Anti-PD-L1&CXCR4雙特異性納米抗體的純化與活性

徐舒怡，李雅賢，胡 海，張 莉，邊延林，朱建偉，吳明媛*

（1上海交通大學藥學院細胞工程及抗體藥物教育部工程研究中心，上海 200240；2上海交通大學分析測試中心，上海 200240）

納米抗體（nanobody，Nb），即重鏈單域抗體（variable domain of heavy chain of heavy-chain antibody，VHH），是在駱駝體內發(fā)現(xiàn)的一種納米尺寸的天然抗體，相對分子質量約為15 kD，是常規(guī)抗體的十分之一［1］。納米抗體僅含有3個互補決定區(qū)（CDR），其中CDR3區(qū)域呈明顯的長環(huán)狀結構，有利于與隱蔽的抗原表位結合［2］。納米抗體的尺寸較小，可以穿過機體組織生理屏障或者狹小區(qū)域到達靶器官；具有良好的熱穩(wěn)定性和水溶性，可在大腸埃希菌、酵母等表達系統(tǒng)中大規(guī)模生產(chǎn)［3］；同時，納米抗體制備簡單，可用于構建多種分子結構，包括具有雙特異性或雙功能的抗體，能夠避免重鏈和輕鏈的錯配，從而簡化分離、純化步驟以提高質量和產(chǎn)率［4］，已成為抗體藥物研發(fā)領域的熱點。2018年，第1個納米抗體藥物Caplacizumab獲歐洲藥物管理局批準上市，由針對血管性血友病因子的VHH二聚體組成，用于治療成人獲得性血栓性血小板減少性紫癜（aTTP）［5］。

過去數(shù)十年中，免疫檢查點抑制劑改寫了腫瘤治療的歷史，將晚期腫瘤的藥物治療向前推進了一大步。免疫檢查點療法的靶點主要包括細胞毒性T淋巴細胞相關蛋白4（CTLA-4）、程序性死亡蛋白-1及其配體（PD-1/PD-L1）［6］。PD-1由活化T細胞表達，而PD-L1常在腫瘤細胞上表達。腫瘤細胞會利用其表面過表達的PD-L1，抑制T細胞的活化，引起T細胞凋亡，從而躲避免疫監(jiān)視和免疫攻擊［7］。拮抗負調控信號PD-1/PD-L1，有利于T細胞持續(xù)活化，殺傷或抑制腫瘤細胞生長［8-9］。目前，抗PD-1/PD-L1免疫檢查點療法的響應率仍然較低，其中腫瘤微環(huán)境中T淋巴細胞浸潤不足是限制臨床療效的關鍵因素［10］，腫瘤周圍的免疫抑制性微環(huán)境也阻止了活化的淋巴細胞進入腫瘤部位［11］。有證據(jù)表明，腫瘤微環(huán)境中的趨化因子CXCL12能夠支持腫瘤基質的生長，募集腫瘤相關巨噬細胞（TAM）、腫瘤相關成纖維細胞（CAF）等，形成物理屏障，保護腫瘤細胞免受藥物和免疫系統(tǒng)的殺傷［12］。其受體CXCR4在多種腫瘤中高表達，如胰腺癌、乳腺癌和轉移性結直腸癌等。CXCR4/CXCL12信號軸在腫瘤的生長、血管生成、侵襲轉移和化療耐藥中起到關鍵作用［13］，而CXCR4拮抗劑以多種作用模式影響腫瘤微環(huán)境，包括誘導免疫細胞遷移、增加效應T細胞的浸潤、減少腫瘤微環(huán)境中免疫抑制細胞，提高了胰腺癌等惡性腫瘤對免疫檢查點抑制劑和化療藥物的敏感性［14-15］。因此，拮抗CXCR4/CXCL12和PD-1/PD-L1的藥物組合能夠逆轉免疫抑制性腫瘤微環(huán)境，增強了免疫系統(tǒng)對腫瘤細胞的殺傷效果［16］。

本研究針對PD-L1和CXCR4兩個靶點，設計并構建了anti-PD-L1&CXCR4雙特異性納米抗體的重組表達載體，通過大腸埃希菌表達系統(tǒng)，設計不同的純化策略，來獲得純度和產(chǎn)量較高的目的蛋白，體外實驗證明具有特異性的雙抗原結合能力和生物學活性，為進一步研究雙特異性納米抗體的抗腫瘤免疫治療提供了依據(jù)。

