從調(diào)控血管內(nèi)皮生長因子及其受體激活Notch信號通路角度探討生地梓醇促血管新生及神經(jīng)功能重塑作用

孫立平，周霞，劉炬，張佳樂，王祥煜，郭炳杉，劉偉

腦卒中具有高發(fā)病率、高死亡率和高致殘率等特點，其已成為我國成年人致死、致殘的首位病因［1］。在針對錯失溶栓治療時間窗的腦梗死患者的藥物治療中，神經(jīng)保護劑仍未取得高質(zhì)量研究證據(jù)與強推薦，因而具有活血化瘀功效的中藥及其組分在腦卒中的早期干預(yù)中具有重要臨床意義［2］。地黃是治療中風經(jīng)典方劑中的常用藥物之一，如地黃飲子、血府逐瘀湯等，生地梓醇作為小分子環(huán)烯醚萜葡萄糖苷類化合物，是其主要功效組分之一。有研究者認為，生地梓醇通過上調(diào)血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）表達水平而發(fā)揮促血管新生作用，但VEGF能增加血管通透性，進而加重組織水腫［3］。而只有新生血管成熟為穩(wěn)定的微血管網(wǎng)時，其血管穩(wěn)定性才增加，組織水腫才不加重，而Notch信號通路可通過參與內(nèi)皮細胞的增殖以及細胞相互作用而維持血管穩(wěn)定［4］。本研究擬從調(diào)控VEGF及血管內(nèi)皮生長因子受體（vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR）激活Notch信號通路角度，探討生地梓醇促血管新生及神經(jīng)功能重塑的作用機制，實證《神農(nóng)本草經(jīng)》關(guān)于生地“干地黃，主折跌絕筋，傷中，逐血痹，填骨髓，長肌肉……除痹，生者尤良”的功效記載［5-6］，以期為臨床轉(zhuǎn)化提供更多證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選取SPF級雄性SD大鼠31只，平均體質(zhì)量（220±20）g，購自濟南朋悅實驗動物繁育有限公司。動物合格證號：SCXK（魯）2019-0003。動物適應(yīng)環(huán)境：溫度21～25 ℃，日溫差±1 ℃，濕度50%～70%，普通飼料喂養(yǎng)。

1.2 實驗藥物 生地梓醇購自上海源葉生物科技有限公司（純度≥98%，相對分子量為362.33），以終濃度為1 mg/ml的生地梓醇溶液作為神經(jīng)保護的最佳濃度［7］。

1.3 實驗儀器與試劑 高速低溫組織研磨儀（KZ-Ⅲ-F）購自Servicebio公司，臺式高速冷凍型離心機（0004219-11）購自德國Hettichi公司，熒光定量PCR儀（CFX connect）購自上海土森視覺科技有限公司，超純RNA提取試劑盒（CW0581M）、TRIzon Reagent（CW0580S）購自康為世紀，三氯甲烷（10006818）、異丙醇（80109218）、無水乙醇（10009218）購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司，SYBR Green Pro Taq HS預(yù)混型qPCR試劑盒（AG11701）、Evo M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑預(yù)混液（AG11706）購自艾科瑞生物。

