半胱氨酸代謝途徑調(diào)控與腫瘤治療新策略

解 放，劉 楠

（中國藥科大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，南京 211198）

自1920年奧托·瓦伯格發(fā)現(xiàn)瓦伯格效應(yīng)，腫瘤代謝重編程的研究已經(jīng)超過了一百年。腫瘤代謝重編程是腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中關(guān)鍵特征之一［1-2］。腫瘤細胞的快速增殖需要相應(yīng)的能量和物質(zhì)基礎(chǔ)，進而促進腫瘤生長。大量研究表明，除了糖代謝異常外，氨基酸代謝及脂質(zhì)代謝異常也是腫瘤代謝重編程的重要研究范疇。本文將結(jié)合半胱氨酸在腫瘤細胞中的轉(zhuǎn)運方式和代謝途徑，分析半胱氨酸對腫瘤各個階段的調(diào)控機制，介紹相應(yīng)的抗腫瘤靶向療法的最新進展。

1 半胱氨酸代謝途徑

近年來的研究表明，谷氨酰胺是潛在的腫瘤生物標(biāo)志物［3-4］，精氨酸代謝則與腫瘤產(chǎn)生機制有關(guān)［5］，針對溶質(zhì)載體家族6成員14（SLC6A14）的藥物α-甲基色氨酸可用于腫瘤靶向治療［6］?？梢娞囟ò被岽x在腫瘤的發(fā)生發(fā)展、腫瘤微環(huán)境和腫瘤免疫治療等方面發(fā)揮重要作用。靶向腫瘤依賴性的氨基酸代謝，發(fā)展新型藥物，可有效抑制腫瘤的生長。半胱氨酸是一種非必需中性氨基酸，為三羧酸循環(huán)提供碳源，參與合成谷胱甘肽維持氧化還原平衡，同時其巰基可生成硫化氫促進ATP的生成［7］。腫瘤細胞自身轉(zhuǎn)硫途徑合成的半胱氨酸無法滿足其快速增殖的需求，要通過增加膜上的轉(zhuǎn)運體從胞外攝入胱氨酸。腫瘤細胞中半胱氨酸則主要來源于胱氨酸轉(zhuǎn)運體的轉(zhuǎn)運和內(nèi)源性轉(zhuǎn)硫途徑的合成兩部分。

1.1 胱氨酸轉(zhuǎn)運蛋白家族

半胱氨酸在腫瘤細胞外主要以胱氨酸（Cys-SS-Cys）形式存在，經(jīng)胱氨酸轉(zhuǎn)運體轉(zhuǎn)運至細胞內(nèi)，由于細胞內(nèi)呈高度還原狀態(tài)，胱氨酸被還原成半胱氨酸，參與合成谷胱甘肽（GSH）、硫化氫（H2S）、3-巰基丙酮酸、同型半胱氨酸等有機物，介導(dǎo)腫瘤的增殖、生長、轉(zhuǎn)移和耐藥［8-9］。胱氨酸/谷氨酸轉(zhuǎn)運體（System xc-）是由輕鏈SLC7A11（solute carrier family 7，member 1）和重鏈SLC3A2（solute carrier family 3，member 2）通過二硫鍵組成的異二聚體，在胰腺癌、結(jié)直腸癌細胞中高表達。輕鏈SLC7A11屬跨膜結(jié)構(gòu)蛋白，N端和C端均位于細胞質(zhì)內(nèi)，其余部分穿梭于細胞膜。重鏈亞基SLC3A2負責(zé)維持System xc-的穩(wěn)定性和膜定位。此外，SLC3A2還可與其他氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白構(gòu)成多聚體，如與SLC7A5共同組成氨基酸-多胺-有機陽離子轉(zhuǎn)運體，參與催化甲狀腺激素、藥物和激素前體的跨膜運輸［10］，調(diào)控Hippo和mTOR通路［11］。半胱氨酸也可藉由Na+依賴性的丙氨酸-絲氨酸半胱氨酸轉(zhuǎn)運蛋白SLC1A4、SLC1A5、SLC3A1和興奮性氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白SLC1A1等非特異性轉(zhuǎn)運體進入細胞［12-13］，氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白信息見表1。

