苜蓿青貯中乳酸降解菌的分離、鑒定及降解性能研究

崔欣雨 李榮榮 蔡瑞 王妍 鄭猛虎 徐春城

（中國農(nóng)業(yè)大學工學院，北京 100083）

苜蓿（Medicago sativa L.）是多年生豆科牧草，含有豐富的維生素和礦物質(zhì)等營養(yǎng)成分，是當今世界上分布最廣、栽培面積最大的牧草［1］。為實現(xiàn)長期保藏和全年均衡供應，常將苜蓿制作成干草，然而在我國苜蓿種植地帶收割時伴隨有雨熱同期現(xiàn)象，苜蓿干草的制作過程中存在落葉與雨淋損失，實踐生產(chǎn)發(fā)現(xiàn)高水分青貯是解決上述問題的理想措施。青貯依靠乳酸菌等有益菌迅速將青綠飼草中的可溶性碳水化合物轉(zhuǎn)化為有機酸，使青貯飼料pH值下降，從而有效地抑制了有害微生物對營養(yǎng)成分的分解，其中乳酸是最主要的有機酸［2-3］。乳酸（C3H6O3）含羥基，酸度（pK=3.1）遠高于揮發(fā)性脂肪酸（volatile fatty acid，VFA）酸度（pK=4.8），能夠產(chǎn)生酸香氣味，適量的乳酸可以刺激家畜食欲并顯著提高適口性，且能通過破壞細菌的細胞壁增加細胞膜通透性導致內(nèi)容物流出，從而達到殺菌效果［4-6］。因此，乳酸對改善飼草青貯的風味和維持青貯過程中微生物群落結(jié)構(gòu)的平衡具有重要作用。

乳酸不易揮發(fā)，應隨著青貯過程不斷積累，然而在一些飼草青貯研究中出現(xiàn)了乳酸含量下降的現(xiàn)象［7-9］。Muck等［10］提出，隨著干物質(zhì)的損失，其他微生物的活動會造成已生成乳酸的降解與轉(zhuǎn)化。Lindgren等［11］也發(fā)現(xiàn)，當可溶性碳水化合物含量較低或不足時，部分微生物會將乳酸代謝成其他有機產(chǎn)物。這類能夠利用乳酸作為碳源或者電子受體的微生物稱為乳酸降解菌，又叫乳酸利用菌，其體內(nèi)具有NAD-非依賴型乳酸脫氫酶（NAD-independent lactate dehydrogenases，iLDH）和乳酸氧化酶（lactate oxidase，LOX）等能代謝乳酸的酶［12］。乳酸氧化生成丙酮酸時所產(chǎn)生的電子通過電子傳遞鏈進行氧化磷酸化能夠產(chǎn)生為微生物供給能量的ATP，這一途徑同時存在于部分原核微生物和真核微生物中。

有研究表明當青貯原料中混入土壤、施用有機肥料或酸化緩慢時，表面附著的腸桿菌屬、梭菌屬、芽胞桿菌屬和酵母中的一些乳酸降解菌就能發(fā)揮作用，其不僅能分解乳酸影響發(fā)酵品質(zhì)，有些還能在開封后代謝乳酸散發(fā)出大量熱量導致青貯料溫度上升，造成飼料變質(zhì)從而對動物健康產(chǎn)生不利影響［13-14］。盡管人們已對青貯中乳酸降解的危害有一定認識，但是針對青貯中乳酸降解菌的研究較少。通過探究青貯中乳酸降解菌的降解性能和環(huán)境因子的耐受性，能夠更加全面地認識青貯這一復雜的過程，從而提升苜蓿青貯的品質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 苜蓿 來源于北京市農(nóng)林科學院國家精準農(nóng)業(yè)示范基地（北京市昌平區(qū)），品種分別為Khan、Meizoo和Central，于2020年9月22日刈割第三茬初花期苜蓿，留茬高度5 cm。

1.1.2 培養(yǎng)基 培養(yǎng)基的配制和乳酸降解菌的分離、純化方法參考栗連會［15］。

乳酸鈉分離培養(yǎng)基（g/L）：乳酸鈉20.0，酵母膏5.0，硫酸銨5.0，磷酸二氫鉀0.3，磷酸氫二鉀1.0，七水合硫酸鎂0.3，瓊脂粉20.0，pH值 6.8±0.2；