1.4 實驗時間 本實驗時間為2019年7月至2021年1月。

1.5 實驗方法

1.5.1 分組及干預(yù)方法 將24只大鼠隨機分為生地梓醇組、生理鹽水組、假手術(shù)組，各8只。生地梓醇組、生理鹽水組大鼠參照Longa改良線栓法［8］進行腦卒中造模，具體如下：腹腔注射10%水合氯醛（0.40 ml/100 g）麻醉大鼠，而后于頸部正中切口，分離出右側(cè)頸總動脈（common carotid artery，CCA）、頸外動脈（external carotid artery，ECA）和頸內(nèi)動脈（internal carotid artery，ICA）；結(jié)扎ECA遠心端和CCA，再使用動脈夾夾閉ICA；距離CCA分叉3 mm處剪一個“V型”切口，將尼龍線栓（直徑為0.33 mm）從小口小心插入，深度18～20 mm，以阻斷血流，然后常規(guī)縫合頸部創(chuàng)口，預(yù)留線栓于皮膚外，整個手術(shù)過程中注意保暖。假手術(shù)組接受與造模相同的頸動脈分離，但不插入尼龍線栓。大鼠清醒后2 h采用Longa 5分法進行神經(jīng)功能評分，0分為無神經(jīng)損傷癥狀，1分為不能完全伸展對側(cè)前爪，2分為向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈，3分為向?qū)?cè)傾倒，4分為不能自發(fā)行走、意識喪失；評分1～3分視為造模成功［8］。剔除神經(jīng)功能評分為0、4分或在手術(shù)過程中死亡的大鼠，然后重新選取大鼠進行造模，補充到相應(yīng)組別中，保證每組動物數(shù)量始終為8只。腦卒中大鼠造模成功后24 h，生地梓醇組大鼠腹腔注射生地梓醇溶液（9 mg/kg），生理鹽水組和假手術(shù)組大鼠均腹腔注射等量的0.9%氯化鈉溶液，1次/d，連續(xù)7 d。

1.5.2 評估神經(jīng)功能評分 分別于造模后1、5、8 d評估各組大鼠神經(jīng)功能評分，采用Longa 5分法進行神經(jīng)功能評分［8］，評分越高表示大鼠神經(jīng)功能損傷越嚴重。

1.5.3 評估平衡木實驗評分 分別于造模后1、5、8 d對各組大鼠進行平衡木實驗。實驗方法：將一長1.0 m、寬1.5 cm的方形平衡木一端搭在黑色方盒內(nèi)，另一端懸空。將大鼠放在平衡木的懸空端，木條下放上軟墊以保護大鼠，防止跌傷。記錄大鼠進入黑色方盒內(nèi)所花時間，根據(jù)時間長短進行0～5分的評分，評分標準按Longa 5分法［8］及Bederson 5分制法［9］。若超過60 s未能到達黑色方盒，則記錄為60 s。評分越高，說明大鼠行為障礙越嚴重。

1.5.4 觀察病灶區(qū)腦組織形態(tài) 于造模后第8天完成神經(jīng)功能評分及平衡木實驗后，各組分別取3只大鼠腹腔注射10%水合氯醛進行麻醉，處死大鼠并取腦組織進行TTC染色，觀察病灶區(qū)腦組織形態(tài)。

1.5.5 檢測腦組織VEGF、VEGFR、Notch1、Notch4 mRNA相對表達量 于造模后第8天完成神經(jīng)功能評分及平衡木實驗后，各組分別取剩余的5只大鼠腹腔注射10%水合氯醛進行麻醉，處死大鼠并取腦組織，提取總RNA。取2.5 μl反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進行聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR），以GAPDH為內(nèi)參基因。按照試劑盒說明書建立體積為25.0 μl的PCR反應(yīng)體系，其中2×實時熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qPCR）Mix 12.5 μl、7.5 μmol/L 基 因引物2.0 μl、反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2.5 μl、雙蒸水8.0 μl。PCR步驟：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性15 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸20 s，共44個循環(huán)。VEGF正向引物為5'-CGACAGAAGGGGAGCAGAAA-3'，反向引物為5'-GCTGGCTTTGGTGAGGTTTG-3'；VEGFR正 向 引物為5'-AGATCCCCGACTCCCTTTGA-3'，反向引物為5'- CACCAACTCTGAAAACGCGG-3'；Notch1正 向 引物為5'-TTGGTCCGAGGGCATCTCTA-3'，反向引物為5'-ACAGAGCTTGGGAACGGAAG-3'；Notch4正 向 引物為5'-GTCCCCTTAAACTCGGGTGG-3'，反向引物為5'-TCCTCTTGGAGCTGCCCTAT-3'；GAPDH正向引物為5'-TGATGACATCAAGAAGGTGGTGAAG-3'，反向引物為5'-TCCTTGGAGGCCATGTGGGCCAT-3'。采用2-ΔΔCt法 計 算 VEGF、VEGFR、Notch1、Notch4 mRNA相對表達量。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 使用SPSS 21.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。服從正態(tài)分布的計量資料以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗；重復(fù)測量資料比較采用雙因素重復(fù)測量方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組大鼠不同時間神經(jīng)功能評分比較 干預(yù)方法與時間在神經(jīng)功能評分上存在交互作用（P＜0.05）；干預(yù)方法、時間在神經(jīng)功能評分上主效應(yīng)顯著（P＜0.05）。生理鹽水組、生地梓醇組大鼠造模后1、5、8 d神經(jīng)功能評分高于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；生地梓醇組大鼠造模后5、8 d神經(jīng)功能評分低于生理鹽水組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。生理鹽水組、生地梓醇組大鼠造模后5、8 d神經(jīng)功能評分分別低于本組造模后1 d，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；生理鹽水組、生地梓醇組大鼠造模后8 d神經(jīng)功能評分分別低于本組造模后5 d，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

