀，美國ThermoFisher公司，包括CTC多功能自動進(jìn)樣器、2個四元梯度液相泵、六通閥切換裝置、多元柱切換裝置和TSQ Quantum Ultra三重四級桿液質(zhì)聯(lián)用儀;漩渦混合器，美國Talboys公司;KS 4000i振蕩器，德國IKA公司;5804R冷凍離心機(jī)，德國Eppendorf公司;純水儀，美國Millipore公司。

2.試劑。甲醇和乙腈為質(zhì)譜純，甲酸為色譜純，一水合檸檬酸、十二水合磷酸氫二鈉、氫氧化鈉、乙二胺四乙酸二鈉均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

0.1mol/L的Na2EDTA-Mcllvaine緩沖液：將12.9g一水合檸檬酸和27.58g十二水合磷酸氫二鈉溶于1L水中，完全溶解后加入37.2g乙二胺四乙酸二鈉，超聲至全溶，用1mol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至4.0±0.5。

3.材料?；前奉悩?biāo)準(zhǔn)品：磺胺嘧啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺噻唑、磺胺甲噻二唑、磺胺氯噠嗪、磺胺鄰二甲氧嘧啶、磺胺異惡唑，天津阿爾塔科技有限公司;磺胺甲惡唑、磺胺二甲嘧啶、磺胺喹惡啉、磺胺間二甲氧嘧啶，德國Dr.Ehrenstorfer公司。

以甲醇為溶劑，將上述磺胺類標(biāo)準(zhǔn)品配制成濃度為100mg/L或10mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，在-20℃條件下儲存。再用甲醇將標(biāo)準(zhǔn)儲備液逐級稀釋成適當(dāng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)混合工作液，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)做準(zhǔn)備。

二、實(shí)驗(yàn)與方法

1.樣品前處理。準(zhǔn)確稱取2.00g茶葉樣品于50mL塑料離心管中，加入V（乙腈）：V（0.1mol/L的Na2EDTA-Mcllvaine緩沖液）為1︰1的提取液16mL，于漩渦混合器上渦旋1min，振蕩20min，8000r/min離心5min，取上清液過0.22μm濾膜，上機(jī)測定。

2.分析條件。（1）在線凈化條件。在線凈化環(huán)節(jié)在四元泵Loading泵作用下進(jìn)行，主要包括目標(biāo)物的凈化和富集。在線凈化柱：Cyclone-P柱（0.5mm×50mm）;流動相A為甲酸水溶液（0.4%），B為乙腈，C為乙腈-異丙醇-丙酮（體積比為45︰45︰10）;進(jìn)樣體積：50μL。

（2）液相色譜條件。液相梯度洗脫環(huán)節(jié)在四元泵Eluting泵作用下進(jìn)行，使凈化后的目標(biāo)物在分析柱上進(jìn)行洗脫分離并在質(zhì)譜中分析。色譜柱：Hypersil GOLD柱（100mm×2.1mm，3μm）;流動相A為甲酸水溶液（0.4%），B為乙腈。在線凈化和梯度洗脫程序詳見表1。

（3）質(zhì)譜條件。電噴霧離子源（ESI），正離子掃描模式，多反應(yīng)監(jiān)測（MRM），電噴霧電壓：3500V，離子源溫度：300℃，鞘氣壓力：40Arb，輔助氣壓力：10Arb，毛細(xì)管溫度：350℃。11種化合物的質(zhì)譜參數(shù)詳見表2。

三、結(jié)果與討論

1.提取條件優(yōu)化。分別對比提取液為純乙腈、不同體積比的乙腈和0.1mol/L的Na2EDTA-Mcllvaine緩沖液的提取效率，結(jié)果表明，當(dāng)乙腈和0.1mol/L的Na2EDTA-Mcllvaine緩沖液的體積比為1︰1時，提取效率高，故以此作為實(shí)驗(yàn)的提取液。因?yàn)椴枞~樣品制備后，相對土壤樣品需要體積較多的提取液才能保證充分提取，所以提取液體積適當(dāng)增加至16mL。

2.在線凈化和液相條件優(yōu)化。在線凈化過程中，對比使用甲酸水溶液（0.4%）、甲酸水溶液（0.1%）和乙酸銨溶液（10mmol/L）作為上樣流動相A，磺胺類化合物都能有效保留，相比之下在甲酸水溶液（0.4%）條件下，目標(biāo)分析物的峰形和響應(yīng)更好，故選其作為上樣流動相A。為了簡化實(shí)驗(yàn)程序，在液相梯度洗脫過程中，仍選用甲酸水溶液（0.4%）作為流動相A，發(fā)現(xiàn)目標(biāo)分析物能夠有效地被洗脫分離進(jìn)質(zhì)譜中，且保留時間、峰形和響應(yīng)值均滿足要求。

3.線性范圍。在空白茶葉樣品中分別加入適量混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，使其濃度分別為10μg/kg、20μg/kg、50μg/kg、100μg/kg、200μg/kg、500μg/kg，按照上述實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行檢測，以目標(biāo)分析物的峰面積和濃度作圖，得出11種化合物的線性方程和相關(guān)系數(shù)，詳見表3。結(jié)果表明，11種磺胺類藥物在10-500μg/kg的濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)r均大于0.99。

4.回收率和精密度。在空白茶葉樣品中分別添加不同量的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，使11種磺胺類藥物的濃度分別為50μg/kg、100μg/kg、200μg/kg，每個濃度均有6個平行樣，按照上述實(shí)驗(yàn)方法測定各自的回收率和精密度。結(jié)果表明，茶葉中11種磺胺類藥物的回收率在79.7%-116.6%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD在2.37%-13.4%，滿足殘留分析的要求，詳見表3。

本文建立了在線凈化液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測定茶葉中11種磺胺類抗生素的方法，實(shí)現(xiàn)了樣品前處理的在線自動化操作，節(jié)省了時間、人力和消耗品成本，有效降低了基質(zhì)效應(yīng)，提高了檢測靈敏度，從而得到準(zhǔn)確可靠的定性定量結(jié)果。

作者簡介：羅漪漣，農(nóng)藝師，從事農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測工作。