辛伐他汀對慢性阻塞性肺疾病大鼠的抗炎作用及其機(jī)制研究

劉 青, 孫伯堅(jiān), 任冬飛, 李 林, 楊智暉, 梁瑞凱

(1. 河北省第八人民醫(yī)院 呼吸內(nèi)科, 河北 石家莊, 050021;2. 河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院 風(fēng)濕免疫科, 河北 石家莊, 050000)

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是一種慢性氣道疾病，不完全可逆的氣流受限是其主要特征，可以導(dǎo)致患者慢性活動(dòng)能力降低，甚至發(fā)展為永久性的不可逆損害，病死率高[1-2]。目前，研究[3-5]一致認(rèn)為，氣道慢性非特異性炎癥是導(dǎo)致COPD發(fā)生發(fā)展的病理基礎(chǔ)，炎性細(xì)胞及其細(xì)胞因子在發(fā)病期間起到了關(guān)鍵作用，這些因子包括基質(zhì)金屬蛋白酶家族成員、白細(xì)胞介素(IL)家族成員與腫瘤壞死細(xì)胞因子(TNF)家族成員等?！堵宰枞苑渭膊∪蚍乐蝿?chuàng)議》[6]在研究疾病治療的方向中明確指出，控制COPD患者癥狀，抑制病情進(jìn)一步發(fā)展是治療的關(guān)鍵，但至今對于COPD仍無特效防治藥物。他汀類藥物主要用于治療心血管疾病，調(diào)脂、預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化是目前臨床對該藥療效的普遍認(rèn)識(shí)，但近幾年流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，他汀類藥物能夠縮短急性加重期COPD患者的住院時(shí)間，并降低病死率，可能的機(jī)制包括影響炎癥介質(zhì)和細(xì)胞黏附因子的釋放、抗氧化作用、加速凋亡細(xì)胞清除等[7-9]。但目前關(guān)于他汀類藥物治療COPD價(jià)值的研究較少，具體作用機(jī)制尚不可知。本研究觀察辛伐他汀用于COPD大鼠治療的價(jià)值，探討藥物對疾病可能的抗炎機(jī)制，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

選擇雄性SD大鼠50只，均購自河北醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物管理中心，大鼠均為清潔級(jí)，周齡為6～8周，平均(7.0±1.0)周; 體質(zhì)量0.18～0.22 kg, 平均(0.20±0.02)kg。

1.2 主要藥品、試劑

辛伐他汀購自北大醫(yī)藥股份有限公司(國藥準(zhǔn)字H20093359), 劑量20 mg/片; 10%水合氯醛購自青島宇龍海藻有限公司; 脂多糖(LPS)由美國Sigma公司提供; 香煙由滁州煙卷廠生產(chǎn)，尼古丁1.2 mg, 焦油量19 mg; 炎性因子試劑盒由深圳達(dá)科為生物技術(shù)有限公司提供。

1.3 主要儀器設(shè)備

RSE3020型動(dòng)物肺功能儀器、AniRes2005軟件分析系統(tǒng)由北京貝蘭博科技有限公司提供, JW-3021HR型高速臺(tái)式離心機(jī)由安徽嘉文儀器裝備提供，顯微鏡由日本OLYMPUS公司提供。

1.4 建模和分組方法

① 分組: 50只雄性SD大鼠進(jìn)行適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后，隨機(jī)選擇10只大鼠作為空白對照組，將剩下的40只大鼠建立COPD模型，建模成功后隨機(jī)分為模型組、辛伐他汀組，其中辛伐他汀組根據(jù)劑量的不同，又分為低劑量組、中劑量組、高劑量組，每組10只。② COPD大鼠模型建立[10]: 正確建立COPD大鼠模型。空白對照組給予1 mL/(100 g·d)的生理鹽水灌胃，其他40只COPD模型大鼠同樣給予等劑量生理鹽水灌胃8周，灌胃第5周開始行COPD造模。辛伐他汀各組大鼠給予辛伐他汀(低劑量組: 5 mg/kg, 中劑量組: 10 mg/kg, 高劑量組: 15 mg/kg)灌胃, 1次/d, 灌胃時(shí)間仍為8周。全部大鼠除煙熏時(shí)間外，其他時(shí)間均在相同環(huán)境下飼養(yǎng)。建模成功后觀察4周, 4周后處死大鼠。本研究中全部大鼠的處理均符合《醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)課中實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理學(xué)要求的實(shí)施與思考》[11]中相關(guān)意見和規(guī)定。