表1 三組大鼠不同時間神經(jīng)功能評分比較（±s，分，n=8）Table 1 Comparison of neural function scores in the three groups at different time

表1 三組大鼠不同時間神經(jīng)功能評分比較（±s，分，n=8）Table 1 Comparison of neural function scores in the three groups at different time

注：a表示與假手術(shù)組比較，P＜0.05；b表示與生理鹽水組比較，P＜0.05；c表示與本組造模后1 d比較，P＜0.05；d表示與本組造模后5 d比較，P＜0.05

images/BZ_71_189_969_1192_1028.png假手術(shù)組 0.45±0.07 0.57±0.11 0.52±0.03生理鹽水組 4.36±0.11a 3.22±0.04ac 2.08±0.06acd生地梓醇組 4.23±0.04a 2.55±0.55abc 1.38±0.02abcd F值 F交互=1 982.53，F(xiàn)組間=17 562.96，F(xiàn)時間=6 833.08 P值 P交互＜ 0.001，P組間＜ 0.001，P時間＜0.001

2.2 三組大鼠不同時間平衡木實驗評分比較 干預(yù)方法與時間在平衡木實驗評分上存在交互作用（P＜0.05）；干預(yù)方法、時間在平衡木實驗評分上主效應(yīng)顯著（P＜0.05）。生理鹽水組、生地梓醇組大鼠造模后1、5、8 d平衡木實驗評分高于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；生地梓醇組大鼠造模后5、8 d平衡木實驗評分低于生理鹽水組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。生理鹽水組、生地梓醇組大鼠造模后5、8 d平衡木實驗評分分別低于本組造模后1 d，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；生理鹽水組、生地梓醇組大鼠造模后8 d平衡木實驗評分分別低于本組造模后5 d，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

表2 三組大鼠不同時間平衡木實驗評分比較（±s，分，n=8）Table 2 Comparison of balance beam test scores in the three groups at different time

表2 三組大鼠不同時間平衡木實驗評分比較（±s，分，n=8）Table 2 Comparison of balance beam test scores in the three groups at different time

注：a表示與假手術(shù)組比較，P＜0.05；b表示與生理鹽水組比較，P＜0.05；c表示與本組造模后1 d比較，P＜0.05；d表示與本組造模后5 d比較，P＜0.05

images/BZ_71_1276_1094_2279_1158.png假手術(shù)組 0.12±0.04 0.14±0.07 0.12±0.04生理鹽水組 4.35±0.72a 2.25±0.46ac 1.13±0.64acd生地梓醇組 4.38±0.11a 1.38±0.52abc 0.63±0.52abcd F 值 F交互=417.57，F(xiàn)組間=2 971.73，F(xiàn)時間=1 608.87 P 值 P交互＜0.001，P組間＜0.001，P時間＜ 0.001

2.3 三組大鼠病灶區(qū)腦組織形態(tài) 假手術(shù)組大鼠無腦梗死現(xiàn)象，見圖1A；生理鹽水組大鼠仍有腦梗死現(xiàn)象，見圖1B；生地梓醇組大鼠仍存在腦梗死現(xiàn)象，但梗死范圍較生理鹽水組減小，腦組織缺血再灌注恢復(fù)及組織形成情況明顯優(yōu)于生理鹽水組，見圖1C。

