燕窩分子生物學(xué)檢測技術(shù)研究進(jìn)展

白偉娟 張小江 蕭月娥 柳訓(xùn)才 范群艷 徐敦明 張曉婷 鄧曉軍

摘 要：分子生物學(xué)檢測方法以其高效、靈敏、準(zhǔn)確、快速的特點(diǎn)在食品行業(yè)真?zhèn)伪鎰e中備受歡迎。該文主要介紹了燕窩檢測中的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、實(shí)時熒光PCR、分子指紋、基因芯片、基因測序等基因檢測技術(shù)研究現(xiàn)狀，為后續(xù)燕窩真?zhèn)舞b別提供參考依據(jù)。

關(guān)鍵詞：燕窩;分子生物;真?zhèn)舞b別

中圖分類號 TS207 ? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 1007-7731（2021）20-0018-04

Research Progress on Molecular Biology Detection Technology of Edible Bird′s Nest

BAI Weijuan1 et al.

（1Yan Palace Seelong Food Co.， Ltd.， Nest Technology Center， Xiamen 361100， China）

Abstract： Molecular biology detection methods are popular in the authenticity identification of the food industry due to their high efficiency， sensitivity， accuracy and speed. This article mainly introduces the polymerase chain reaction，real-time fluorescent PCR， molecular fingerprinting， gene chip， gene sequencing and other gene detection technologies in bird′s nest detection， and provides a reference for subsequent identification of edible bird nest authenticity.

Key words： Edible? bird′s nest （EBN）; Molecular biology; Authentication

燕窩（edible bird′s nest，EBN）由金絲燕屬（Aerodramus）和侏金絲燕屬（Collocalia）7種小型鳥組成，在繁殖過程中唾液腺分泌物與羽毛或草混合而成[1]。金絲雀的生長和繁殖需要具備充足的食物來源、約90%濕度及28～30℃溫度的適宜環(huán)境條件[2]。因此，金絲雀僅分布在條件適宜的地區(qū)，如印度尼西亞、馬來西亞、泰國、越南等國家。隨著經(jīng)濟(jì)水平的提高，加上疫情下國民對大健康的重視，燕窩市場呈現(xiàn)逆勢上揚(yáng)的趨勢。中國市場流通的燕窩100%依賴進(jìn)口，2020年度我國進(jìn)口燕窩量高達(dá)345t，同比2017年進(jìn)口量81.4t，增加了4倍。2020年天貓購物平臺燕窩類銷售額約為44.5億元，同比2019年增長39%。燕窩具有豐富的營養(yǎng)價值，具有提高嬰兒智力和記憶力[3]、抗病毒[4-5]、抗氧化[6-7]、抗腫瘤[8]、提高人體免疫力[9-12]、抗凝血[13]、改善皮膚[14]等功能。在中國人長期的認(rèn)知中，食用燕窩已經(jīng)成為一種健康的飲食習(xí)慣。因此，隨著生活水平的逐步提高，人們對燕窩的需求量也在增加。但由于產(chǎn)量減少而利潤豐厚，市場上充斥著摻假品和低質(zhì)量的燕窩，且由于國內(nèi)外缺乏有關(guān)燕窩質(zhì)量的法規(guī)和標(biāo)準(zhǔn)，使有效市場監(jiān)控變得十分困難。無休止的非法手段，例如摻假或染色等，使市場陷入惡性競爭圈。消費(fèi)者對燕窩缺乏常識，很容易被不道德的商人和不負(fù)責(zé)任的輿論所誤導(dǎo)。N-乙?；窠?jīng)氨酸（唾液酸）是由金絲燕口腔上皮細(xì)胞及其絨羽組成，作為燕窩中主要生物活性成分，其可提供相關(guān)生物信息，可作為判斷真假及品質(zhì)好壞的依據(jù)。

基因是帶有遺傳信息的DNA片段，具有物質(zhì)性（存在方式）和信息性（根本屬性）雙重屬性，因此利用基因手段對生物物種進(jìn)行鑒定是科學(xué)可靠的。隨著生物學(xué)的快速發(fā)展，基因檢測方法不斷涌現(xiàn)，如PCR技術(shù)、基因測序、基因圖譜、基因芯片、分子指紋等。分子生物學(xué)檢測手段以其高靈敏度、快速方便、特異性好等特點(diǎn)，在燕窩制品真?zhèn)舞b別中得到了廣泛應(yīng)用。燕窩主要是由唾液酸糖蛋白組成，其水體液中發(fā)現(xiàn)多種主要以黏蛋白形式存在的水溶性蛋白，不易分離純化。研究發(fā)現(xiàn)，利用液相等點(diǎn)聚焦電泳，使燕窩水提蛋白質(zhì)后再用丙酮沉淀能有效去除其雜質(zhì)分離效果更好，適用于電泳分析試驗(yàn)[15]。同時，也有研究報道關(guān)于燕窩中的蛋白質(zhì)的制備方法，利用80%丙酮來沉淀蛋白質(zhì)可有效去除雜質(zhì)，使其分離效果更佳[16]。劉鳴暢等[17]研究表明，毛細(xì)管凝膠電泳技術(shù)適用于摻假燕窩中銀耳成分得檢測。刁雅欣等[18]通過提取燕窩DNA基因，利用動物類通用COI基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，建立了NJ系統(tǒng)發(fā)育樹，對13個樣本進(jìn)行了鑒別分析，其中13個樣品與Aerodramus fuciphagus的COI DNA序列相似度高于99%，說明DNA條形碼技術(shù)可作為燕窩基源判斷技術(shù)之一。王鳳云等[19]對不同品種及產(chǎn)地燕窩提取其DNA，利用ND2序列進(jìn)行擴(kuò)增測序，構(gòu)建了NJ系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果表明，市場上官燕的均為爪哇金絲燕（Aerodramus fuciphagus）或其亞種A. fuciphagus germani，為后續(xù)生物鑒別研究奠定了基礎(chǔ)。

1 PCR技術(shù)在燕窩中應(yīng)用

PCR技術(shù)模擬DNA天然復(fù)制過程，在體外DNA的特異序列進(jìn)行擴(kuò)增，從而獲得大量的同一序列。與擴(kuò)增特異性密切相關(guān)的因素是與待擴(kuò)增的特異序列兩端互補(bǔ)的2個寡核苷酸引物（上游引物和下游引物）。該技術(shù)是基因擴(kuò)增技術(shù)的一次重大改革，是分子生物學(xué)發(fā)展史中的一個重要里程碑，經(jīng)過一系列研究產(chǎn)生了限制性片段長度多態(tài)性聚合酶鏈反應(yīng)（PCR-RFLP）技術(shù)、原位PCR技術(shù)、多重PCR技術(shù)、巢式PCR（NEST PCR）技術(shù)、反向PCR（Inverse PCR，IPCR）技術(shù)、錨定PCR（Anchored PCR，APCR）技術(shù)、反轉(zhuǎn)錄PCR（reverse transcription，RT-PCR）技術(shù)、修飾引物PCR技術(shù)、等位基因特異性PCR（Allele-specific PCR，ASPCR）技術(shù)、單鏈構(gòu)型多肽性PCR（single-strandconformational polymorphism PCR，SSCPPCR）技術(shù)、競爭性PCR（competitive PCR，c-PCR）技術(shù)、差示PCR（differential PCR，d-PCR）技術(shù)等技術(shù)在檢測方面的運(yùn)用。RT-PCR技術(shù)的產(chǎn)生使PCR技術(shù)產(chǎn)生了質(zhì)飛躍，其最主要特點(diǎn)是定量范圍寬、靈敏度高，并能同時處理多個樣本。