CRISPR-Cas系統(tǒng)在核酸檢測中的應(yīng)用研究

胡秀文 劉華 王宇 唐雪明，5 王金斌 曾海娟 蔣瑋 李紅

（1. 上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 201306；2. 上海農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，上海 201106；3. 蘭州理工大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，蘭州730050；4. 上海市農(nóng)業(yè)遺傳育種重點實驗室，上海 201106；5. 上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院，200240；6. 上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，上海 201106）

核酸檢測技術(shù)在診斷感染、遺傳疾病和癌癥方面具有至關(guān)重要的作用，因此核酸檢測技術(shù)得到了快速發(fā)展［1］。其中幾種主要以PCR為基礎(chǔ)的核酸檢測技術(shù)已被用于病原體檢測［2］，但需要昂貴的試劑和設(shè)備，以及熟練的人員。恒溫擴(kuò)增方法也被應(yīng)用到核酸檢測方面［3］，由于設(shè)備和應(yīng)用技術(shù)的制約等因素，阻礙了核酸檢測的現(xiàn)場速測應(yīng)用［4］。因此開發(fā)靈敏、快速和特定的傳感工具對于診斷檢測至關(guān)重要。而目前發(fā)現(xiàn)的CRISPR-Cas（clustered regularly interspaced short palindromic repeats）系統(tǒng)基于其準(zhǔn)確識別和切割特定DNA和RNA序列的能力，已被用于基因組編輯［5-6］，展示了其強(qiáng)大的分子檢測潛在能力，成為了開發(fā)新的檢測平臺的熱點。

CRISPR系統(tǒng)是細(xì)菌及古細(xì)菌利用Cas效應(yīng)蛋白在crRNA引導(dǎo)下抵御外源核酸入侵的一種獲得性免疫防御系統(tǒng)。研究人員在大腸桿菌基因組中發(fā)現(xiàn)具有重復(fù)DNA序列的的遺傳結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)是由CRISPR基因座，DNA靶向間隔序列以及編碼crRNA（crispr RNA）組分和Cas蛋白操縱子的組分構(gòu)成，稱之為CRISPR-Cas系統(tǒng)［7］。它能將入侵的噬菌體、質(zhì)粒和轉(zhuǎn)座子的移動遺傳元件（MGES）作為自己的間隔區(qū)序列，構(gòu)成了細(xì)菌和古細(xì)菌適應(yīng)性和遺傳免疫的基礎(chǔ)［8］。在自然條件下的CRISPR-Cas系統(tǒng)中，包括Cas12［9］、Cas13［10］和Cas14［11］及其同源物，會表現(xiàn)出間接的非特異性催化活性，可用于核酸檢測，例如通過降解標(biāo)記的核酸產(chǎn)生熒光信號［12］。檢測靈敏度高，達(dá)到10-18mol/L［13］的aM級別。這些系統(tǒng)借助體外擴(kuò)增技術(shù)以及橫向流動測試條系統(tǒng)，實現(xiàn)低價、高靈敏度、現(xiàn)場可檢測的診斷方法，在人類健康到農(nóng)業(yè)都有著廣泛的應(yīng)用，為更加方便、快捷的檢測各種疾病提供了技術(shù)支撐。本文主要介紹了CRISPR-Cas的相關(guān)機(jī)制，以及在核酸檢測的應(yīng)用狀況，旨為開發(fā)新型檢測平臺提供理論依據(jù)。