表1 胱氨酸轉(zhuǎn)運蛋白列表

免疫組織化學(xué)實驗顯示，乳腺癌組織中SLC3A1表達量為癌旁組織的1.5倍，Kaplan-Meier生存分析發(fā)現(xiàn)，SLC3A1高表達的Ⅲ期患者生存率較低表達的患者減少20%，表明SLC3A1介導(dǎo)的半胱氨酸攝取促進乳腺癌進展［14］。SLC1A1的445位精氨酸突變?yōu)樯彼岷?95位異亮氨酸缺失突變則降低SLC1A1對谷氨酸和半胱氨酸的轉(zhuǎn)運效率，導(dǎo)致二羧酸氨基酸尿癥。除這些中性氨基酸之外，SLC1A5高親和性地運輸L-谷氨酰胺和L-天冬酰胺，有助于維持神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細胞的谷氨酰胺穩(wěn)態(tài)［15］。在敲除SLC1A5的舌鱗癌SCC15和UM1細胞中，發(fā)現(xiàn)細胞攝取谷氨酰胺減少，裸鼠腫瘤生長受抑制，說明SLC1A5具有良好的抗腫瘤潛力，可作為口腔鱗狀細胞癌的新靶點［16-17］。

1.2 轉(zhuǎn)硫途徑

腫瘤細胞內(nèi)半胱氨酸的水平不僅依賴于胱氨酸轉(zhuǎn)運蛋白的導(dǎo)入也與內(nèi)源性轉(zhuǎn)化，即將甲硫氨酸轉(zhuǎn)化為半胱氨酸的轉(zhuǎn)硫途徑密切相關(guān)。轉(zhuǎn)硫途徑中，甲硫氨酸經(jīng)S-腺苷甲硫氨酸、S-腺苷-L-同型半胱氨酸轉(zhuǎn)化成同型半胱氨酸，在胱硫醚-β-合成酶（cystathionineβ-synthase，CBS）催化下與絲氨酸縮合生成胱硫醚，再經(jīng)胱硫醚-γ-裂解酶（cystathionineγ-lyase，CSE）生成半胱氨酸，生成的半胱氨酸除了用于谷胱甘肽合成，還可用于含硫分子合成，經(jīng)半胱氨酸雙加氧酶（cysteine dioxygenase，CDO）、半胱氨酸亞磺酸脫羧酶和次牛磺酸脫氫酶生成?；撬幔?8］，見圖1。

圖1 半胱氨酸代謝途徑

轉(zhuǎn)硫途徑與卵巢癌［19］、結(jié)腸癌［20］的能量代謝、腫瘤血管新生及腫瘤耐藥有關(guān)。GCN2-ATF4通路可根據(jù)細胞內(nèi)空載的tRNA含量判斷氨基酸供應(yīng)是否充足進而調(diào)控下游的轉(zhuǎn)錄因子ATF4的轉(zhuǎn)錄活性。Zhu等［21］通過染色質(zhì)免疫沉淀發(fā)現(xiàn)半胱氨酸饑餓條件下，人惡性黑色素瘤細胞SKMEL30和人膠質(zhì)母細胞瘤細胞LN229中，ATF4均與CBS和CSE的啟動子區(qū)域結(jié)合；使用CRISPR-Cas9技術(shù)敲除ATF4后，半胱氨酸饑餓時SKMEL30細胞中CBS、CSE的表達無明顯變化。用半胱氨酸饑餓處理SKMEL30和LN229，CBS、CSE、ATF4表達增加，GCN2磷酸化水平升高，表明在半胱氨酸饑餓下，GCN2-ATF4通路被激活，從而上調(diào)CBS、CSE表達，轉(zhuǎn)硫途徑占優(yōu)。