乳酸鈉發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：乳酸鈉20.0，酵母膏5.0，蛋白胨5.0，硫酸銨5.0，磷酸二氫鉀0.3，磷酸氫二鉀1.0，氯化鈉0.5，七水合硫酸鎂0.5，pH值 6.8±0.2。

生理生化培養(yǎng)基：西蒙氏枸櫞鹽培養(yǎng)基、乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基、蛋白胨水、葡萄糖發(fā)酵管和蔗糖發(fā)酵管均購置于青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 青貯調(diào)制 將刈割后的苜蓿迅速帶回實驗室用鍘刀切短至1-2 cm，充分混勻后裝入青貯專用聚乙烯袋，每袋約300 g，用真空包裝機抽真空、封口后于室溫條件下避光貯藏。

1.2.2 測定指標及方法 分別于3、7、14、21、28和56 d開封，充分混勻并準確稱取10 g樣品放入滅菌后的聚乙烯袋中，加入90 mL蒸餾水充分混合，均質(zhì)器處理60 s后先用4層紗布過濾，再用定性濾紙過濾得到浸提液，每個處理重復3次。用pH計測定浸提液pH值；采用高效液相色譜法測定乳酸（lactic acid，LA）、乙 酸（acetic acid，AA）、丙 酸（propanoic acid，PA）和丁酸（butyric acid，BA）濃度［16］。

1.2.3 乳酸降解菌的分離和保存 稱取開封后的苜蓿青貯樣品10 g置于90 mL無菌生理鹽水中，充分震蕩后制作成10-1、10-2、10-3、10-4和10-5系列梯度的稀釋液，吸取10-1、10-3和10-5稀釋液至乳酸分離培養(yǎng)基上，用滅菌的涂布棒輕輕涂開，倒置于厭氧培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)72 h，每組重復3次。用接種環(huán)挑選單菌落，在乳酸分離培養(yǎng)基上劃線并置于37℃厭氧培養(yǎng)48 h，重復至出現(xiàn)單菌落。將純化后的單菌落接種到乳酸鈉發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，將能使培養(yǎng)基變渾濁的菌株進行甘油保藏，按照分離的時間和順序進行編號。

1.2.4 乳酸降解率的測定 采用磷酸緩沖溶液調(diào)整乳酸鈉發(fā)酵培養(yǎng)基pH值至6.2，將挑選出的乳酸降解菌株按照105CFU/mL的接種量接種到培養(yǎng)基中，在30℃下厭氧培養(yǎng)120 h，采用對羥基聯(lián)苯比色法［17］測定發(fā)酵液發(fā)酵前后乳酸含量，并計算乳酸降解率：

1.2.5 乳酸降解菌株的鑒定 進行菌落形態(tài)的觀察，并采用增強革蘭氏染色液（上海源葉生物科技有限公司）進行革蘭氏染色觀察，再利用生理生化鑒定管（青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司）進行糖發(fā)酵試驗和IMViC試驗（包括吲哚實驗、甲基紅試驗、乙酰甲基甲醇試驗和檸檬酸鹽利用試驗），參照《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》對菌株進行生理生化特征分析。采用細菌基因組DNA提取試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）提取細菌DNA并作為模板，引物為正向引物：27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）及反向引物：1492R（5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'），PCR反應體系和PCR反應過程參考白文華［18］的方法，PCR產(chǎn)物長度約為1 400 bp。將擴增成功的PCR 產(chǎn)物送北京博邁德生物技術(shù)有限公司進行測序，獲得的待測菌株序列利用BLAST（Basic Local Alignment Search Tool）工具與GenBank中的標準菌株進行對比，并用Mega 7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

1.2.6 乳酸降解菌的降解性能 菌液密度（OD600）采用比濁法測定；采用2，4-二硝基苯肼比色法測定NAD-非依賴型乳酸脫氫酶和乳酸氧化酶的活性［19-20］。采用島津氣相色譜儀檢測酸類代謝產(chǎn)物（條件：色譜柱30 m×0.25 mm×0.25 μm的RTX-WAX，檢測器為FID）［21］。

1.2.7 生長耐受性實驗 采用單因素試驗研究溫度（20、25、30和35℃）、pH值（4.5、5.0、5.5、6.0、6.5和7.0）、乳酸鈉濃度（10、20、30 和40 g/L）和葡萄糖濃度（10、20和30 g/L）對菌株降解乳酸能力的影響，接種量為106CFU/mL，厭氧培養(yǎng)120 h后計算乳酸降解率。