1 CRISPR-Cas系統(tǒng)的多樣性與分類

CRISPR系統(tǒng)是基因編輯技術(shù)中編輯核苷酸的有效工具，與編碼Cas蛋白的相關(guān)基因組合形成CRISPR-Cas系統(tǒng)。根據(jù)所結(jié)合的Cas蛋白不同，其發(fā)揮的功能不同，主要可以將CRISPR-Cas系統(tǒng)分為兩類［14］，其中第一類是多種Cas蛋白復(fù)合體，主要分為I型、III型和IV型。第二類為單一蛋白效應(yīng)模塊，主要包括II、V、VI。II型［15］系統(tǒng)的主要特征蛋白Cas9作為核酸酶行使切割能力修飾靶序列，現(xiàn)已廣泛用于許多領(lǐng)域，包括基礎(chǔ)研究方向、食品作物開發(fā)、藥物開發(fā)和人類基因組工程等。V型［16］CRISPR-Cas系統(tǒng)的主要特征蛋白包括Cas12和Cas14。Cas12能夠誘導(dǎo)雙鏈DNA（dsDNA）切割位點的細(xì)胞發(fā)生遺傳變化，而且可以用于哺乳動物的基因編輯。Cas14是從古細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)的新的核酸酶，它僅存在古細(xì)菌中，與Cas9、Cas12具有相似的結(jié)構(gòu)域，但功能有所差異［17］。VI型CRISPR-Cas系統(tǒng)使用Cas13核酸酶，該酶具有特征性的較高的真核和原核核苷酸（HEPN）結(jié)合結(jié)構(gòu)域［18］，特異性的作用于RNA靶序列，發(fā)揮特異性識別和非特異切割的功能。除此之外，CRISPR系統(tǒng)都可以利用靶向切割與體外擴(kuò)增相結(jié)合，從而用于快速檢測DNA和RNA，達(dá)到快速檢測的目的［19］，具有良好的應(yīng)用前景。

2 CRISPR-Cas核酸檢測工具

2.1 CRISPR-Cas9技術(shù)概述

CRISPR-Cas9屬 于CRISPR II型 系 統(tǒng)，含 有HNH和RuvC結(jié)構(gòu)域，是由Cas9蛋白、tracrRNA與crRNA一起組合對目的基因進(jìn)行編輯。Cas9能夠識別質(zhì)粒和噬菌體的原型間隔序列毗鄰基序（PAM）［20］NGG序 列，然 后crRNA-tracrRNA復(fù) 合體與cDNA配對，從而導(dǎo)致Cas9對目標(biāo)DNA進(jìn)行雙鏈切割。其中crRNA-tracrRNA復(fù)合物可以合成向?qū)NA（sgRNA）來直接引導(dǎo)該系統(tǒng)識別目標(biāo)序列。CRISPR-Cas9可以與光學(xué)DNA定位結(jié)合起來以鑒定細(xì)菌抗生素抗性基因［21］；另外，將CRISPR-Cas9與DNA熒光原位雜交（FISH）結(jié)合以檢測耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌（MRSA）［22］。

Cas9核酸酶的兩個結(jié)構(gòu)域發(fā)生突變后會沒有活性即為dCas9（dead Cas9），可用于調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄，可以結(jié)合DNA而不將其裂解，基于此特點開發(fā)了一種dCas9的體外DNA檢測系統(tǒng)。該系統(tǒng)以高特異性和高靈敏度檢測結(jié)核分枝桿菌DNA［23］。目前的研究顯示，使用Cas9來切割DNA也存在一些問題。如在切割過程中目標(biāo)序列識別不準(zhǔn)確容易導(dǎo)致突變，而且雙鏈斷裂引起的大片段堿基缺失，并因此導(dǎo)致臨床應(yīng)用的嚴(yán)重后果等。另外，該系統(tǒng)需要crRNAtracrRNA復(fù)合物來識別靶核酸，比其他類別識別復(fù)雜一些。