CBS是抑癌因子HNF4α介導(dǎo)的肝癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化抑制的主要效應(yīng)物。單獨敲低半胱氨酸代謝途徑酶CBS和CDO1的肝癌細胞HepG2，E-鈣黏蛋白CDH1減少但波形蛋白VIM增加，誘導(dǎo)細胞遷移。說明轉(zhuǎn)硫途徑顯著抑制HepG2的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）和細胞遷移。培養(yǎng)基中回補代謝物牛磺酸、胱硫醚等，細胞遷移受到抑制。推測CBS活性增強后會調(diào)節(jié)4種主要代謝物（絲氨酸、胱硫醚、同型半胱氨酸和H2S）的含量變化，進而影響EMT和相關(guān)的耐藥性，并最終影響腫瘤的生長和進展［22］。然而CBS以及轉(zhuǎn)硫途徑調(diào)控腫瘤發(fā)生發(fā)展的作用并沒有明確結(jié)論，存在兩面性。Szabo等［20］采用敲低CBS或使用CBS抑制劑氨基羥乙酸AAOA處理人結(jié)腸癌細胞HCT116，顯著降低HCT116異種移植小鼠體內(nèi)腫瘤的生長速率和體積，同時，降低腫瘤組織內(nèi)CD31陽性血管密度血流量，抑制腫瘤血管新生。綜上說明與CBS相關(guān)的腫瘤發(fā)生發(fā)展根據(jù)腫瘤類型的不同，存在雙向性調(diào)控。

相較于胱氨酸轉(zhuǎn)運體介導(dǎo)的較單一內(nèi)源性途徑，轉(zhuǎn)硫途徑涉及的化合物、酶和副產(chǎn)物眾多，在半胱氨酸代謝途徑調(diào)控中占據(jù)了主導(dǎo)地位，研究轉(zhuǎn)硫途徑中各類前體、代謝產(chǎn)物、副產(chǎn)物的產(chǎn)生和作用機制具有重要意義。

2 半胱氨酸代謝途徑在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的調(diào)控作用

以半胱氨酸為中心的代謝網(wǎng)絡(luò)，涉及多種代謝物和酶參與氧化應(yīng)激、能量代謝、細胞自噬的調(diào)控。研究半胱氨酸代謝調(diào)控腫瘤發(fā)生發(fā)展的機制，為開發(fā)和改進腫瘤診斷工具和腫瘤靶向藥物提供了可能性。

2.1 半胱氨酸代謝與氧化應(yīng)激

氧化應(yīng)激是腫瘤細胞重要的生物學(xué)特征之一。腫瘤細胞往往具有較高的活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平，從而造成氧化應(yīng)激。一定閾值的氧化應(yīng)激可調(diào)節(jié)ROS參與激活細胞增殖、分化、衰老、轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)等其他調(diào)節(jié)通路［23］，而在活性氧濃度急速升高等過度應(yīng)激條件下，ROS打破細胞內(nèi)氧化還原平衡，誘導(dǎo)細胞發(fā)生凋亡、壞死［24］。因此腫瘤細胞在較高ROS水平時，會激活細胞內(nèi)抗氧化系統(tǒng)提高GSH的產(chǎn)生速率，以維持胞內(nèi)的氧化還原狀態(tài)。

在腫瘤細胞中ATP依賴性的谷氨酸-半胱氨酸連接酶（glutamate-cysteine ligase，GCL）催化半胱氨酸與谷氨酸結(jié)合生成γ-谷氨酰半胱氨酸，谷胱甘肽合成酶（glutathione synthase，GS）催化甘氨酸與γ-谷氨酰半胱氨酸結(jié)合最終生成谷胱甘肽［25］。GCLM是GCL的調(diào)節(jié)亞基，基因敲除GCLM小鼠的定量代謝組學(xué)，發(fā)現(xiàn)GSH降低，谷氨酸和胱氨酸水平升高，抑制GSH的合成可導(dǎo)致活性氧積累，胃癌細胞死亡［26］。ATF3是ATF/CREB轉(zhuǎn)錄因子家族成員，可由DNA損傷、氧化應(yīng)激和細胞損傷誘導(dǎo)激活。研究發(fā)現(xiàn)，在鐵死亡激活劑Erastin處理的人纖維肉瘤細胞HT1080中，ATF3表達增加，C11-BODIPY檢測的脂質(zhì)過氧化物水平升高30%；敲除ATF3后，GSH水平提高［27］，全基因組芯片序列分析顯示，ATF3以p53非依賴性的方式與SLC7A11啟動子結(jié)合，并抑制SLC7A11的轉(zhuǎn)錄功能。說明氧化還原相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子ATF3通過調(diào)控SLC7A11進而調(diào)節(jié)GSH，阻斷脂質(zhì)過氧化過程以應(yīng)對氧化壓力。通過闡明腫瘤細胞以調(diào)控半胱氨酸轉(zhuǎn)運能力來平衡細胞內(nèi)氧化還原水平的分子機制，有望發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激相關(guān)的潛在靶點。