1 材料

1.1 試 劑

Ficoll-Paque PLUS淋巴細胞分離液（美國GE公司）；重組人白細胞介素-2（IL-2，上海華新生物高技術有限公司）；小鼠抗多組氨酸標簽單克隆抗體（美國Proteintech Group公司）；異硫氰酸熒光素（FITC）標記的小鼠抗多組氨酸標簽單克隆抗體（美國Thermo Fisher Scientific公司）；小鼠抗人PDL1單克隆抗體（北京義翹神州科技有限公司）；重組兔抗人CXCR4單克隆抗體（美國Abcam公司）；Alexa Fluor 488標記的驢抗小鼠IgG第二抗體、Alexa Fluor 647標記的羊抗兔IgG第二抗體、過氧化物酶標記的羊抗小鼠IgG第二抗體（上海翊圣生物科技有限公司）；BCA蛋白濃度測定試劑盒（碧云天生物技術有限公司）；乳酸脫氫酶（LDH）殺傷活性檢測試劑盒（美國Promega公司）；其他試劑均為市售分析純。

1.2 儀 器

Tanon-5200Multi凝膠成像分析系統(tǒng)（上海天能科技有限公司）；Infinite M200 PRO多功能酶標儀（瑞士Tecan公司）；Cytoflex型流式細胞儀（美國Beckman Coulter公司）；蛋白分離純化系統(tǒng)?KTA Start、HisTrap FF親和色譜柱（美國GE公司）。

1.3 菌株和細胞株

感受態(tài)大腸埃希菌BL21（DE3）菌株（上海唯地生物技術有限公司）；人白血病T淋巴細胞株Jurkat、人神經(jīng)膠質瘤細胞株U251-MG、人轉移胰腺癌細胞株AsPC-1購自中科院上海生命科學研究院細胞資源中心；健康志愿者外周血由上海長海醫(yī)院輸血科提供。

2 方法

2.1 重組表達質粒的構建和轉化

anti-PD-L1和anti-CXCR4的納米抗體基因序列均由文獻獲得［17-18］，兩部分由linker（3個G4S短肽）連接起來，C端加入多組氨酸標簽（6×His標簽），組裝為anti-PD-L1&CXCR4雙特異性納米抗體（簡稱為BsNb PX4）的基因序列。將該基因序列轉入到pET-22b（+）載體中，酶切位點為NcoⅠ與EcoRⅠ，構建BsNb PX4的重組質粒，以上均由南京金斯瑞公司合成。

2.2 目的基因的誘導表達

將重組表達質粒pET22b-BsNb PX4轉化E.coliBL21（DE3），篩選陽性克隆并抽提質粒，經(jīng)過DNA測序確認。接種于含氨芐青霉素（Amp）的LB培養(yǎng)基5 mL中，37℃，220 r/min搖床培養(yǎng)過夜后全部轉接至含Amp的TB培養(yǎng)基500 mL，繼續(xù)培養(yǎng)至菌液A600達到0.6~0.8，加入IPTG至終濃度為0.1 mmol/L，25℃誘導18 h后收集菌液。

2.3 anti-PD-L1&CXCR4雙特異性納米抗體的純化

離心收集菌液500 mL，向菌體沉淀加入破菌緩沖液（PBS）25 mL，冰浴超聲重懸，高壓勻質儀多次循環(huán)充分破碎菌體，即機械裂解法破菌；或向菌體沉淀加入高濃度蔗糖-三羥甲基甲胺基乙磺酸（TES）溶液25 mL，冰上充分振搖1 h后，再加入原濃度1/4的蔗糖-TES溶液50 mL，繼續(xù)冰浴振搖45 min，即低溫滲透壓休克法提取周質空間蛋白。菌體裂解后的樣品12 000 r/min，4℃，離心30 min，收集上清液。菌體裂解后上清液通過親和色譜純化，結合緩沖液（pH 7.4）平衡HisTrap FF柱，上樣結束后用洗脫緩沖液進行分部梯度洗脫，收集洗脫峰。菌體裂解方式、裂解緩沖液、結合緩沖液和洗脫緩沖液如表1所示。

Table 1 Cell disruption techniques and buffers of 3 purification methods

考馬斯亮藍R-250染色和Western blot對洗脫峰樣品進行鑒定。將目的蛋白在4℃透析24 h，去除咪唑；使用超濾離心管，4 000 r/min，4℃，離心30 min，濃縮蛋白，使用BCA試劑盒測定蛋白濃度。