2.2 CRISPR-Cas12技術(shù)概述

CRISPR相 關(guān) 蛋 白Cas12a，是 第 二 類V型CRISPR系統(tǒng)RNA引導(dǎo)的一種核酸內(nèi)切酶、具有附帶的裂解活性，也含有RuvC結(jié)構(gòu)域，并在crRNA引導(dǎo)下切割PAM（TTTN）序列下游18-25 nt的靶DNA。Casl2a在crRNA的介導(dǎo)下靶向結(jié)合dsDNA，形成了三元復(fù)合物，激活了非特異性ssDNA反式裂解活性［24］?；贑as12a 這一特殊性質(zhì)，將Casl2a反式切割活性與等溫擴(kuò)增相結(jié)合的方法，開發(fā)了一種新DNA檢測方法—DETECTR（DNA endonuclease targeted CRISPR trans reporter）［25-26］。該 系 統(tǒng) 結(jié) 合重組聚合酶擴(kuò)增（RPA）技術(shù)與熒光報告系統(tǒng)，對靶DNA進(jìn)行恒溫擴(kuò)增，然后Cas12a在crRNA引導(dǎo)下作用于擴(kuò)增的靶DNA，裂解淬滅的ssDNA報告基因，產(chǎn)生熒光信號?，F(xiàn)已將該系統(tǒng)應(yīng)用到轉(zhuǎn)基因檢測中［27］，實現(xiàn)了對轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品及其制品快速靈敏的檢測，其DNA檢測的靈敏度能達(dá)到aM級；在醫(yī)療診斷檢測上可以對人乳頭瘤病毒（HPV）患者的樣本檢測分析［28］。趙國屏團(tuán)隊利用Cas12a以及熒光報告系統(tǒng)，成功開發(fā)了高靈敏核酸檢測方法HOLMES［25］（an one-hour low-cost multipurpose highly efficient system），用于目標(biāo)DNA和RNA的快速檢測，該方法實現(xiàn)檢測SNP位點，以及對DNA病毒（偽狂犬病病毒）以及RNA（乙型腦炎）病毒檢測，暗示著Cas12a在核酸檢測領(lǐng)域的應(yīng)用前景。但是，該方法也存在一些缺點，如反應(yīng)溫度高、SNP檢測序列受限、靈敏度可能降低等。為了檢測更加方便，基于Cas12a切割機(jī)制，開發(fā)了一種新型的一體式工具箱，具有精確和超靈敏性（OCTOPUS）平臺［29］，成功應(yīng)用于食源性病原體檢測，為食品安全提供了保障。通過研制的CRISPR-Cas12a生物傳感器實現(xiàn)對烏拉西-DNA糖酶（UDG）和T4多核苷酸激酶（T4 PNK）的超敏感檢測［30］，而且可作為確定包括單細(xì)胞解氧和人體血漿在內(nèi)的真實樣品的強(qiáng)大工具箱［31］，證明良好的實際應(yīng)用能力。

隨著對Cas不斷深入的探究，Cas12的另一個常用核酸蛋白Cas12b被發(fā)掘出來，它含有單個的RuvC結(jié)構(gòu)域，脫靶效率低，能在哺乳動物和人類中進(jìn)行有效的基因的編輯［32］。同時也顯示出相同的DNA 反式切割活性，根據(jù)此特性，創(chuàng)建了HOLMES的改進(jìn)版本（稱為HOLMESv2）［33］。在HOLMESv2系統(tǒng)中，Cas12b可以和各種恒溫擴(kuò)增相結(jié)合，并將擴(kuò)增與Cas12b檢測兩個獨立的步驟整合到一個系統(tǒng)中特異性區(qū)分單核苷酸多態(tài)性（SNP），避免了交叉污染，用最少的設(shè)備提供超靈敏和特異的DNA檢測的潛力。為了更加快速準(zhǔn)確的檢測，將Cas12a 與Cas12b效應(yīng)器與LAMP整合在一起，以開發(fā)一種超靈敏的特異性側(cè)向流生物傳感器（LFB），用于檢測銅綠假單胞菌（P. aeruginosa）［34］。但是目前該系統(tǒng)無法直接檢測RNA分子，需要對RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，增加了檢測的復(fù)雜程度，會影響檢測結(jié)果。