2.2 半胱氨酸代謝與能量代謝

腫瘤細胞需要一定濃度的NADPH以維持細胞內(nèi)能量代謝平衡。與正常細胞類似，腫瘤細胞的NADPH來自于磷酸戊糖途徑和檸檬酸-丙酮酸循環(huán)，而脂肪酸、GSH合成等會消耗NADPH，并且在胱氨酸轉(zhuǎn)運進入細胞后，胱氨酸與消耗NADPH，生成NADP+和半胱氨酸。Liu等［28］發(fā)現(xiàn)，葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白GLUT的靶向抑制劑KL-11743處理肺鱗癌異種移植小鼠，KL-11743處理組磷酸戊糖中間體6-磷酸葡萄糖減少50%，高表達SLC7A11腫瘤中NADP+/NADPH比率顯著提高，說明高表達SLC7A11的腫瘤對GULT抑制更加敏感。同時，在腎癌786-O細胞中葡萄糖饑餓限制磷酸戊糖途徑，顯著提高胱氨酸饑餓敏感的胱氨酸水平，γ-谷氨酰胱氨酸（γ-glutamylcystine）等二硫化合物積累，NADP+/NADPH比率增加，可見胱氨酸和其他二硫化物的積累、NADPH耗竭、葡萄糖饑餓等多種原因共同引起腫瘤細胞死亡。說明通過耗竭胱氨酸代謝與能量代謝交點的NADPH可以促進腫瘤細胞發(fā)生能量紊亂，進而促進腫瘤死亡。

2.3 半胱氨酸代謝與細胞自噬

自噬是細胞在營養(yǎng)壓力、低氧應(yīng)激條件下維持自身穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)機制，主要通過泛素蛋白酶體和溶酶體兩種途徑，降解非必要組分以獲得氨基酸等營養(yǎng)物質(zhì)和能量，是細胞對抗外界不利環(huán)境的自我保護手段。當(dāng)半胱氨酸缺乏時，腫瘤細胞可藉由溶酶體途徑降解無用的蛋白質(zhì)而獲得半胱氨酸，通過溶酶體胱氨酸轉(zhuǎn)運蛋白（cystinosin，CTNS）將半胱氨酸轉(zhuǎn)出溶酶體［29-30］，以在半胱氨酸缺乏的條件下獲得半胱氨酸。半胱胺是一種氨基硫醇類化合物，最初用于治療胱氨酸積聚于溶酶體導(dǎo)致的胱氨酸病，近年因具有可誘導(dǎo)形成自噬降解活性，而用于腫瘤治療［31］。Fujisawa等［32］發(fā)現(xiàn)，半胱胺可抑制人胰腺癌細胞MIA PaCa-2的遷移和侵襲，胰腺癌荷瘤小鼠給藥250 mg/kg半胱胺連續(xù)30 d，腫瘤轉(zhuǎn)移的總重量減少約90%。Andrzejewska等［33］通過免疫共沉淀和質(zhì)譜檢測發(fā)現(xiàn)，CTNS與mTORC1信號通路的p18，p14和Mp1蛋白質(zhì)相互作用。免疫熒光顯示在回補半胱氨酸后，敲除CTNS的腎外皮細胞中mTOR途徑仍處于下調(diào)狀態(tài)，說明CTNS在mTORC1信號通路中作用于Rags的上游。通過對CTNS進行干擾，實現(xiàn)從自噬通路mTOR途徑的源頭調(diào)節(jié)。