2.4 anti-PD-L1&CXCR4雙特異性納米抗體的抗原結合能力分析

分別取對數(shù)生長期的懸浮細胞Jurkat和貼壁細胞U251-MG、AsPC-1，用含2%FBS的PBS溶液重懸洗滌2次，1 200 r/min離心5 min。吸棄上清液，加入含2%FBS的PBS溶液200μL重懸細胞，分別在細胞樣品中加入BsNb PX4 1μg作為一抗，F(xiàn)ITC標記的小鼠抗多組氨酸標簽單克隆抗體作為熒光二抗，分別選用小鼠抗人PD-L1單克隆抗體與重組兔抗人CXCR4單克隆抗體作為陽性對照的一抗，Alexa Fluor 488標記的驢抗小鼠IgG第二抗體、Alexa Fluor 647標記的羊抗兔IgG第二抗體作為對應的熒光二抗。4℃避光孵育30 min后，用PBST洗滌2次，重懸于2%FBS的PBS溶液，終體積為100μL。流式細胞儀檢測腫瘤細胞PD-L1和CXCR4的抗原表達情況，分析BsNb PX4的抗原結合能力。

2.5 anti-PD-L1&CXCR4雙特異性納米抗體的生物活性檢測

2.5.1 人外周血單核細胞（PBMC）的分離 取新鮮健康志愿者外周血，與DPBS按1∶7比例稀釋混勻后，加入到Ficoll-Paque PLUS淋巴細胞分離液，1 200 r/min，20℃梯度離心30 min，吸取中間白霧層，分別用DPBS和含10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基洗滌兩次，調整細胞濃度至每毫升1×106個細胞備用。

2.5.2 LDH法檢測PBMC對胰腺癌細胞的殺傷將生長狀態(tài)良好的胰腺癌細胞AsPC-1用0.25%的胰酶消化、計數(shù)，用含10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基重懸，調整細胞濃度為每毫升3×104個細胞。將AsPC-1細胞均勻鋪于96孔板，每孔100μL，置于37℃，貼壁培養(yǎng)12 h。取新鮮分離的人PBMC用含10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基重懸，調整細胞密度，鋪于96孔板，每孔50μL，使效應細胞與靶細胞的比例為10∶1或15∶1，共培養(yǎng)24 h，然后加入IL-2（工作濃度100 IU/mL），置于37℃培養(yǎng)箱，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。BsNb PX4分別用含2% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基稀釋，每孔加入50μL，終濃度為0.5μmol/L，對照組加入等體積含2% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基，繼續(xù)孵育48 h。檢測前，在靶細胞最大釋放組中添加10%Triton X-100裂解液，每孔20μL，置于37℃培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育20 min。水平離心后，轉移上清液50μL至全新的96孔板中，每孔加入LDH基質液50μL，室溫孵育20 min，每孔加入終止液50μL終止反應并記錄A490。

殺傷率（%）=（實驗組吸收度-效應細胞釋放組吸收度-靶細胞釋放組吸收度）/（靶細胞最大釋放組吸收度-靶細胞釋放組吸收度）×100。

2.6 統(tǒng)計學處理

應用SPSS 23.0統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)進行單因素方差分析（One-Way ANOVA），組間比較采用Tukey檢驗，實驗數(shù)據(jù)以±s,表示，P<0.05具有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 anti-PD-L1&CXCR4雙特異性納米抗體的構建和表達

如圖1-A所示，選取pET-22b載體，構建anti-PD-L1&CXCR4雙特異性納米抗體的重組質粒，由上海生工生物工程技術服務有限公司測序，序列正確。anti-PD-L1&CXCR4雙特異性納米抗體基因序列全長1 263 bp，編碼421個氨基酸，相對分子質量為43.8 kD。

將測序正確的重組表達質粒pET22b-BsNb PX4轉化E.coliBL21（DE3），TB培養(yǎng)基用于菌體擴增和蛋白表達。當菌液A600為0.6~0.8時，加入IPTG誘導目的蛋白表達。將誘導培養(yǎng)18 h的重組大腸埃希菌破碎處理，經(jīng)SDS-PAGE和Western blot檢測，如圖1-A和圖1-B所示，誘導后的全菌液在44 kD附近出現(xiàn)條帶，符合預期產(chǎn)物的相對分子質量大小，并且能與抗多組氨酸標簽單克隆抗體特異性地結合，說明anti-PD-L1&CXCR4雙特異性納米抗體能夠在大腸埃希菌中經(jīng)IPTG誘導表達。