2.3 CRISPR-Cas13技術(shù)概述

Cas13［35］是VI型CRISPR系統(tǒng)相關(guān)的蛋白，是RNA引導(dǎo)和RNA靶向的核糖核酸酶（RNase）蛋白家族［36］，Cas13含有2個發(fā)散的HEPN結(jié)構(gòu)域［37］，可以在具有Protospacer側(cè)翼位點（PFS）的靶標(biāo)RNA的單鏈區(qū)域中產(chǎn)生多個切割位點。且Cas13［38］還表現(xiàn)出靶標(biāo)依賴性的混合RNase活性，導(dǎo)致非靶標(biāo)RNA分子的反式切割。Cas13可以實現(xiàn)RNA編輯，如RNA堿基編輯技術(shù)（REPAIR）［39］。另外該系統(tǒng)在核酸檢測和疾病診斷中也顯示出獨特而廣泛的用途，是開發(fā)快速檢測工具的研究熱點之一。

目前研究人員對于Cas13a核酸蛋白研究較多，基于其附屬切割的特點建立了SHERLOCK［40］（特定的高靈敏度酶報告解鎖）平臺，并將恒溫擴(kuò)增與Cas13a相結(jié)合來檢測RNA分子。SHERLOCK程序在運行的過程中主要分為4個階段，分別為試劑制備、樣品提取、核酸恒溫預(yù)擴(kuò)增和CRISPR-Cas13核酸檢測［41］。該系統(tǒng)依賴于RNA熒光報告探針對信號的級別放大，再借助T7轉(zhuǎn)錄結(jié)合重組聚合酶擴(kuò)增［42］實現(xiàn)了對信號的二次放大，提高了該方法的靈敏度，對病毒核酸實現(xiàn)了單分子靈敏度和單堿基特異性檢測。為此通過結(jié)合CRISPR-Cas13a系統(tǒng)和催化組件（CHA），建立了非編碼小RNA分子（miRNA）的超敏電化學(xué)生物致敏平臺［43］。

通過Cas13a與熒光報告基團(tuán)或橫向流動試紙條結(jié)合，形成了Cas13a系統(tǒng)，并成功在現(xiàn)場檢測到犬細(xì)小病毒2型（CPV-2）［44］；能夠檢測血漿EB病毒（epstein-barr virus）DNA，進(jìn)而有助于篩查和監(jiān)測鼻咽癌及其他EBV相關(guān)疾?。?5］。Gootenberg等［46］將SHERLOCK方法修改，開發(fā)了SHERLOCKv2平臺，該平臺結(jié)合Cas13a與輔助CRISPR-III型相關(guān)核酸酶Csm6［47］使信號靈敏度提高了3.5倍。在多功能、快速、便攜和經(jīng)濟(jì)高效的核酸檢測上，具有全分子敏感性和單堿基檢測特異性，為基礎(chǔ)設(shè)施欠發(fā)達(dá)地區(qū)的流行病監(jiān)測和病原體檢測提供了技術(shù)支持。為了避免污染，引入未提取的診斷樣品加熱以消除核酸酶（HUDSON）［41］方案，可以直接從臨床樣品中檢測病毒核酸，達(dá)到以極高的靈敏度檢測全血、血清和唾液中的病毒。根據(jù)CRISPR-Cas13系統(tǒng)的反式切割活性而建立的檢測平臺成功應(yīng)用多個領(lǐng)域，但在哺乳動物細(xì)胞中對宿主轉(zhuǎn)錄組的非靶點影響很小，這可能導(dǎo)致非預(yù)期突變。另外，分子量較小的分子也給CRISPR-Cas13多重檢測帶來了挑戰(zhàn)。因為Sherlock的RNA報告程序容易被環(huán)境中存在的RNA酶降解，而ssDNA報告程序則不易激活，因此由于取消了體外轉(zhuǎn)錄過程，DETECTR更便于DNA檢測。

