抗氧化劑在不孕不育癥治療中的應(yīng)用

王晶晶，王曉紅

不孕不育是指有生育意愿的男女雙方同居1年以上，有正常性生活且未避孕，但未能建立或維持臨床妊娠[1]。世界衛(wèi)生組織(WHO)調(diào)查顯示，目前不孕不育已成為僅次于腫瘤和心腦血管疾病之后的第三大疾病。流行病學(xué)調(diào)查顯示，世界范圍內(nèi)育齡夫婦不孕不育發(fā)病率高達(dá)8%～12%，且呈逐年遞增趨勢，給社會(huì)和家庭帶來沉重的心理和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[2-3]。研究顯示，適量濃度的活性氧(reactive oxygen species,ROS)在生殖過程中具有重要作用，可影響卵泡生長、卵母細(xì)胞成熟、精子發(fā)生、精卵結(jié)合、胚胎著床和胚胎發(fā)育等[4]。但是，過量的ROS會(huì)造成氧化應(yīng)激，引起細(xì)胞毒性并損傷DNA，進(jìn)而導(dǎo)致不孕不育的發(fā)生[5]。因此，抗氧化劑有望改善由于氧化應(yīng)激而導(dǎo)致的不孕不育，本文將詳細(xì)闡述氧化應(yīng)激如何誘發(fā)不孕不育，以及常見抗氧化劑在不孕不育癥治療中的應(yīng)用。

1 氧化應(yīng)激與不孕不育

1.1 氧化應(yīng)激對女性生育力的影響

近年來，國內(nèi)外越來越多的學(xué)者開始關(guān)注氧化應(yīng)激對女性生育力的影響。研究提示，細(xì)胞色素P450可影響ROS的產(chǎn)生，黃體本身也是ROS主要來源。卵母細(xì)胞成熟過程包括減數(shù)分裂I和II，在很大程度上受ROS濃度和抗氧化劑的影響[6]。研究顯示，在排卵過程中，隨著促黃體生成素(luteinizing hormone,LH)的激增，卵泡內(nèi)會(huì)新生大量血管，導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞產(chǎn)生大量ROS，卵泡內(nèi)適量的ROS有利于卵母細(xì)胞成熟和卵泡破裂[7]。ROS被認(rèn)為是排卵的關(guān)鍵誘導(dǎo)因子，抑制ROS已被證實(shí)會(huì)干擾排卵[8]。但是，過量的ROS則會(huì)導(dǎo)致卵巢中氧化劑和抗氧化劑的失衡，進(jìn)而誘發(fā)氧化應(yīng)激損害卵母細(xì)胞和顆粒細(xì)胞，導(dǎo)致卵母細(xì)胞質(zhì)量差。

此外，氧化應(yīng)激通過引起細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化、蛋白質(zhì)變性和DNA損傷，對卵母細(xì)胞、胚胎發(fā)育和胚胎植入都有直接影響[9]。氧化應(yīng)激也與卵巢早衰、子宮內(nèi)膜異位癥、多囊卵巢綜合征(polycystic ovary syndrome,PCOS)和不明原因的不孕有關(guān)[8,10]。

1.2 氧化應(yīng)激對男性生育力的影響

研究發(fā)現(xiàn)，適量濃度的ROS是精子獲能、超激活和頂體反應(yīng)所必需的[11]。然而，高水平ROS造成的氧化應(yīng)激不僅會(huì)導(dǎo)致精子脂質(zhì)過氧化和DNA損傷，還會(huì)導(dǎo)致精子中酶的失活和蛋白質(zhì)變性，降低精子活力，從而降低受精率和妊娠率，與男性不育存在密切關(guān)聯(lián)[12]。產(chǎn)生氧化應(yīng)激的來源很多，包括精索靜脈曲張、抽煙、飲酒、肥胖/代謝綜合征、白細(xì)胞精子癥、性傳播疾病(即淋球菌、沙眼衣原體、梅毒螺旋體)以及病毒感染(如人類免疫缺陷病毒、肝炎)等[13]。