1.2.8 數(shù)據(jù)處理 采用SPSS 23.0軟件、Microsoft Excel 2016軟件對數(shù)據(jù)進行處理和分析，P＜0.05代表數(shù)據(jù)存在顯著性差異；采用Origin 2021b軟件作圖。

2 結(jié)果

2.1 苜蓿青貯過程中發(fā)酵品質(zhì)的變化

3個品種苜蓿的青貯pH值隨著貯藏時間的延長顯著下降（P＜0.05），且前3 d下降速度最快并均降至6.1左右。Khan和Meizoo的青貯pH值分別在3-7 d和7-14 d出現(xiàn)回升，而Central的青貯pH值在青貯過程中持續(xù)下降（圖1）。

圖1 苜蓿青貯過程pH值的動態(tài)變化Fig.1 Dynamic changes of pH during alfalfa silage

乳酸、乙酸、丙酸均在青貯的前7 d快速積累，乙酸的含量最高，丙酸含量低于乙酸和乳酸，丁酸含量在前28 d均在檢出線以下。青貯7 d后3個品種的乳酸含量隨著時間延長無顯著變化（P＞0.05），Khan的乳酸含量在14 d達到最高值后不斷下降，Meizoo和Central的乳酸含量在7 d后先減少后增加。3個品種的乙酸含量沒有顯著差異（P＞0.05）且均呈現(xiàn)緩慢增加的狀態(tài)，其中Khan的乙酸含量最高，在發(fā)酵結(jié)束后達到23.05 g/kg DM（表1）。

表1 苜蓿青貯過程中有機酸含量的動態(tài)變化Table 1 Dynamic changes of organic acids content during alfalfa silage

2.2 乳酸降解菌株的篩選及鑒定

2.2.1 乳酸降解菌的篩選 青貯過程中共分離得到75株乳酸降解菌，根據(jù)分離時間將其編號為RSF1-RSF31（0 d-7 d）、RSM1-RSM20（14 d-21 d）、RSH1-RSH24（28 d-56 d）。依據(jù)純化菌落的顏色、形態(tài)、革蘭氏染色試驗、糖發(fā)酵試驗及IMViC試驗將75株菌進行分組（表2）。

表2 乳酸降解菌的分組情況Table 2 Grouping of lactic acid degrading bacteria

從A-U組中各選出一株代表菌株，依次測定乳酸降解率，降解率最高的RSM9達到44.64%，最低的RSF24只有10.22%。其中RSM9、RSF15、RSH16和RSF2的降解率分別為44.64%、33.86%、33.35%和30.64%，均超過30%（圖2）。

圖2 各組代表性菌株的乳酸降解率Fig.2 Degradation rate of lactic acid by representative strains in each group

2.2.2 乳酸降解菌的形態(tài)特征 4株菌的菌落顏色、形態(tài)等存在差異，但均能在LB培養(yǎng)基中生長繁殖，且均為革蘭氏陰性菌（圖3）。其中RSM9在分離培養(yǎng)基中呈白色不透明的圓形菌落，表面凸起，邊緣整齊，具有一定的黏性；RSF15菌落為扁平的黃色同心圓菌落，邊緣整齊且沒有黏性；RSF2菌落為白色不透明圓形，菌落凸起，邊緣整齊，具有黏性；RSH16為較小的白色圓形菌落，表面凸起且濕潤，邊緣整齊，具有一定的黏性。

圖3 菌株菌落形態(tài)及革蘭氏染色結(jié)果Fig.3 Colony morphology and Gram staining of each strain

2.2.3 乳酸降解菌的系統(tǒng)發(fā)育樹 RSM9、RSF15、RSF2和RSH16的片段長度 分 別為1 409、1 375、1 410和1 403 bp，將 其 序 列 與Genbank中 的 模式菌株相關(guān)序列進行比對，選擇與其序列相似度＞99%的菌種進行親緣關(guān)系的比較并制作系統(tǒng)發(fā)育 樹（圖4）。其 中 菌 株RSM9、RSF15、RSF2和RSH16分 別 與Hafnia paralvei、Proteus columbae、Obesumbacterium proteus和Citrobacter cronae構(gòu) 成同一進化分支，bootstrap值均大于90%。結(jié)合生理生化試驗確定RSM9為哈夫尼菌（Hafnia sp.），RSF15屬于變形菌（Proteus sp.），RSF2屬于肥桿菌（Obesumbacterium sp.），RSH16為 檸 檬 酸 桿 菌（Citrobacter sp.）。四者的GenBank登錄號依次為MW 793477、MW 793478、MW 793479和MW 793480。