3 靶向半胱氨酸代謝途徑的腫瘤治療

抗腫瘤治療包括放療、化療和免疫療法等，但由于靶向性欠佳以及耐藥等問題，如何延長腫瘤患者生存期并提高生存質(zhì)量已成為亟待解決的臨床難題。半胱氨酸代謝的多種酶和代謝物是潛在的治療靶點，研究半胱氨酸代謝途徑為腫瘤治療和新藥研發(fā)提供重要方向（表2）。

表2 靶向半胱氨酸代謝的腫瘤治療

3.1 靶向CSE的腫瘤治療

CSE是轉(zhuǎn)硫途徑生成半胱氨酸的關(guān)鍵酶，在腫瘤細胞增殖、遷移、遠端轉(zhuǎn)移方面發(fā)揮重要作用。Youness等［34］對80位乳腺癌患者活檢組織進行了qPCR分析，顯示乳腺癌組織中CSE的mRNA含量是同一患者正常乳腺組織的4倍，且高腫瘤增殖指數(shù)（Ki-67）中的CSE水平也相應(yīng)增加。金精三羧酸選擇性結(jié)合CSE活性位點的Arg和Tyr殘基，抑制其活性。Wang等［35］對腫瘤基因組數(shù)據(jù)庫（The Cancer Genome Atlas，TCGA）的469份前列腺癌樣本和50份正常組織標(biāo)本進行生物信息學(xué)分析，CSE在前列腺癌組織中呈高表達水平，8年隨訪的生存曲線表明，高表達CSE的患者生存率低于低表達組，低表達組生存期延長了20個月。胰腺癌和低度神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者中也發(fā)現(xiàn)同樣規(guī)律。敲低CSE的前列腺癌細胞PC3，IL-1β減少，說明CSE通過抑制NF-κΒ-IL-1β介導(dǎo)的信號通路抑制侵襲。敲低CSE的PC3細胞原位移植到裸鼠上，60 d腫瘤體積約為未敲除組50%，主動脈淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移發(fā)生率為40%，僅是未敲除組一半。雖然在不同腫瘤中都高表達，是一種潛在的腫瘤治療靶點，但針對CSE的抑制劑及治療方法尚處于實驗室研究階段。

3.2 靶向GPX4的腫瘤治療

谷胱甘肽過氧化物酶4（glutathione peroxidase 4，GPX4）是含硒的磷脂過氧化酶，通過將脂質(zhì)氫過氧化物還原為脂質(zhì)醇，維持胞內(nèi)的還原狀態(tài)，保護細胞免受脂質(zhì)過氧化引起的鐵死亡。最新研究發(fā)現(xiàn)，皰疹病毒HSV-1感染的小鼠GPX4通過抑制細胞膜脂質(zhì)過氧化激活cGAS-STING通路，GPX4失活則導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化產(chǎn)生，使得STING第88位半胱氨酸發(fā)生羰基化，抑制STING棕櫚?；陀蓛?nèi)質(zhì)網(wǎng)向高爾基體的轉(zhuǎn)位［36］。雙敲除GPX4和KRAS的胰腺癌小鼠腫瘤轉(zhuǎn)移至肝和肺，轉(zhuǎn)移率為50%，而對照組轉(zhuǎn)移率為20%。敲除GPX4小鼠血清中DNA氧化損傷產(chǎn)物8-OHG增加，免疫熒光顯示胰腺癌小鼠組織中cGAS與DNA結(jié)合啟動STING依賴性反應(yīng)，從而促進巨噬細胞浸潤和活化［37-38］。