相比體細(xì)胞，精子更易受到氧化應(yīng)激損傷。在體細(xì)胞中，抗氧化酶廣泛存在于細(xì)胞質(zhì)中，然而在精子發(fā)生的最后階段，精子細(xì)胞質(zhì)被移除，導(dǎo)致精子只能依賴于富含抗氧化劑的精漿[14]。此外，精子細(xì)胞膜富含多種不飽和脂肪酸，這使得它們更容易受到ROS誘發(fā)的脂質(zhì)過氧化，細(xì)胞膜的損傷將導(dǎo)致精子活力降低[15]。多項(xiàng)研究證明，不育男性精液中ROS水平明顯高于可育男性，抗氧化劑濃度則呈現(xiàn)較低水平[16]。

2 抗氧化劑的分類

抗氧化劑是過量ROS的“清道夫”，有助于維持機(jī)體氧化劑/抗氧化劑的動(dòng)態(tài)平衡?？寡趸瘎┲饕譃閮煞N類型：酶類抗氧化劑和非酶類抗氧化劑[17]。酶類抗氧化劑主要包括超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、過氧化氫酶(catalase,CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GPx)和谷胱甘肽還原酶(glutathione reductase,GR)；非酶類抗氧化劑主要包括谷胱甘肽(glutathione,GSH)、褪黑素、輔酶Q10(coenzyme Q10,CoQ10)、N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine,NAC)、維生素C和E、肉堿、鋅、硒、番茄紅素等[18]。

3 抗氧化劑在女性不孕癥治療中的應(yīng)用

多項(xiàng)研究證實(shí)，抗氧化劑治療可有效改善女性生育力：降低雄激素水平和胰島素抵抗、提高卵巢儲(chǔ)備功能、促進(jìn)子宮內(nèi)膜血液循環(huán)等,對于卵巢早衰、卵巢低反應(yīng)、PCOS和子宮內(nèi)膜異位癥具有一定的效果[10,19]。

3.1 酶類抗氧化劑

SOD是體內(nèi)最有效的抗氧化酶之一，也是身體抵抗ROS的第一道防線。SOD可以將超氧陰離子自由基轉(zhuǎn)化為H2O2，然后通過GPx或CAT將H2O2轉(zhuǎn)化成H2O和O2，從而防止過量氧自由基對各種細(xì)胞組分的毒害損傷[9]。

以往報(bào)道顯示，所有抗氧化酶在女性生殖過程中都起著關(guān)鍵作用。研究發(fā)現(xiàn)，在初級卵泡和次級卵泡的卵泡液中，SOD的3種亞型(SOD1、SOD2和SOD3)濃度和活性均高于成熟的竇卵泡[20-22]。這些研究提示，竇卵泡卵泡液中SOD活性相對降低，這對于確保排卵前所需要的ROS閾值水平非常重要。LH是垂體前葉分泌的促性腺激素，對于女性正常排卵和黃體發(fā)育至關(guān)重要。一項(xiàng)研究表明，LH誘導(dǎo)黃體中抗氧化酶SOD1、SOD2和CAT在mRNA和蛋白質(zhì)水平表達(dá)均上調(diào)[23]。

也有研究證實(shí)，當(dāng)體外添加卵泡刺激素培養(yǎng)山羊顆粒細(xì)胞時(shí)，CAT的活性顯著提高，同時(shí)雌二醇分泌也顯著升高。提示CAT可能在卵泡發(fā)育過程中發(fā)揮功能性作用[24]。研究顯示CAT存在于小鼠卵母細(xì)胞核中，其形成獨(dú)特的囊泡結(jié)構(gòu)以保護(hù)基因組免受減數(shù)分裂成熟過程中的氧化損傷，抑制CAT活性可增加內(nèi)源性ROS水平，導(dǎo)致卵母細(xì)胞核染色體缺陷和DNA損傷[25]。臨床研究發(fā)現(xiàn)，GPx在受精卵子卵泡液中的活性明顯高于未受精卵子卵泡液，證明GPx在精卵結(jié)合過程中發(fā)揮重要作用[26]。