圖1 三組大鼠病灶區(qū)腦組織形態(tài)（TTC染色）Figure 1 Brain tissue morphology of lesion area in the three groups

2.4 三組大鼠腦組織VEGF、VEGFR、Notch1、Notch4 mRNA相對表達量比較 三組大鼠腦組織VEGF、VEGFR、Notch1、Notch4 mRNA相對表達量比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。生地梓醇組大鼠腦組織VEGF、VEGFR、Notch1、Notch4 mRNA相對表達量高于假手術(shù)組、生理鹽水組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表3。

表3 三組大鼠腦組織VEGF、VEGFR、Notch1、Notch4 mRNA相對表達量比較（± s，n=5）Table 3 Comparison of the relative expression of VEGF，VEGFR，Notch1，Notch4 mRNA in the brain tissue of rats in the three groups

表3 三組大鼠腦組織VEGF、VEGFR、Notch1、Notch4 mRNA相對表達量比較（± s，n=5）Table 3 Comparison of the relative expression of VEGF，VEGFR，Notch1，Notch4 mRNA in the brain tissue of rats in the three groups

注：a表示與假手術(shù)組比較，P＜0.05；b表示與生理鹽水組比較，P＜0.05；VEGF=血管內(nèi)皮生長因子，VEGFR=血管內(nèi)皮生長因子受體

組別 VEGF mRNA VEGFR mRNA Notch1 mRNA Notch4 mRNA假手術(shù)組 0.96±0.18 0.91±0.20 0.92±0.26 1.18±0.38生理鹽水組 0.99±0.08 1.00±0.12 1.04±0.11 1.04±0.10生地梓醇組 2.28±0.14ab 3.63±0.18ab 2.98±0.22ab 3.52±0.25ab F值 145.865 412.540 156.550 134.228 P值 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

3 討論

生地是治療中風經(jīng)典方中的常用藥，《中藥學(xué)》將其列為“清熱涼血”藥，載其具有“清熱涼血、養(yǎng)陰生津”之效［10］?！渡褶r(nóng)本草經(jīng)》《藥性論》等載其有“逐血痹”“通血脈”“活血生新”之效，《本草正義》稱其“非謂地黃滋補之藥，竟能消積通痹也。生者尤良，則采取鮮新，其力尤足耳”。上述文獻中均強調(diào)地黃的“生用”，當成為熟地時便不再具有活血生新之效。梓醇遇熱不穩(wěn)定，生地炮制成熟的過程也正是梓醇含量遞減至基本消失，而糖類遞增的過程［11-12］。基于此，本項目組認為：梓醇作為生地中的標志性成分，有可能是生地發(fā)揮“活血生新”功效的主要原因，其中“生新”主要體現(xiàn)在“生新脈”，即“促進血管新生、成熟、微循環(huán)重建”等［5］。在腦梗死的臨床治療過程中，缺血區(qū)血管重建與血液再灌注是治療的重點。為恢復(fù)血液供應(yīng)，除溶栓、開放血管旁路外，促進微血管網(wǎng)的形成是修復(fù)半暗帶神經(jīng)元和重塑神經(jīng)功能的另一條重要途徑。血管新生到功能血管網(wǎng)的形成包括細胞外基質(zhì)降解、內(nèi)皮細胞芽生、尖端細胞遷移、莖細胞增殖等［13］。VEGF是內(nèi)皮細胞特異性促有絲分裂原和趨化因子，作用于血管內(nèi)皮細胞表面的相應(yīng)受體，從而激活相關(guān)的缺血缺氧轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，促進新生血管形成。本研究組前期研究表明，地黃梓醇可以作用于VEGF及其受體，從而發(fā)揮促腦微血管生成的作用［5］。Notch信號通路對促進血管新生及神經(jīng)功能的恢復(fù)十分重要［14］。Notch信號通路可由VEGF激活，亦可刺激VEGF的表達，當這種平衡調(diào)節(jié)被打破后，就會導(dǎo)致無功能的血管生成、血管滲漏或血管生成過度。本研究通過觀察生地梓醇作用于VEGF及其受體后，激活下游Notch信號通路及其受體的變化，探討VEGF與Notch信號通路之間的互相調(diào)控作用，VEGF是Notch信號通路的正向調(diào)控基因，而Notch信號通路對VEGF具有負反饋調(diào)控作用，從而誘導(dǎo)新生血管進化為功能成熟和管腔完整的成熟血管，最終形成具有完整功能的血管網(wǎng)［15-16］。腦血管網(wǎng)絡(luò)的重建和再通與神經(jīng)結(jié)構(gòu)網(wǎng)絡(luò)的重構(gòu)在結(jié)構(gòu)和功能上相偶聯(lián)，微血管新生與血管網(wǎng)絡(luò)重建是實現(xiàn)腦缺血后神經(jīng)功能重塑的關(guān)鍵。