2.4 CRISPR-Cas14技術(shù)概述

Cas14屬 于V型CRISPR-Cas系統(tǒng) 由RNA引導(dǎo)的核酸酶家族，大小只有400到700個氨基酸，迄今為止被證明是最小的第二類CRISPR效應(yīng)器。它是一種靶向ssDNA的CRISPR內(nèi)切酶，與CRISPRCas12a不同，它不需要PAM就可以激活，識別之后進(jìn)行靶向切割時表現(xiàn)出與Cas12a不同的保真度機(jī)制［17］，即靶向識別后所釋放的非特異性催化活性，這種機(jī)制類似于ssRNA靶向Cas13a酶的機(jī)制，例如通過降解標(biāo)記的核酸以產(chǎn)生熒光信號，因此可以根據(jù)Cas12與Cas13的作用機(jī)制來理解Cas14的切割特性。各種CRISPR檢測系統(tǒng)比較如表1。

表1 CRISPR檢測系統(tǒng)比較Table 1 Comparison of CRISPR detection system

基于Cas14的這種非特異性DNase活性，開發(fā)了ssDNA檢測平臺DETECTR-Cas14［48］。但在診斷用途上，與Cas12a相關(guān)的檢測平臺DETECTR［25］相比，其在區(qū)分ssDNA底物方面表現(xiàn)出較高的保真度，可用于DNA單核苷酸多態(tài)性基因分型、ssDNA病原體的檢測與診斷。CRISPR-Cas14系統(tǒng)還可以與HUDSON［42］方法結(jié)合使用，不涉及復(fù)雜的樣本提取和運輸，達(dá)到快速檢測病毒的目的，并已成功應(yīng)用于細(xì)小病毒檢測人類博卡病毒（HBoV1）［11］。這項新的診斷技術(shù)的精準(zhǔn)性在檢測人類E3泛素蛋白連接酶（HERC2）基因方面已經(jīng)得到證明。CRISPRCas14是高通量病原突變篩查的一種有效且經(jīng)濟(jì)高效的方法，而目前在檢測之前，需要額外的步驟從dsDNA靶標(biāo)生成ssDNA。Cas14的這一特殊性質(zhì)可能會增加其應(yīng)用的復(fù)雜性；因此，到目前為止，它在診斷應(yīng)用中的優(yōu)勢還沒有清楚地展示出來。

2.5 CRISPR核酸擴(kuò)增檢測技術(shù)

許多已發(fā)表的CRISPR檢測方法需要進(jìn)行核酸擴(kuò)增，但標(biāo)準(zhǔn)的擴(kuò)增方法PCR需要熱循環(huán)儀，不方便攜帶且反應(yīng)時間較長，并不適用。目前研究較多的是與等溫擴(kuò)增放大的多種技術(shù)，最常用的等溫放大方法是RPA和LAMP，它們的工作溫度分別在37-42℃、65℃，利用CRISPR與RPA結(jié)合建立了DETECTR、SHERLOCK等一系列檢測平臺。并結(jié)合動態(tài)水相反應(yīng)（DAMR）系統(tǒng)和蔗糖濃度的密度差異建立兩相一體式反應(yīng)進(jìn)行核酸檢測［49］。HOLMESv2系統(tǒng)與LAMP擴(kuò)增結(jié)合，在恒溫條件下，Cas12b檢測結(jié)合LAMP擴(kuò)增并經(jīng)過亞硫酸氫鹽處理可以準(zhǔn)確定量目標(biāo)DNA甲基化程度［33］。滾環(huán)擴(kuò)增（RCA）是一種高度特異的等溫基因擴(kuò)增方法，可以在室溫下進(jìn)行，輔助CRISPR-Cas9檢測多個胞外囊泡小RNA［50］。核酸序列擴(kuò)增（NASBA）是一種用來擴(kuò)增RNA的方法，需要一個初始加熱步驟（65℃），然后在41℃下進(jìn)行等溫擴(kuò)增，與CRISPR-Cas9結(jié)合與可準(zhǔn)確區(qū)分密切相關(guān)的寨卡病毒株［51］。