綜上可知，內(nèi)源性酶類抗氧化劑能有效抵御氧化應(yīng)激對卵巢及卵泡造成的損傷，從而維持女性正常生理和生殖功能。

3.2 非酶類抗氧化劑

GSH是非酶類抗氧化劑的代表，廣泛存在于內(nèi)臟及生殖器官組織及細(xì)胞中。GSH具有游離的巰基，因此具有很強(qiáng)的供電子或質(zhì)子氫能力，可參與氧化還原過程，具有清除自由基、增強(qiáng)抗氧化物酶活性、提高機(jī)體抗氧化能力的功能[27]。在雌性卵泡發(fā)育過程中，它可以保護(hù)卵子免受氧化損傷，也有研究表明，卵細(xì)胞內(nèi)GSH水平的升高有益于胚胎發(fā)育[28]。據(jù)報(bào)道，GSH缺乏與卵巢早衰甚至與卵巢癌有關(guān)[29]。另一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，對于接受體外受精的女性，女性卵泡中GSH水平較高會(huì)明顯提高受精率[30]。另外，研究發(fā)現(xiàn)GSH參與調(diào)節(jié)引起慢性炎癥的基因，這可能與自身免疫相關(guān)，提示GSH將來有望應(yīng)用于免疫性流產(chǎn)和治療抗精子抗體而導(dǎo)致的不孕患者[27]。

褪黑素是由松果體分泌的具有較強(qiáng)抗氧化能力的神經(jīng)內(nèi)分泌激素，能夠直接清除多種氧自由基，激活抗氧化酶的生成，提高電子傳遞鏈的效率，促進(jìn)ATP合成[31]。相比傳統(tǒng)的抗氧化劑，如維生素C和E、GSH等具有更強(qiáng)的抗氧化潛力，成為近年來研究新熱點(diǎn)[32]。褪黑素既是脂溶性又是水溶性，可以輕易通過細(xì)胞膜[33]。越來越多研究證明，褪黑素可直接作用于卵巢，促進(jìn)卵泡發(fā)育、卵子成熟[34]。研究顯示，褪黑素可通過減低細(xì)胞核、線粒體和細(xì)胞膜的氧化應(yīng)激，進(jìn)而保護(hù)顆粒細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整性[35]。體外研究顯示，添加10 uM褪黑素可有效提高促排卵周期中人未成熟卵母細(xì)胞的發(fā)育潛能，最終獲得高比例優(yōu)質(zhì)囊胚[36]。最新的一項(xiàng)研究證實(shí)，褪黑素可以通過抑制氧化損傷和維持卵細(xì)胞膜通透性，提高人卵母細(xì)胞的冷凍和復(fù)蘇效果，這為女性生育力保存提供了新思路[37]。

CoQ10是一種脂溶性抗氧化劑，可參與線粒體氧化磷酸化過程中的電子傳遞運(yùn)輸，保護(hù)細(xì)胞免遭氧自由基的攻擊[38]。有研究顯示，高齡女性和老年小鼠卵母細(xì)胞中CoQ10濃度顯著下降，線粒體ATP產(chǎn)生減少，通過膳食補(bǔ)充CoQ10可以進(jìn)行逆轉(zhuǎn)[39]。一項(xiàng)隨機(jī)對照研究顯示，服用CoQ10(600 mg/d，分為3次，持續(xù)60 d)可以提高IVF/ICSI助孕過程中卵巢低反應(yīng)女性的獲卵率和受精率，并提高胚胎質(zhì)量[40]。同時(shí)，也有研究證明，將小鼠卵母細(xì)胞暴露于不孕患者卵泡液環(huán)境后，添加CoQ10可以提高小鼠卵母細(xì)胞的體外成熟[41]。