Figure 1 Construction and expression of recombinant protein

3.2 anti-PD-L1&CXCR4雙特異性納米抗體的親和純化

如圖2-A所示，采用方法（1）純化后的色譜圖譜共出現(xiàn)6個峰，經(jīng)SDS-PAGE證實前4個峰所得到的樣品雜蛋白較多，但在50%和100%洗脫緩沖液（圖中以50% B和100% B表示）中，得到相對分子質量約44 kD的目的條帶，純度較高，基本無雜質被洗脫。如圖2-B所示，含目的蛋白的上清液經(jīng)方法（2）進行親和色譜，在用20%洗脫緩沖液洗脫時，BsNb PX4被大量洗脫且洗脫峰獨立，雜蛋白含量較少。如圖2-C所示，方法（3）只出現(xiàn)一個洗脫峰，但與方法（2）相比，20%洗脫緩沖液的洗脫峰顯示有多個雜帶。因此，收集方法（1）的50%和100%洗脫緩沖液的洗脫峰，分別合并方法（2）和方法（3）的20%洗脫緩沖液的洗脫峰各管樣品，透析去除咪唑，超濾濃縮。

Figure 2 Affinity purification process of BsNb PX4

SDS-PAGE和Western blot檢測透析后得到的目的蛋白相對分子質量和特異性，如圖3所示，在44 kD出現(xiàn)特異性條帶，與預期的雙特異性納米抗體相對分子質量相符。但是在30 kD左右存在一條雜帶，推測其為C端帶有多組氨酸標簽的anti-CXCR4-VHH（二價納米抗體），可能是雙特異性納米抗體表達分泌過程中由宿主蛋白酶降解得到的產(chǎn)物。

用BCA法對3種目的蛋白進行定量分析，結果如表2所示，方法（1）獲得的BsNb PX4產(chǎn)量約1.12 mg/L，凝膠成像系統(tǒng)掃描顯示目的蛋白純度在97%以上；方法（2）獲得的BsNb PX4產(chǎn)量約1.34 mg/L，純度接近90%；方法（3）獲得的BsNb PX4產(chǎn)量約7.0 mg/L，但樣品中仍含有較多的雜蛋白。因此，后續(xù)選擇方法（1）制備得到純度最高的BsNb PX4進行抗原結合和體外生物學活性檢測。

3.3 anti-PD-L1&CXCR4雙特異性納米抗體的抗原結合能力

流式分析雙特異性納米抗體結合抗原的能力，如圖4所示，U251-MG細胞株針對PD-L1抗原顯示出明顯的熒光信號偏移，呈高陽性表達，而兔抗人CXCR4 IgG抗體和羊抗兔IgG-FITC熒光抗體組合相較于單染羊抗兔IgG-FITC熒光抗體的陰性對照并無變化；Jurkat細胞株為CXCR4陽性細胞株，在靜息條件下其細胞膜表面PD-L1抗原無表達，實驗結果與文獻報道一致［19］。

Figure 3 SDS-PAGE and Western blot detection of the dialyzed main elution peak sample

Table 2 Yield and purity of products obtained by 3 purification methods

由于雙特異性納米抗體帶有6×His標簽，可用FITC偶聯(lián)的anti-6×His標簽抗體作為熒光標記。如圖5所示，BsNb PX4在U251-MG細胞上（PD-L1+、CXCR4-）均能夠檢測到與PD-L1分子結合后產(chǎn)生的熒光信號偏移；在Jurkat細胞上（PDL1-、CXCR4+）也具有與CXCR4抗原的結合能力，證實了純化得到的雙特異性納米抗體對兩個靶點均具有結合活性。此外，BsNb PX4與同時表達PD-L1和CXCR4抗原的AsPC-1細胞也有較為明顯的結合。

Figure 4 Detection of PD-L1 or CXCR4 expression in tumor cell line by flow cytometry

