角膜營(yíng)養(yǎng)不良家系的共焦顯微鏡觀察研究

應(yīng)方微，唐松，張醇，黎明

(深圳市眼科醫(yī)院病理室，深圳市眼科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，暨南大學(xué)附屬深圳市眼科醫(yī)院，廣東 深圳 518040)

角膜營(yíng)養(yǎng)不良是一組與遺傳有關(guān)的，具有病理組織學(xué)特征的疾病[1]?，F(xiàn)對(duì)深圳地區(qū)的一個(gè)角膜營(yíng)養(yǎng)不良家系中的4名患者的患病角膜進(jìn)行病理及共焦顯微鏡的觀察研究。

1 材料與方法

1.1 材料

深圳地區(qū)一個(gè)角膜營(yíng)養(yǎng)不良家系顆粒狀角膜營(yíng)養(yǎng)不良角膜患者4名(6只眼)角膜。

1.2 病例資料

病例1，男，25歲，臨床診斷為角膜營(yíng)養(yǎng)不良，行右眼穿透性角膜移植術(shù)+前房成形術(shù)，術(shù)后病理診斷為“顆粒性角膜營(yíng)養(yǎng)不良”，目前隨訪無(wú)異常。在問詢病史時(shí)，得知該患者的數(shù)名親屬有類似病癥，故對(duì)該家庭成員進(jìn)行了探訪，發(fā)現(xiàn)了1個(gè)顆粒狀角膜營(yíng)養(yǎng)不良的家系。

1.3 HE 染色

對(duì)角膜營(yíng)養(yǎng)不良家系顆粒狀角膜營(yíng)養(yǎng)不良角膜6例角膜進(jìn)行常規(guī)固定脫水后，石蠟包埋、切片后常規(guī)HE染色，置于顯微鏡下觀察。

1.4 角膜激光共焦顯微鏡檢查

1.4.1 儀器

角膜激光共焦顯微鏡(Heidel berg Rostock Cornea Module，Heidelberg Engineering Inc，Germany)購(gòu)自德國(guó)海德堡公司，主要裝置為Rostock角膜纖維物，外部電子部件為Heidelberg Eye Explorer，Heidelberg Eye Explorer License Manager，Heidelberg Retina Tomograph III Cornea Module系統(tǒng)。

1.4.2 主要參數(shù)

放大倍數(shù)為800×，激光源為670 nm波長(zhǎng)，二維圖像大小為384×384像素。顯微物鏡的屈光度設(shè)定為+12 D，深度值應(yīng)在?150 μm和+150 μm之間。

1.4.3 操作步驟

用0.5%愛爾凱因表面麻醉3次；清潔纖維鏡頭的前表面，鏡頭的前表面點(diǎn)一大滴Vidisic?凝膠，避免氣泡逸入；無(wú)菌角膜接觸鏡安裝于物鏡頭上，患者注視前方的固視光點(diǎn)，調(diào)節(jié)圖像傳感器(charge-coupled device，CCD)的光軸與激光掃描攝像頭的光軸垂直。將激光掃描攝像頭前移，使角膜接觸帽接觸患者角膜，觀察到角膜圖像時(shí)，微調(diào)焦距，掃描角膜各層的圖像并記錄。

1.4.4 圖像及數(shù)據(jù)處理

應(yīng)用NAVIS圖像軟件系統(tǒng)和Heidelberg Retina Tomograph III Cornea Module圖像分析軟件進(jìn)行觀察、對(duì)比。

2 結(jié)果

2.1 臨床病理情況

該家系共5例患者發(fā)病，年齡最小的為25歲男性，年齡最大為76歲女性(拒絕治療)，其余共4例發(fā)病患者均進(jìn)行了單眼或雙眼的穿透性角膜移植手術(shù)，隨訪狀況均良好。除1例36歲男性患者訴角膜開始出現(xiàn)混濁癥狀10年，其余各位患者均為自幼發(fā)病，角膜混濁，視力逐漸模糊。裂隙燈檢查可見患者角膜上皮下，基質(zhì)層均可看到彌散圓形面包屑樣點(diǎn)狀混濁(圖1)，有時(shí)可見基質(zhì)融合片狀混濁，病變可涉及到基質(zhì)全層。

圖1 裂隙燈下前段照相 Figure 1 Slit lamp front section photography

2.2 病例家系圖

該家系發(fā)病患者5例，女性患者2例，男性患者3例，可查三代內(nèi)均有患者分布(圖2)。

圖2 顆粒狀角膜營(yíng)養(yǎng)不良家系圖Figure 2 Family of granular corneal dystrophy

2.3 HE 染色

可見角膜上皮變性，厚薄不均，前彈力層消失，自上皮下至全層基質(zhì)見嗜伊紅顆粒狀沉積物沉積(圖3)，診為顆粒狀角膜營(yíng)養(yǎng)不良。

圖3 顆粒狀角膜營(yíng)養(yǎng)不良病理圖像(HE，×100)Figure 3 Pathologic image of granular corneal dystrophy (HE,×100)