維生素C(抗壞血酸，水溶性)和維生素E(α-生育酚，脂溶性)是最常見的維生素類抗氧化劑，可以中和并減少ROS，進(jìn)而降低氧化應(yīng)激損傷[8]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，脫氫表雄酮誘導(dǎo)的PCOS大鼠模型灌胃維生素C(150 mg/kg，持續(xù)15 d)，顯示卵巢組織中氧化應(yīng)激產(chǎn)物顯著降低，抗氧化酶(SOD和CAT)活性升高[42]。研究顯示，PM2.5環(huán)境暴露可引起雌性小鼠抗苗勒管激素(anti-Müllerian hormone,AMH)水平降低和卵巢組織損傷，維生素C(45 mg/kg/d)和維生素E(100 mg/kg/d)補(bǔ)充均可以抑制由PM2.5引起的炎癥和氧化應(yīng)激[43]。子宮內(nèi)膜異位癥與慢性炎癥有關(guān)，ROS則是調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖的促炎介質(zhì)，因此子宮內(nèi)膜異位癥可能與ROS有關(guān)[44]。研究證實(shí)，NAC和維生素E聯(lián)合用藥可以治療子宮內(nèi)膜異位癥，二者可能通過抑制NF-κB活性進(jìn)而抑制子宮內(nèi)膜異位細(xì)胞增殖[45]。

近年來，國內(nèi)外專家開始關(guān)注維生素D在女性生殖中的作用。大量證據(jù)表明，維生素D對PCOS和子宮內(nèi)膜異位癥患者可能具有關(guān)鍵作用，并改善其IVF妊娠結(jié)局[46-47]。臨床治療一般使用復(fù)合維生素，隊(duì)列研究表明，復(fù)合維生素可提高女性生育能力[48-49]。最新的Cochrane系統(tǒng)評價(jià)報(bào)道了抗氧化劑對女性生育力的影響[50]，提示復(fù)合維生素可以提高臨床妊娠率和活產(chǎn)率。CoQ10可以活化維生素C和維生素E，增強(qiáng)抗氧化能力。一項(xiàng)隨機(jī)雙盲臨床試驗(yàn)結(jié)果顯示，補(bǔ)充維生素E(400 IU/d)和CoQ10(200 mg/d)，持續(xù)8周后可顯著降低胰島素抵抗和血清睪酮水平[51]。

肉堿又被稱為“準(zhǔn)維生素”。左旋肉堿(L-carnitine,LC)和乙酰肉堿(acetyl-carnitine,ALC)均可通過改善線粒體功能治療不孕癥[52-53]。雖然這兩種形式的肉堿都具有抗氧化性能，但一些報(bào)道顯示，ALC抵抗ROS誘導(dǎo)的氧化損傷方面比LC更有效[54]。ALC常用于抗氧化/抗衰老，而LC常用于促進(jìn)脂肪燃燒和能量產(chǎn)生[55]。最近的研究表明，PCOS患者口服LC(250 mg/d，持續(xù)12周)可顯著降低體重、BMI和腰臀比，并改善胰島素抵抗[56]。也有報(bào)道顯示，功能性下丘腦閉經(jīng)患者口服ALC(1 g/d，持續(xù)16周)，LH水平顯著升高，提示ALC對促性腺激素缺乏癥不孕女性具有積極治療作用[57]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，在卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)體系中添加LC，可減少細(xì)胞內(nèi)ROS水平，進(jìn)而提高卵母細(xì)胞和胚胎的發(fā)育潛能[58]。

4 抗氧化劑在男性不育癥治療中的應(yīng)用

多項(xiàng)研究證實(shí)，抗氧化劑治療可有效改善男性生育力：增加精漿抗氧化能力、提高精子數(shù)量和精子活力、降低精子畸形率等，對治療少弱畸形精子癥等具有積極效果[11,59]。

