斑點叉尾鮰、半滑舌鰨和低眼無齒巨鯰三重熒光PCR檢測方法

鄭劍 周旋

我國是水產品生產、貿易和消費大國，近年來隨著人們生活水平的不斷提高，斑點叉尾鮰、龍利魚和巴沙魚等水產品的消費量逐年增大，進出口貿易量持續(xù)增加。這幾種水產品主要以加工魚片的形式進行貿易，在肉質和外觀形態(tài)上都極其相似，難以辨認，市場上以次充好和國外貿易技術壁壘事件層出不窮。

本實驗根據(jù)3種魚的特異性保守基因，設計合成3對特異性引物和探針，建立了斑點叉尾鮰、半滑舌鰨和低眼無齒巨鯰三重熒光PCR鑒定方法，然后進行PCR反應特異性和靈敏性驗證。結果表明，本檢測方法簡單、快速、靈敏度高，檢測靈敏度可達到2.25×10-8μg/mL，整個檢測時間在2.5h以內，可以同時檢測3種易混淆魚制品，為相關魚肉制品源性鑒別提供了科學依據(jù)，可廣泛應用于食品衛(wèi)生檢測以及臨床檢驗等領域。

一、材料與儀器

1.樣品來源。實驗檢測所用的革胡子鯰、南方大口鯰、長絲巨鲇、黃顙魚、鰻魚、草魚、鯉魚小黃魚、短吻紅舌鰨、斑點叉尾鮰、半滑舌鰨和低眼無齒巨鯰均從農貿市場、超市和網絡平臺購買。

2.主要試劑。廣譜型基因組DNA小量純化試劑盒，寶生物工程（大連）有限公司;qPCR Master Mix（2×），西格瑪奧德里奇（上海）貿易有限公司;引物與探針，武漢天一輝遠生物科技有限公司合成。

3.儀器設備。qubit4.0熒光定量儀，Thermo Fisher， 美國;QuantStudio 7 Flex實時熒光定量PCR系統(tǒng)，Thermo Fisher，美國;5417 R型高速離心機，Eppendorf，德國。

二、實驗與方法

1.DNA提取。所有動物樣品參照廣譜型基因組DNA小量純化試劑盒中的操作說明提取DNA，用qubit4.0熒光定量儀檢測DNA濃度及純度。提取的DNA置于-20℃保存。

2.引物設計。根據(jù)Gen Bank數(shù)據(jù)庫中已公布的斑點叉尾鮰、半滑舌鰨和低眼無齒巨鯰基因序列，使用Clustal X軟件進行序列比對，篩選出種屬相關的保守序列。利用Primer3Plus設計各種特異性熒光PCR引物和探針，引物和探針序列如下：低眼無齒巨鯰P.h-F：cagttcgtgtgtggagacaga，P.h-R：tgaagctgtagtggccagttc，P.h-P：cttcccatggtgcatgctgagtgctaacaggt;半滑舌鰨C.s-F：agctttctctgcatgtgaggc，C.s-R：catcgaagggtggttagtgagt，C.s-P：aacccacggggccgccaacctca;斑點叉尾鮰I.p-F：ccagccactgaacaacact，I.p-R：tagaagtcaaacagggctatct，I.p-P：tcaaaacttctttccaaaccgcatcctt。

3.三重熒光PCR體系的優(yōu)化。為了確定三重熒光PCR反應中引物和探針比例，固定每對引物比例為1︰1，把3對引物和3條探針作為6個因素，采用正交設計L25（56），在5個水平（引物為：0.1、0.3、0.5、0.7、0.9μM，探針為：0.05、0.1、0.2、0.3、0.5μM）上進行試驗以確定最佳比例。其他反應體系和條件如下：qPCR Master Mix（2×）12.5μL，模板2μL，dd H2O補足至25μL;95℃預變性5min，40個循環(huán)（95℃變性10s，60℃退火40s）。

4.三重熒光PCR特異性驗證。分別以革胡子鯰、南方大口鯰、長絲巨鲇、黃顙魚、鰻魚、草魚、鯉魚小黃魚、短吻紅舌鰨、斑點叉尾鮰、半滑舌鰨和低眼無齒巨鯰的DNA為模板，按照優(yōu)化好的三重熒光PCR反應條件進行PCR反應，從而驗證引物的特異性。

5.三重熒光PCR靈敏性驗證。將包含3個目的基因片段的質粒DNA從起始2.25×10-1μg/mL進行10倍比稀釋，稀釋8個梯度，用優(yōu)化的三重熒光PCR體系進行擴增，分析絕對靈敏度，每個反應設置3個平行。

三、結果與分析

1.三重PCR體系的優(yōu)化。按L25（56）正交設計的25個實驗進行三重熒光PCR反應，結果見圖1。根據(jù)各反應Ct值大小以及反應曲線斜率和熒光值確定最優(yōu)引物和探針比例。由圖1可以看出，在25個實驗組合中擴增Ct值均無較大差異，但其中8實驗擴增效率和擴增熒光值均較高，因此選用8實驗為最佳體系，即在25μL反應體系中：qPCR Master Mix（2×）12.5μL，模板2μL;P.h-F和P.h-R各0.5μL，P.h-P為0.3μL;C.s-F和C.s-R各0.3μL，C.s-P為0.1μL;I.p-F和I.p-R各0.9μL，I.p-P為0.2μL;dd H2O補足至25μL。

2.特異性分析。由圖2可知，斑點叉尾鮰、半滑舌鰨和低眼無齒巨鯰均出現(xiàn)典型的擴增曲線，檢測結果為陽性;其他物種均無擴增曲線，檢測結果為陰性。這表明所設計引物和探針均具有很好的特異性。

3.靈敏性分析。當質粒DNA質量濃度達到2.25×? ? ? ? 10-9μg/mL（對應質粒DNA拷貝數(shù)濃度為2.07×103? ? ? ? ?copies/mL）時，重復實驗沒有全部出現(xiàn)擴增，3個重復里僅1個反應出現(xiàn)明顯擴增，判定為不能檢出。當質粒DNA質量濃度≥2.25×10-8μg/mL（對應質粒DNA拷貝數(shù)濃度大于或等于2.07×104copies/mL）時，重復實驗均出現(xiàn)明顯擴增曲線，判定為可以檢出（圖3A）。每個實時熒光PCR反應體系中模板加入量為2μL，則三重熒光PCR最低檢測限為42copies。相對于斑點叉尾鮰、半滑舌鰨和低眼無齒巨鯰的單獨熒光PCR的檢出限（圖3B-D），三重熒光PCR的檢出限一致，并未出現(xiàn)明顯的下降。

實驗證實，此方法針對低眼無齒巨鯰、半滑舌鰨和斑點叉尾鮰的引物和探針的特異性良好。經驗證，三重熒光PCR中低眼無齒巨鯰、半滑舌鰨和斑點叉尾鮰檢測限與單重熒光PCR一致，達到2.25×10-8μg/mL。

本方法特異性強、靈敏度高，填補了低眼無齒巨鯰、半滑舌鰨和斑點叉尾鮰成分檢測的空白，為水產食品企業(yè)把控產品質量提供了有效方法，也為監(jiān)管部門對水產食品行業(yè)進行監(jiān)督管理提供了科學依據(jù)。

作者簡介：鄭劍（1981-），男，漢族，湖北武漢人，碩士研究生，研究方向為物種成分鑒定。