圖4 4株乳酸降解菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree of 4 lactic acid degrading strains

2.3 乳酸降解菌代謝特征

厭氧培養(yǎng)120 h后RSM9菌株的OD600達到0.989，生長情況最好。接種4種菌的發(fā)酵液的pH值均增加，其中RSM9組的pH值最大為6.76。RSM9、RSF15和RSF2菌株能夠分泌NAD-非依賴型乳酸脫氫酶和乳酸氧化酶，而RSH16菌株沒有測定到乳酸氧化酶活性。4株菌的酸類代謝產(chǎn)物主要是乙酸和丙酸，只有RSM9能代謝產(chǎn)生丁酸，根據(jù)測定結(jié)果計算4株菌的酸類代謝產(chǎn)物大約占降解物總量的15%-40%（表3）。

表3 4株乳酸降解菌的代謝特征Table 3 Metabolic characteristics of 4 strains of lactic acid degrading bacteria

2.4 環(huán)境因子對乳酸降解菌降解乳酸的影響

2.4.1 培養(yǎng)溫度 4株菌溫度適應性強，其中RSM9在各溫度段乳酸降解率均較高，在35℃環(huán)境下降解率達到41.81%、RSF15、RSF2和RSH16在20℃降解率最高，分別為21.90%、23.67%和21.21%，當溫度大于25℃時，溫度的增加會提高乳酸降解率。（圖5-A）。

2.4.2 pH值 在弱酸性環(huán)境下4株菌的乳酸降解能力要好于中性環(huán)境，當pH值降至5.0以下時不利于乳酸降解菌的代謝。其中菌株RSM9在pH≥6.0時表現(xiàn)出良好的乳酸降解能力，乳酸降解率高于其他3株菌，RSF15和RSF2在pH值為5.5時乳酸降解率最大分別為25.51%和21.15%，pH值在5.5-7.0時RSH16的乳酸降解率受pH值變化影響較?。▓D5-B）。

圖5 環(huán)境因子對菌株乳酸降解率的影響Fig.5 Effects of environmental factors on the degradation rate of lactic acid

2.4.3 乳酸鈉濃度 總體上乳酸降解率隨著乳酸濃度的增加而降低，當乳酸鈉濃度為10 g/L時4株菌的乳酸降解率最高，RSM9最高達到65.76%，其他3株菌的乳酸降解率均在30%以上。4株乳酸降解菌均能夠耐受40 g/L的乳酸，在其中表現(xiàn)最好的是RSM9，RSF2的降解率最低僅為13.66%（圖5-C）。2.4.4 葡萄糖濃度 在培養(yǎng)基中添加葡萄糖后的結(jié)果如圖5-D所示。當添加10 g/L葡萄糖時4株菌的乳酸降解率最高分別為22.95%、23.75%、20.81%和28.29%。隨著葡萄糖濃度的增加乳酸降解率降低，當葡萄糖濃度增加到30 g/L以上時，乳酸降解菌幾乎不再降解乳酸。

3 討論

本研究采用3個品種的苜蓿進行青貯試驗，苜蓿較高的緩沖能和較低的含糖量導致三者經(jīng)過56 d發(fā)酵后pH值均未達到理想水平［22-23］。在青貯的前7 d，由于新鮮苜蓿原料在切碎密封后仍有少量氧氣存在，且初始pH較高，對微生物的抑制效果差，從而附著在原料上的乳酸菌與其他微生物競爭糖類底物進行生長代謝，使得原料所含有的可溶性碳水化合物被迅速消耗并轉(zhuǎn)化成有機酸，造成青貯前期乳酸、乙酸和丙酸的快速積累。然而隨著貯藏時間進一步的延長出現(xiàn)乳酸緩慢減少的現(xiàn)象，Khan和Meizoo品種的青貯pH值甚至回升，這與Tao等［24］單獨青貯苜蓿的結(jié)果相一致。