4.1 酶類抗氧化劑

研究顯示，SOD可保護(hù)精子免受脂質(zhì)過氧化和氧化應(yīng)激的侵害[60]。Kobayashi等[61]發(fā)現(xiàn)，精漿中富含多種抗氧化酶，去除精漿的精子懸浮液在體外培養(yǎng)120 min后精子活力明顯下降，氧化應(yīng)激水平升高，添加SOD(400 U/mL)可以有效降低氧化應(yīng)激并提高精子活力。在人和大鼠精漿及精子細(xì)胞中均發(fā)現(xiàn)CAT的存在，其來源是前列腺，該酶在一氧化氮誘導(dǎo)的精子獲能中起關(guān)鍵作用。精液中抗氧化系統(tǒng)的另一種酶是GPx，也是來源于前列腺。它可以催化過氧化氫和有機(jī)過氧化物(包括磷脂過氧化物)還原，以降低ROS含量[62]。在精子中，GPx主要位于線粒體基質(zhì)中，但是也發(fā)現(xiàn)了一種保護(hù)精子DNA免受氧化損傷并參與染色質(zhì)濃縮過程的核形式[63]。

4.2 非酶類抗氧化劑

研究發(fā)現(xiàn)，人類精漿中GSH減少導(dǎo)致精子中部結(jié)構(gòu)異常，最終導(dǎo)致運(yùn)動(dòng)障礙[64]。 研究發(fā)現(xiàn)，GSH補(bǔ)充可顯著改善不育男性的精子參數(shù)(如數(shù)量、活動(dòng)性和形態(tài))，GSH還對細(xì)胞膜脂質(zhì)損傷起著重要作用，其有效保護(hù)劑量為600 mg/d，持續(xù)2～3個(gè)月[65]。NAC是GSH的前體，可以改善精液體積及黏稠度，并提高精子活力[66]。NAC最常用的劑量是600 mg/d，一般與其他抗氧化劑聯(lián)合使用至少3個(gè)月[67]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也證實(shí)，NAC可以保護(hù)精子DNA免受氧化損傷，改善小鼠精子參數(shù)[68]。

最近的研究表明，褪黑素可以調(diào)節(jié)睪丸發(fā)育、減少睪丸損傷，并可用于臨床男性生育力保存[69]。精液冷凍保存是男性生育力長期保存的最佳方法，但是因?yàn)榫記]有細(xì)胞質(zhì)，冷凍過程中容易受到氧化應(yīng)激影響，破壞精子質(zhì)膜完整性并降低線粒體活性[70]。近年來褪黑素作為精子冷凍保護(hù)劑被廣泛研究，添加褪黑素可以上調(diào)幾種抗氧化酶(SOD、CAT和GPx)，從而降低ROS水平，保持精子膜的流動(dòng)性和活力[71]。有研究顯示，冷凍保護(hù)劑中添加0.1 mM褪黑素，可提高抗凋亡基因Bcl-2和熱休克蛋白90的表達(dá)，進(jìn)而增強(qiáng)抵御氧化應(yīng)激的能力[72]。也有研究發(fā)現(xiàn)，在人精子冷凍保存中，最佳的褪黑素濃度為3 mM，可以降低細(xì)胞內(nèi)ROS水平，更好地保持精子活力[73]。 Neelam等[74]將雄性小鼠暴露于微波輻射(900 MHz)35 d(每天2 h)，發(fā)現(xiàn)褪黑素(日劑量：5 mg/kg)可以顯著降低睪丸組織中丙二醛和ROS濃度，改善微波輻射對精子數(shù)量、睪酮水平和DNA碎片化的影響。

CoQ10在精子中段含量豐富，可以通過促進(jìn)線粒體電子傳遞，進(jìn)而促進(jìn)精子的成熟和改善精子質(zhì)量[75]。Takeshima等[76]研究發(fā)現(xiàn)，CoQ10可以再生其他抗氧化劑，例如維生素C和E，進(jìn)而提高其抗氧化能力。另外，CoQ10可以有效降低氧化應(yīng)激，避免精子DNA損傷，改善精索靜脈曲張患者的精子參數(shù)[77]。一項(xiàng)前瞻性研究提示，接受CoQ10治療的男性不育患者(200 mg/d，持續(xù)6個(gè)月)，精子濃度和活力顯著升高，妊娠率和活產(chǎn)率沒有明顯改變[78]。在一項(xiàng)隨機(jī)雙盲安慰劑對照試驗(yàn)中，口服CoQ10治療特發(fā)性少精子癥患者(200 mg/d，持續(xù)3個(gè)月)，發(fā)現(xiàn)精漿中CoQ10、GPx、總抗氧化劑能力顯著提高，精子濃度和活力也顯著上升[79]。