2.4 角膜激光共焦顯微鏡觀察

患病角膜上皮細(xì)胞往往結(jié)構(gòu)尚清晰，基質(zhì)可見大片的混濁，基質(zhì)細(xì)胞缺失，顆粒狀沉積物表現(xiàn)為中-高反光結(jié)構(gòu)(圖4)，大量的高反光沉積物占據(jù)、替代基質(zhì)細(xì)胞(圖5)。

圖4 顆粒狀角膜營(yíng)養(yǎng)不良共焦顯微鏡圖像(×800)Figure 4 Confocal laser scanning microscopy image of granular corneal dystrophy (×800)

圖5 顆粒狀角膜營(yíng)養(yǎng)不良共焦顯微鏡圖像(×800)Figure 5 Confocal laser scanning microscopy image of Granular corneal dystrophy (×800)

3 討論

由于角膜營(yíng)養(yǎng)不良是一種遺傳性疾病，因此眾多學(xué)者很早就開始了對(duì)其分子遺傳學(xué)方面的研究。目前確定的與角膜營(yíng)養(yǎng)不良相關(guān)的染色體有1、5、9、10、12、16、17、20、21和X染色體，已經(jīng)確定的角膜營(yíng)養(yǎng)不良基因有BIGH3、CHST6、K3、K12、M1S1、GSN等[2]。

角膜營(yíng)養(yǎng)不良在我國(guó)較為常見，我們所掌握的深圳地區(qū)的一個(gè)家系中三代可查人數(shù)為18人，顆粒狀角膜營(yíng)養(yǎng)不良患者5人。對(duì)該家系的研究結(jié)果顯示：高、低分子量細(xì)胞角蛋白在本角膜營(yíng)養(yǎng)不良家系患者的角膜中有陽(yáng)性表達(dá)，正常角膜則沒有表達(dá)[3]。研究[4]顯示：顆粒狀角膜營(yíng)養(yǎng)不良角膜超微結(jié)構(gòu)，可見部分角膜上皮基底細(xì)胞和實(shí)質(zhì)細(xì)胞內(nèi)外均有高電子密度的梭形物質(zhì)，上皮的基底細(xì)胞及實(shí)質(zhì)細(xì)胞參與沉積物的形成。顆粒角膜營(yíng)養(yǎng)不良的發(fā)生與角膜上皮的改變可能有關(guān)聯(lián)，角膜上皮中高分子細(xì)胞角蛋白明顯增加并可能分泌至周邊參與沉積物的形成。復(fù)習(xí)患病角膜的共焦顯微鏡觀察圖像，顆粒狀角膜營(yíng)養(yǎng)不良鏡下的沉積物在共焦顯微鏡下可見呈團(tuán)塊狀中高反光，周圍可見大量粉末狀的反光影，逐步擴(kuò)展病變達(dá)到占據(jù)基質(zhì)層，取代基質(zhì)細(xì)胞。進(jìn)一步印證了角膜上皮細(xì)胞及實(shí)質(zhì)細(xì)胞參與了顆粒狀角膜營(yíng)養(yǎng)不良的發(fā)展。

共焦顯微鏡是臨床實(shí)時(shí)觀察角膜的高分辨率檢查設(shè)備，在健康角膜激光共焦顯微圖像上，前彈力層神經(jīng)纖維，呈連續(xù)走行的高反光條索狀結(jié)構(gòu)，走行略迂曲，邊界光滑，結(jié)構(gòu)清晰[5]。作為活體無(wú)創(chuàng)性的檢查手段，共焦顯微鏡可以觀察角膜病變的動(dòng)態(tài)發(fā)展情況，不僅能分辨上皮細(xì)胞層中的表皮細(xì)胞、翼狀細(xì)胞、基底細(xì)胞，還可顯示角膜總不同層次的神經(jīng)形態(tài)?；铙w共焦顯微鏡借助眼部特殊結(jié)構(gòu)和特性，直接觀察角膜及其他眼表結(jié)構(gòu)的細(xì)胞圖像，不需要傳統(tǒng)送檢的步驟，任意選取疾病的時(shí)間段進(jìn)行疾病的動(dòng)態(tài)跟蹤，有助于優(yōu)化眼表疾病的診斷治療，重新定義眼表疾病的特征，可在一定程度替代眼表疾病的病理診斷功能。

角膜營(yíng)養(yǎng)不良的患病角膜的沉積物從何而來，在發(fā)病機(jī)制中扮演了什么角色，發(fā)生角膜營(yíng)養(yǎng)不良的原因?yàn)楹?，上述問題目前尚未完全清楚，但是隨著科技的不斷發(fā)展，新的技術(shù)手段的問世，我們將獲得越來越多先進(jìn)的手段來進(jìn)一步研究闡明這些問題。

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