本研究結(jié)果顯示，生理鹽水組、生地梓醇組大鼠造模后1、5、8 d神經(jīng)功能評分、平衡木實驗評分高于假手術(shù)組，生地梓醇組大鼠造模后5、8 d神經(jīng)功能評分、平衡木實驗評分低于生理鹽水組；生理鹽水組、生地梓醇組大鼠造模后5、8 d神經(jīng)功能評分、平衡木實驗評分分別低于本組造模后1 d，生理鹽水組、生地梓醇組大鼠造模后8 d神經(jīng)功能評分、平衡木實驗評分分別低于本組造模后5 d；從行為學(xué)層面體現(xiàn)了生地梓醇的神經(jīng)功能重塑作用。TTC染色結(jié)果顯示，假手術(shù)組大鼠無腦梗死現(xiàn)象；生理鹽水組大鼠仍有腦梗死現(xiàn)象；生地梓醇組大鼠仍存在腦梗死現(xiàn)象，但梗死范圍較生理鹽水組減小，腦組織缺血再灌注恢復(fù)及組織形成情況明顯優(yōu)于生理鹽水組；從組織形態(tài)學(xué)層面體現(xiàn)了生地梓醇改善缺血區(qū)再灌注與腦組織保護作用。本研究結(jié)果還顯示，生地梓醇組大鼠腦組織VEGF、VEGFR、Notch1、Notch4 mRNA相對表達量高于假手術(shù)組、生理鹽水組，表明生地梓醇可上調(diào)VEGF、VEGFR、Notch1、Notch4表達，激活Notch信號通路，調(diào)控血管新生與成熟，促進功能血管生成，進而實現(xiàn)神經(jīng)功能重塑。有研究表明，生地梓醇通過上調(diào)VEGF來發(fā)揮促血管新生作用的同時，伴有組織水腫的加重［17］。而本研究發(fā)現(xiàn)生地梓醇能夠?qū)崿F(xiàn)VEGF/Notch信號通路的雙調(diào)控，形成功能穩(wěn)定的血管網(wǎng)，且并未發(fā)現(xiàn)大鼠腦組織水腫加重。因此，VEGF與Notch信號通路的動態(tài)平衡是微血管形成和穩(wěn)定的關(guān)鍵。

本實驗大鼠樣本量較小，結(jié)果可能存在偏倚，仍需要大樣本量的研究進一步證實。對于生地梓醇在臨床中的促血管新生與神經(jīng)重塑作用，有待于進一步探討。

綜上所述，生地梓醇可通過調(diào)控VEGF及VEGFR激活Notch信號通路來促進血管新生與神經(jīng)功能重塑，且不增加組織水腫。其促血管新生作用可視為生地“生新脈”功效的微觀體現(xiàn)，值得進一步研究及臨床轉(zhuǎn)化。

作者貢獻：孫立平、周霞進行文章的構(gòu)思與設(shè)計；劉炬、劉偉進行研究的實施與可行性分析；郭炳杉進行數(shù)據(jù)收集、整理；王祥煜進行統(tǒng)計學(xué)處理；孫立平、張佳樂進行結(jié)果的分析與解釋；孫立平撰寫論文；周霞進行論文的修訂，負責文章的質(zhì)量控制及審校，對文章整體負責、監(jiān)督管理。

本文無利益沖突。