類胡蘿卜素是天然抗氧化劑，可保護(hù)細(xì)胞膜的完整性，調(diào)節(jié)上皮細(xì)胞的分化并有助于精子生成，研究證實(shí)，飲食中缺乏類胡蘿卜素會(huì)降低精子活力[62]。研究發(fā)現(xiàn)，維生素A(視黃醇)的低血清水平會(huì)降低精子質(zhì)量，推測維生素A可用于治療男性不育癥[80]。人類精漿中維生素C含量約是血清中的10倍，研究證實(shí)維生素C的濃度與正常精子百分比呈正相關(guān)，與DNA碎片率呈負(fù)相關(guān)[81]，臨床研究發(fā)現(xiàn)，口服維生素C劑量1 g/d，可以有效治療男性不育癥[82]。維生素E可保護(hù)精子細(xì)胞膜免受氧化應(yīng)激侵害，防止脂質(zhì)過氧化[62]。一項(xiàng)臨床試驗(yàn)表明，每天攝入600 mg維生素E，3個(gè)月后精子功能得到改善[83]。

2018年一篇系統(tǒng)性Meta分析[84]，總計(jì)納入19項(xiàng)回顧性研究和10項(xiàng)前瞻性隨機(jī)對照研究(RCT)，其中26項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)抗氧化治療可以改善精液常規(guī)參數(shù)和輔助生殖助孕結(jié)局。本研究發(fā)現(xiàn)，抗氧化劑單一療法或聯(lián)合療法最常用劑量如下：維生素C(500～1 000 mg)、維生素E(400 mg)、肉堿(500～1 000 mg)、NAC(600 mg)、CoQ10(100～300 mg)、鋅(25～400 mg)、硒(200 mg)、葉酸(0.5 mg)、番茄紅素(6～8 mg)。

然而，關(guān)于抗氧化劑是否可以治療男性不育依舊存在爭議。2020年美國生殖醫(yī)學(xué)年會(huì)對此進(jìn)行了熱點(diǎn)討論，反對方 Steiner教授認(rèn)為口服抗氧化劑并不能改善精液質(zhì)量，無益于男性不育者提高妊娠率[85]。支持方Chavarro教授指出2019年3月Cochrane研究，涵蓋17種抗氧化劑，發(fā)現(xiàn)抗氧化劑可提高男性不育患者子代的活產(chǎn)率[86]。同時(shí)Chavarro教授也承認(rèn)目前對于抗氧化劑的研究尚且有限，未來需要更深入的研究。

5 小結(jié)與展望

近年來，氧化應(yīng)激被認(rèn)為是導(dǎo)致不孕不育的主要原因。盡管正常生殖過程需要低水平的ROS，但ROS水平過高會(huì)導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化和DNA損傷，進(jìn)而干擾精卵功能。諸多研究表明，當(dāng)幾種抗氧化劑組合使用時(shí)，可以有效抵御氧化應(yīng)激，改善生殖功能。然而，關(guān)于這些抗氧化劑的劑量和使用時(shí)間尚無明確共識，需要大規(guī)模、多中心的前瞻性隊(duì)列研究。此外，健康生活方式也是平衡體內(nèi)ROS和抗氧化劑水平并防止氧化應(yīng)激的關(guān)鍵。減少吸煙、飲酒和輻射暴露，選擇適當(dāng)?shù)娘嬍澈腕w育鍛煉，對于降低氧化應(yīng)激并避免不孕不育癥發(fā)生具有重要意義。