青貯過程中有機酸含量處于動態(tài)變化中，其中乳酸、乙酸、丙酸和丁酸是青貯中重要的有機酸。乳酸是一種不易揮發(fā)的有機酸，不會隨著開封逸出，因此其減少的主要原因是乳酸的生成量低于降解量。乳酸在7-14 d達到最大值的同時可溶性碳水化合物含量處于較低水平，此時乳酸降解菌開始利用乳酸進行代謝從而造成乳酸的消耗。本研究的結(jié)果表明4株菌的酸類代謝產(chǎn)物主要是乙酸，其次是丙酸和己酸。乳酸的羧基電離后產(chǎn)生的負離子可以與α位的羥基形成分子內(nèi)氫鍵，從而使負離子穩(wěn)定性更高，相比于乙酸等揮發(fā)性有機酸具有更強的酸性，故而乳酸降解后pH值會回升。除了酸類代謝產(chǎn)物外，有研究顯示乳酸降解菌代謝產(chǎn)物還包括醛類、醇類和酯類等有機物［15］。

目前在酒醅、反芻動物的瘤胃液以及豬的腸道中均分離出部分乳酸降解菌，已報道能夠降解乳酸的有丙酸桿菌屬、脫硫弧菌屬、固氮菌屬、梭菌屬、韋榮氏球菌屬、巨球型菌屬、芽胞桿菌屬和真桿菌屬等多個屬的一些種，其中部分菌株能夠很好地利用乳酸生長和繁殖［25-27］。與以往分離得到的菌屬不同，本研究分離得到的菌株均屬于兼性厭氧型腸桿菌科細菌，常見于土壤和動物腸道，其在青貯過程中降解乳酸的能力未被廣泛報道。試驗表明4株菌都具有NAD-非依賴型乳酸脫氫酶活力，可在厭氧環(huán)境下將乳酸氧化為丙酮酸，并進一步分解用于氧化磷酸化供給細胞能量［28］。而乳酸氧化酶是一種黃素蛋白酶，以黃素核苷酸作為輔因子，無需外加輔因子，但需要氧氣參與才能完成乳酸代謝，當青貯料開封后此類微生物若大量繁殖或會引起有氧變質(zhì)［29-30］。

夏光亮等［31］研究表明，生長環(huán)境的pH值、培養(yǎng)基底物類型、乳酸的濃度和構(gòu)型等都對乳酸的降解有顯著的影響。試驗結(jié)果表明當葡萄糖濃度較高時乳酸降解率較低，這是由于微生物會優(yōu)先消耗容易利用的速效碳源，微生物代謝糖類的過程會抑制乳酸向丙酮酸轉(zhuǎn)化時乳酸脫氫酶的活性［32-33］。當乳酸鈉濃度為10 g/L、pH值高于5.0時乳酸降解率較高，這與乳酸降解發(fā)生在苜蓿青貯的7-14 d時間點相吻合。4株菌的溫度適應性強（20-35℃），乳酸降解能力受溫度影響小，35℃下的降解能力要好于25℃和30℃，且RSM9在35℃時的乳酸降解率最高能達到41.81%。李榮榮等［34］研究發(fā)現(xiàn)，當貯藏溫度為35℃時，隨著發(fā)酵進行苜蓿青貯中乳酸含量顯著降低，可能與這一溫度下乳酸降解菌的代謝有關(guān)。

4 結(jié)論

從苜蓿青貯中分離獲得4株能代謝乳酸的革蘭氏陰性細菌RSM9、RSF15、RSF2和RSH16，經(jīng)鑒定分別為哈夫尼菌（Hafnia sp.）、變形菌（Proteus sp.）、肥 桿 菌（Obesumbacterium sp.）和 檸 檬 酸 桿菌（Citrobacter sp.）。4株菌在乳酸鈉發(fā)酵培養(yǎng)基中經(jīng)30℃厭氧培養(yǎng)120 h后的乳酸降解率分別達到44.64%、33.86%、30.64%和33.35%，酸類代謝產(chǎn)物主要是乙酸和丙酸。這類微生物能夠在可溶性碳水化合物含量顯著減少、乳酸積累的苜蓿青貯的第7-14天發(fā)揮作用，通過代謝乳酸進行生長繁殖，造成青貯體系的pH回升。4株菌均為兼性厭氧型細菌，溫度適應性強，但不耐酸，當pH＜5.0時生長活性被抑制。