烷化劑RSL3和ML162都是GPX4抑制劑，通過活化的烷基氯與催化中心的硒代半胱氨酸殘基共價結(jié)合。RSL3可以誘導(dǎo)順鉑耐藥頭頸癌HN3細胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，通過PERK-ATF4-SENSN2途徑表達p62，細胞對化療藥物敏感性增加，敲低GPX4顯著提高了RSL3耐藥的HN3細胞對RSL3的敏感性［39］。ML162則使乳腺癌細胞GPX4活力降低50%。腫瘤內(nèi)給藥每周50 mg/kg處理MDAMB-231原位乳腺癌小鼠2周，腫瘤重量較對照組減半［40］。但是這些烷化劑的藥代動力學(xué)性質(zhì)不佳，穩(wěn)定性差，ML210則是一種新型抑制劑，需在細胞內(nèi)轉(zhuǎn)化為α-硝基酮肟JKE-1674，JKE-1674發(fā)生脫水反應(yīng)生成不穩(wěn)定的呋喃雜環(huán)，開環(huán)異構(gòu)化生成選擇性結(jié)合GPX4硒代半胱氨酸殘基的腈氧親電體。與其他選擇性和穩(wěn)定性較差的GPX4抑制劑不同的是，LC-MS監(jiān)測小鼠經(jīng)口給予ML210后24 h內(nèi)血漿穩(wěn)定性高達99%，全基因組CRISPR文庫篩選證明ML210具有更高的選擇性［41］。可見針對GPX4及其藥物篩選的研究將是未來新藥研發(fā)的重點之一。

3.3 靶向System xc-的腫瘤治療

System xc-屬于異二聚氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白家族，由輕鏈SLC7A11和重鏈SLC3A2組成，負責(zé)將外源的胱氨酸轉(zhuǎn)運進入細胞，將細胞內(nèi)等比例的谷氨酸轉(zhuǎn)運至細胞外。近年研究發(fā)現(xiàn)System xc-在非小細胞肺癌、口腔癌、前列腺癌、惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤等腫瘤中高表達，與腫瘤的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移和耐藥密切相關(guān)［42］。

免疫療法包括免疫檢查點的抑制劑與過繼細胞療法（CAR-T），在腫瘤免疫中得到廣泛應(yīng)用，已成為腫瘤治療的支柱之一［43-44］?？笴TLA4的免疫治療激活CD8+T釋放IFNγ，放療和IFNγ聯(lián)合治療通過ATM和STAT1信號協(xié)同抑制從而下調(diào)System xc-的表達，大大減少人纖維肉瘤細胞中胱氨酸的攝取［45］。Wang等［46］發(fā)現(xiàn)，使用PD-L1抗體治療黑色素瘤小鼠，激活的CD8+T細胞通過IFNγ驅(qū)動脂質(zhì)過氧化，從而造成脂質(zhì)過氧化物在腫瘤細胞中積累，抑制System xc-的表達使腫瘤細胞發(fā)生鐵死亡。除免疫療法外，臨床使用索拉非尼、柳氮磺吡啶、蘭吡立松靶向System xc-治療前列腺癌、肝癌等疾病已見成效［47］。這提示靶向System xc-的腫瘤治療可以與免疫治療聯(lián)用，多類型藥物之間互為補充，增強靶向腫瘤細胞的精準(zhǔn)程度。目前針對以System xc-為靶點的腫瘤免疫治療研究相對較少，針對System xc-的免疫應(yīng)答進行深入的理論研究，有望為未來腫瘤研究提供新的方向。

4 總結(jié)與展望

半胱氨酸是一種生物體內(nèi)常見的氨基酸，在氧化應(yīng)激、能量代謝、細胞鐵死亡、細胞自噬方面發(fā)揮著重要作用。包含多種代謝產(chǎn)物和副產(chǎn)物的半胱氨酸代謝途徑促進或抑制腫瘤細胞增殖、遷移、侵襲，為腫瘤研究提供了新的方向。通過調(diào)控半胱氨酸代謝網(wǎng)絡(luò)中的代謝物和酶，從而實現(xiàn)對腫瘤病理活動的調(diào)節(jié)，以此進行基礎(chǔ)理論研究發(fā)現(xiàn)潛在的藥物靶點，具有廣闊的前景和臨床意義。