1.5 觀察指標(biāo)

肺功能檢測: 造模4周后，麻醉全部大鼠并將其固定，切開頸部皮膚，分離組織或暴露氣管，將三通管氣管插管插入，局部縫合固定，將氣管插管一端連接動(dòng)物呼吸機(jī)，檢測最大肺活量(FVC)、第0.1秒用力呼氣容積(FEV0.1)、最大呼氣流速(PEF)。

檢測支氣管肺泡灌洗液中炎性因子水平。① 支氣管肺泡灌洗液采集方法: 將肺功能檢測結(jié)束但依然處于麻醉狀態(tài)的大鼠胸腔打開，使用血管鉗將左支氣管結(jié)扎。經(jīng)氣管插管將3 mL生理鹽水注入右肺, 20 s后回抽收集支氣管肺泡灌洗液，反復(fù)進(jìn)行3次，最終獲取支氣管肺泡灌洗液6 mL。將采集得到的支氣管肺泡灌洗液經(jīng)1 500 轉(zhuǎn)/min離心15 min, 取上清液保存待檢。② 檢測方法: 白細(xì)胞介素-8(IL-8)、白細(xì)胞介素-17(IL-17)、白細(xì)胞介素-32(IL-32)、腫瘤壞死細(xì)胞因子-α(TNF-α)等炎性因子水平均采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測，嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行操作。

逆轉(zhuǎn)錄: 采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測維甲酸相關(guān)孤兒受體(ROR-γt)mRNA表達(dá)量，使用TRIzol實(shí)際提取RNA, 逆轉(zhuǎn)錄互補(bǔ)脫氧核糖核酸，做聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增。確定目的基因引物序列。使用20 g/L瓊脂糖凝膠電泳比較ROR-γt與對照組相對吸光度值，行半定量分析，計(jì)算相對表達(dá)量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 5組大鼠肺功能檢查結(jié)果比較

與空白對照組比較, COPD模型大鼠肺功能指標(biāo)水平均下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05); 高劑量組大鼠肺功能下降程度低于模型組、低劑量組、中劑量組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05); 低劑量組與中劑量組各肺功能指標(biāo)水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 5組大鼠肺功能檢查結(jié)果比較

2.2 5組大鼠支氣管肺泡灌洗液中性因子水平比較

與空白對照組比較, COPD模型大鼠支氣管肺泡灌洗液中IL-8、IL-17、IL-32、TNF-α含量增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05); 高劑量組大鼠各支氣管肺泡灌洗液中炎性因子含量低于模型組、低劑量組、中劑量組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05); 低劑量組與中劑量組支氣管肺泡灌洗液中炎性因子水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 5組大鼠支氣管肺泡灌洗液炎性因子水平比較 ng/L

2.3 5組大鼠ROR-γt mRNA表達(dá)量比較

與空白對照組比較, COPD模型大鼠ROR-γt mRNA相對表達(dá)量增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05); 高劑量組大鼠ROR-γt mRNA相對表達(dá)量低于模型組、低劑量組、中劑量組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05); 低劑量組與中劑量組ROR-γt mRNA相對表達(dá)量比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表3 5組大鼠ROR-γt mRNA表達(dá)量比較