2.6 CRISPR比色讀出檢測系統(tǒng)

在CRISPR檢測中，色度傳感器的使用很受歡迎，因為它可以直接將結(jié)果可視化。其中包含側(cè)向流動分析（LFA），CRISPR-Cas9結(jié)合側(cè)向流動核酸測定［52］（CASLFA）用于鑒定單核細(xì)胞增生李斯特菌、轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品和非洲豬瘟病毒（ASFV）。有研究人員采用了一種基于膠體金納米顆粒（AuNP）［53］的比色分析方法，以及鉑納米顆粒（PtNPs），再加入Cas12a和Cas13a效應(yīng)蛋白來檢測目標(biāo)序列，通過他們的體積條形圖芯片，可以識別和檢測血清中的多種癌癥基因突變。

2.7 CRISPR識別輸出檢測系統(tǒng)

研究人員通過將CRISPR切割與電子信號輸出系統(tǒng)結(jié)合，能夠準(zhǔn)確的觀察到結(jié)果的變化，而且不需要目標(biāo)放大就可以在非常低的濃度下進(jìn)行測量。CRISPR-dCas9借助基于石墨烯的場效應(yīng)晶體管（GFET）和納米孔傳感器［54］，通過識別目標(biāo)序列來影響電子信號的輸出，利用Cas12a的反式切割檢測報告DNA片段，有效解決了低濃度目標(biāo)DNA的檢測時間問題。電化學(xué)傳感系統(tǒng)［55］利用Cas12a的反式切割活性獲得高傳導(dǎo)信號，而不需要進(jìn)行DNA擴(kuò)增，通過電流差異表明目標(biāo)DNA的存在。

3 CRISPR系統(tǒng)在新冠病毒檢測的應(yīng)用

新型冠狀病毒SARS-CoV-2引起新冠肺炎，并已導(dǎo)致國際公共衛(wèi)生緊急情況，截止到2021年3月已傳播到200多個國家，全球已感染1億2 040萬人，死亡近200多萬人。研究表明，感染SARS-CoV-2的個體在無癥狀或有癥狀前可能具有高度感染性，并且感染者平均可感染5.6個體［56］，這種情況亟需快速、靈敏的SARS-CoV-2診斷分析方法。檢測病毒的存在性對于降低病毒的基本繁殖率和最佳臨床時間窗口都是至關(guān)重要的。目前采用RT-qPCR診斷COVID-19是主要的手段，但此方法需要專業(yè)的技術(shù)人員，且試劑和設(shè)備的獲取不足減緩了疾病檢測的速度。為了進(jìn)一步提高新冠肺炎的診斷水平，基于CRISPR系統(tǒng)的檢測新冠肺炎的方法，因其準(zhǔn)確、快速的診斷檢測而成為熱點。而目前報道出的在新冠病毒方面應(yīng)用的主要是基于Cas12與Cas13的檢測技術(shù)，故基于CRISPR的平臺目前是準(zhǔn)確檢測和治療SARS-CoV-2的一種合理的新方法。

3.1 基于CRISPR-Cas12a的診斷工具

研究者們在CRISPR系統(tǒng)的基礎(chǔ)上設(shè)計了各種新的診斷方法，其中利用CRISPR-Cas12a［57］系統(tǒng)DETECR的檢測平臺，通過將CRISPR-Cas12a與RT-PCR結(jié)合將從鼻拭子中提取的病毒RNA中進(jìn)行擴(kuò)增，后將擴(kuò)增產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至CRISPR-Cas12a的系統(tǒng)中進(jìn)行熒光檢測，利用簡易的設(shè)備即可進(jìn)行遠(yuǎn)程檢測，并在短時間內(nèi)觀察到結(jié)果。其結(jié)果也可通過側(cè)向流動檢測方法進(jìn)行觀察［58］，用于檢測呼吸道提取物中的SARS-CoV-2。為了更能方便操作者，研究人員開發(fā)了一種快速、靈敏的肉眼可視的檢測方法（CRISPR-Cas12a-NER）［59］，具有肉眼讀數(shù)，無需特殊儀器即可在45 min 內(nèi)檢測到，從而提供了一種簡單可靠的現(xiàn)場診斷方法。目前還將等溫擴(kuò)增與CRISPR-Cas12技術(shù)相結(jié)合，開發(fā)了一種快速檢測臨床標(biāo)本中SARS-CoV-2的方法［60］。該方法使用環(huán)介導(dǎo)擴(kuò)增（RT-LAMP）對從鼻咽或口咽拭子中提取的RNA執(zhí)行同時的逆轉(zhuǎn)錄和等溫擴(kuò)增，隨后對冠狀病毒序列進(jìn)行Cas12檢測，利用其附屬切割確認(rèn)了病毒的存在，極大的縮短了檢測時間，提供了快速而又準(zhǔn)確的檢測方法。