3.4 anti-PD-L1&CXCR4雙特異性納米抗體的抗腫瘤活性

在anti-PD-L1&CXCR4雙特異性納米抗體0.5μmol/L條件下，PBMC與靶細胞AsPC-1繼續(xù)孵育48 h后進行LDH釋放檢測，分析PBMC對AsPC-1細胞的殺傷效應。如圖6所示，與空白對照組相比，BsNb PX4單獨作用于共孵育體系，PBMC的殺傷活性有所增強，推測可能是雙特異性納米抗體識別了PBMC中T細胞表面的CXCR4，同時與AsPC-1細胞上的PD-L1結合，可以將效應T細胞募集到腫瘤細胞周圍，增強其細胞毒性［20］。另一方面，當PBMC與AsPC-1細胞數(shù)之比為10∶1和15∶1時，BsNb PX4聯(lián)合IL-2能夠顯著提高PBMC對腫瘤細胞的殺傷，與IL-2組相比有統(tǒng)計學差異，具有協(xié)同效應。這些結果與文獻結論是相符的，IL-2可刺激CD8+T細胞、NK細胞等擴增，同時細胞表面的PD-L1表達增高，證明其與PD-L1抑制劑具有潛在協(xié)同作用機制［21］；而通過抑制CXCR4可以導致CD8+T細胞遷移到癌細胞富集的區(qū)域，然后阻斷PD-1/PD-L1通路能夠重新激活對癌細胞的殺傷作用，以上表明PD-1/PD-L1和CXCR4/CXCL12軸的聯(lián)合阻斷有望成為胰腺癌的新型治療策略［22］。

Figure 5 FACS analysis of BsNb PX4 binding to tumor cells

Figure 6 In vitro cytotoxicity of peripheral blood mononuclear cells(PBMC)with IL-2 and BsNb PX4 treatment using lactate dehydrogenase(LDH)released assay(±s,,n=3)

4 討論

在本研究中設計的anti-PD-L1&CXCR4雙特異性納米抗體基因上游含有編碼細菌pelB蛋白的信號肽序列，可引導融合蛋白分泌至大腸埃希菌的周質空間中，并以可溶形式存在；通過改變破菌提取蛋白的方法，調整純化緩沖溶液中鹽離子濃度和咪唑濃度，使用3種不同方法對BsNb PX4進行純化，以純度為判斷標準，確定了合適的納米抗體制備方案。治療性抗體的工藝相關雜質（宿主細胞蛋白質等）不僅影響藥物的穩(wěn)定性和活性，而且還可能導致有害的免疫反應［23］。因此，抗體的純化條件必須優(yōu)化，例如采用分部或者線性梯度洗脫、確定結合和洗脫過程中合適的鹽離子濃度和pH。在用親和色譜純化His標記的蛋白質時，通常將咪唑添加到結合緩沖液中以調節(jié)非特異性結合。但是，在分析親和色譜圖和洗脫峰的SDSPAGE電泳結果后，發(fā)現(xiàn)方法（1）將結合緩沖液更換成不含咪唑的低濃度NaCl溶液，同時在洗脫緩沖液中增加咪唑的含量并提高溶液的pH，通過分部梯度洗脫可以將目的蛋白和雜質幾乎完全分開，BsNb PX4的最終純度達到97%以上。對比同樣使用機械裂解法提取蛋白的方法（3），降低結合緩沖液中的咪唑和鹽離子濃度可能提高了目的蛋白的掛柱率，而洗脫液的pH和咪唑濃度影響了目的蛋白的洗脫效果，導致不同方法獲得的BsNb PX4純度有明顯區(qū)別。方法（2）中高濃度蔗糖-TES溶液介導的低溫滲透壓休克法提取蛋白，雖然出峰過程簡單，產(chǎn)量相近，但目的蛋白的純度下降至87%，后續(xù)仍需增加離子交換或分子篩色譜處理，過程相對繁瑣。

因此，方法（1）得到的anti-PD-L1&CXCR4雙特異性納米抗體純度滿足了臨床前的研發(fā)要求，流式檢測證明其與細胞表面的兩個靶抗原特異性結合，說明該結構的雙特異性納米抗體能夠正確折疊形成抗原結合域并保持分子完整性。同時，生物學活性結果也表明洗脫條件溫和，不會導致目的蛋白失活。該方案的設計是一步純化法，具有操作簡單，成本低等優(yōu)點，也適用于含His標簽等多種類型的蛋白質純化，具有廣泛的應用價值。

當然，在納米抗體的純化過程中也存在諸多問題，如產(chǎn)量和回收率還相對較低。如何在保證高純度的前提下實現(xiàn)抗體產(chǎn)量的最大化，一直是生物制藥領域的難題，需要進一步摸索和優(yōu)化工藝。此外，雙特異性納米抗體增強PBMC對腫瘤細胞殺傷效應的機制也亟待深入探究和驗證。