3 討 論

COPD是一種以肺實(shí)質(zhì)、氣流受限、全身炎癥為主要特征的慢性疾病，被認(rèn)為是炎癥反應(yīng)的失調(diào)狀態(tài)，以氣道炎癥、肺部炎癥及系統(tǒng)性多器官損害為主要表現(xiàn)[12]。COPD患者無論是氣道炎癥還是全身炎癥反應(yīng)，其發(fā)生機(jī)制均較復(fù)雜，炎癥反應(yīng)過程都有大量細(xì)胞因子、趨化因子及其他介質(zhì)參與[13], 可見疾病治療期間抑炎、抗炎具有重要意義。

臨床多認(rèn)為，吸煙是COPD的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，長時(shí)間、大量吸煙會(huì)導(dǎo)致肺泡巨噬細(xì)胞、支氣管上皮細(xì)胞及其他主要炎癥細(xì)胞活化，釋放出大量細(xì)胞因子及趨化因子，包括IL-6、IL-8、IL-17、IL-32、TNF-α等，這些主要的炎癥因子在COPD炎癥反應(yīng)發(fā)生、發(fā)展期間具有重要作用[14-15]。研究[16]發(fā)現(xiàn)，穩(wěn)定期COPD患者痰液內(nèi)IL-18、TNF-α等炎癥因子水平升高，隨著疾病進(jìn)展至急性加重期，患者上述各炎癥因子水平顯著升高，且高于穩(wěn)定期。IL-8、IL-17、IL-32、TNF-α均是重要的促炎細(xì)胞因子，其中IL-8通過肺泡巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、上皮細(xì)胞等釋放，是主要的中性粒細(xì)胞趨化因子，在COPD患者肺內(nèi)呈高表達(dá)，可以對中性粒細(xì)胞誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)產(chǎn)生激活作用[17]。IL-17主要來源于CD4+T淋巴細(xì)胞因子的Th17細(xì)胞，經(jīng)特異性轉(zhuǎn)錄因子ROR-γt編碼產(chǎn)生效應(yīng)因子，該因子的生物活性廣泛，不僅能夠招募巨噬細(xì)胞與中性粒細(xì)胞，還能促基質(zhì)金屬蛋白-9產(chǎn)生。此外, IL-17還對支氣管上皮細(xì)胞中氣道黏液黏蛋白的產(chǎn)生有影響，參與慢性炎癥反應(yīng)的進(jìn)程[18-19]。IL-32主要通過T細(xì)胞、上皮細(xì)胞等合成分泌，是一種編碼炎癥性細(xì)胞因子，可經(jīng)激活各主要磷酸化途徑來誘導(dǎo)其他細(xì)胞因子及趨化因子的產(chǎn)生，參加炎癥反應(yīng)的發(fā)生過程。此外, IL-32還能誘導(dǎo)單核細(xì)胞轉(zhuǎn)化為巨噬細(xì)胞，增強(qiáng)多形核粒細(xì)胞的殺傷力與吞噬功能，參與COPD特異性免疫應(yīng)答與炎癥反應(yīng)，進(jìn)一步推動(dòng)COPD病情的進(jìn)展[20]。TNF-α是早期炎癥引發(fā)因子，能夠激活內(nèi)皮細(xì)胞，直接刺激黏附因子的相對表達(dá)，誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞遷移，并釋放IL-8, 白細(xì)胞趨化作用極強(qiáng)。同時(shí), TNF-α還能促進(jìn)中性粒細(xì)胞功能的增強(qiáng)，促中性粒細(xì)胞脫顆粒，合成并分泌出更多的TNF-α, 進(jìn)一步加重炎癥程度，加快COPD病情進(jìn)展[21]。本研究結(jié)果顯示, COPD模型大鼠肺功能較空白對照組降低，各炎癥因子水平較空白對照組升高，且ROR-γt mRNA相對表達(dá)量也升高，與王戈[22]研究結(jié)果一致，說明炎癥反應(yīng)貫穿了COPD疾病發(fā)生、發(fā)展的過程。因此早期給予COPD患者合理的抗炎藥物治療，幫助患者減輕全身炎癥反應(yīng)，可能對增強(qiáng)療效有一定價(jià)值。