3.2 基于CRISPR-Cas13a的診斷工具

隨著新冠疫情的發(fā)展，張峰團(tuán)隊提出了基于CRISPR的SHERLOCK技 術(shù) 來 檢 測SARS-CoV-2的新方法［61］。該方法分為3個步驟，從核酸提取開始，在1 h內(nèi)即可完成，用于定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)檢測。首先使用重組酶聚合酶擴(kuò)增（RPA）試劑盒對提取的核酸樣本進(jìn)行等溫擴(kuò)增；再使用Cas13檢測預(yù)擴(kuò)增的病毒RNA序列；最后借助儀器可以使用肉眼讀出檢測結(jié)果檢測［62］。Arizti-Sanz團(tuán)隊開發(fā)的SHINE方法［63］，則將SHERLOCK可以與HUDSON搭配使用，這是一種靈敏而特異的集成診斷工具，可以從未提取的樣本中檢測SARS-CoV-2 RNA。它通過使用加熱和化學(xué)還原來破壞降解RNA的核酸酶和裂解病毒顆粒，消除提取核酸的步驟，用于免提取、快速和靈敏地檢測SARS-CoV-2 RNA。這是一種簡單的方法，可以用最少的設(shè)備從未提取的患者樣本中檢測病毒RNA，降低了樣本污染的風(fēng)險。此方法顯示出了其在新冠肺炎大流行期間大量的診斷需求，這些研究進(jìn)展可以極大地提高診斷檢測的能力，為抗擊傳染病提供必要的工具。

4 小結(jié)

CRISPR-Cas系統(tǒng)具有高效性、特異性等特征，因此被科學(xué)家們廣泛推崇，隨著對這些系統(tǒng)的組成和功能的不斷開發(fā)，CRISPR核酸檢測應(yīng)用將繼續(xù)擴(kuò)大。本文中列舉了CRISPR-Cas系統(tǒng)用于識別和檢測不同目的的特定核酸，包括基因組DNA、非基因組DNA、RNA和病原微生物的檢測。開發(fā)出的新型檢測平臺DETECTR與SHERLOCK也具有良好的臨床檢驗傾向，使得檢測變得快捷、靈敏。并且可以集成到基于比色或熒光的便攜式設(shè)備中，從而可以在現(xiàn)場實施。當(dāng)特定的報告核酸被不同的熒光分子標(biāo)記時，它們也可以被多重化。然而，多種酶的使用、反應(yīng)時間和步驟使方法變得復(fù)雜，此外，基于熒光的技術(shù)會產(chǎn)生熒光本底，因此需要嚴(yán)格的優(yōu)化。該系統(tǒng)目前在病毒檢測快速應(yīng)用上也表現(xiàn)出了的巨大潛力，會對疫情的防控提供有力的技術(shù)支撐。總之，對系統(tǒng)的優(yōu)化和進(jìn)一步認(rèn)識，有望給核酸檢測、基礎(chǔ)研究、傳染病和單堿基突變的遺傳病、腫瘤的診斷和治療等帶來革命性影響。之后研究重點可以主要放在高通量檢測和多重序列方向上進(jìn)行檢測。