他汀類藥物作為一類3-羥-3-甲基-戊二酰輔酶還原酶抑制劑，被廣泛用于心血管疾病并發(fā)癥的預(yù)防及膽固醇降低的治療。研究[23]發(fā)現(xiàn)，他汀類藥物不僅具有理想的調(diào)脂作用，還具有強(qiáng)大的“外周效應(yīng)”，如抗炎癥介質(zhì)、抗炎癥細(xì)胞因子、抗氧化、抑制黏附分子表達(dá)、免疫調(diào)節(jié)等。他汀類藥物具有的這些“外周效能”可能是降低COPD患者病死率與住院率的基礎(chǔ)，但藥物治療COPD有效性與安全性及相關(guān)機(jī)制的研究國內(nèi)并不多見。為進(jìn)一步觀察他汀類藥物治療COPD是否能獲得理想效果，本研究成功建立了COPD大鼠模型，結(jié)果顯示，辛伐他汀治療的大鼠肺功能優(yōu)于模型組，各主要促炎因子水平和ROR-γt mRNA相對表達(dá)量低于模型組，高劑量辛伐他汀的應(yīng)用帶來的改善效果最為理想，而低劑量與中劑量比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05), 提示辛伐他汀用于COPD的治療可能有一定抗炎效果。辛伐他汀除有降脂作用外，還具有潛在的多效性，包括抗炎、改善血管內(nèi)皮功能等作用，使用藥物后可通過抑制甲羥戊酸途徑中止Rho的活化，從而抑制并減少類異戊二烯化產(chǎn)物的合成，最終減少諸多前炎癥細(xì)胞因子的合成與釋放，如IL-6、IL-8、TNF-α等[24]。王燕等[25]研究發(fā)現(xiàn)，辛伐他汀能夠減輕COPD大鼠肺部炎癥介質(zhì)的釋放，減輕氣道炎癥與肺氣腫程度，阻止大鼠氣道內(nèi)阻力進(jìn)一步增加，與本研究辛伐他汀的抗炎效果一致，進(jìn)一步說明辛伐他汀在COPD中的應(yīng)用價(jià)值。既往相關(guān)研究[26-27]發(fā)現(xiàn)，阿托伐他汀對炎癥的調(diào)節(jié)作用主要通過Toll樣受體、炎性體、小G蛋白、mircoRNA小分子非編碼單鏈RNA、過氧化體增殖物激活型受體等途徑實(shí)現(xiàn)，其中Toll樣受體已被證實(shí)在阿托伐他汀調(diào)控炎癥反應(yīng)過程中扮演重要角色，這類受體主要經(jīng)髓樣分化因子88信號(hào)通路激活核因子κB, 從而啟動(dòng)炎性因子的釋放，而阿托伐他汀在使用后可以抑制Toll樣受體的表達(dá)，抑制這些相關(guān)受體的敏感性，并通過抑制外周血單個(gè)核細(xì)胞Toll樣受體的表達(dá)減少炎性因子的分泌，促進(jìn)相關(guān)蛋白表達(dá)的下調(diào)，從而發(fā)揮抗炎作用。但值得注意的是，目前關(guān)于阿托伐他汀的抗炎機(jī)制仍處于研究階段，且相關(guān)研究較少，尚無較多循證學(xué)依據(jù)作為支持，故本研究所得的結(jié)果真實(shí)、可靠，均需要在未來開展前瞻性、大樣本的研究加以驗(yàn)證。

綜上所述，辛伐他汀能夠通過抑制COPD大鼠肺組織ROR-γt的表達(dá)，從而抑制大鼠肺部炎癥進(jìn)一步發(fā)展，降低各炎癥因子的表達(dá)，促進(jìn)肺功能改善。