垂體腺瘤患者缺氧誘導(dǎo)因子-1α與線粒體相關(guān)基因的相關(guān)性及腫瘤侵襲和復(fù)發(fā)的影響因素研究

張歡，石文健，劉永亮，李景武，張于，董桂蘭，董偉

細(xì)胞能量代謝功能失調(diào)是癌癥的重要特征，與線粒體DNA突變、線粒體酶缺陷或改變的癌基因/腫瘤抑制因子導(dǎo)致的線粒體功能障礙有關(guān)［1］。線粒體是一種多功能細(xì)胞器，與多種信號(hào)通路有關(guān)，包括能量代謝、氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期、自噬和免疫過(guò)程。線粒體功能障礙可通過(guò)各種機(jī)制促進(jìn)癌細(xì)胞進(jìn)展為抗凋亡/化學(xué)抗性和/或侵襲性表型［2］。已有研究證實(shí)包括低氧誘導(dǎo)因子（hypoxia-inducible factor，HIF）-1ɑ和TP53在內(nèi)的致癌基因/抑癌基因可通過(guò)調(diào)節(jié)線粒體呼吸和細(xì)胞能量代謝而導(dǎo)致腫瘤發(fā)生及不良預(yù)后［3-4］。一項(xiàng)基于蛋白質(zhì)組學(xué)垂體腺瘤的分子網(wǎng)絡(luò)研究結(jié)果表明，線粒體功能障礙、氧化應(yīng)激、細(xì)胞周期紊亂和絲裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase，MAPK）信號(hào)傳導(dǎo)異常與垂體腺瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［5］。本研究通過(guò)熒光定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR）檢測(cè)垂體腺瘤患者的HIF-1α、溶酶體相關(guān)膜蛋白1（lysosomal associated membrane protein 1，LAMP1）、線粒體內(nèi)膜融合蛋白1（optic atrophy 1，OPA1）及線粒體外膜轉(zhuǎn)位酶 20（translocase of outer mitochondrial membrane 20，TOMM20）的mRNA相對(duì)表達(dá)量，并分析低氧、線粒體功能與垂體腺瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)系，以期為開(kāi)發(fā)基于線粒體途徑的新候選靶點(diǎn)提供參考依據(jù)。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2016—2018年在唐山市人民醫(yī)院接受內(nèi)鏡經(jīng)蝶手術(shù)治療的84例垂體腺瘤患者作為研究對(duì)象，其中男31例，女53例；年齡20～73歲，平均（45.9±1.4）歲；腫瘤體積0.05～45.50 cm3，平均（11.30±1.47）cm3；Ki-67增殖指數(shù)1%～20%，平均（4.5±0.4）%；無(wú)侵襲性（Knosp分級(jí)［6］Ⅰ～Ⅱ級(jí)）38例，侵襲性（Knosp分級(jí)Ⅲ～Ⅳ級(jí)）46例；腫瘤起源［7］：類(lèi)固醇生成因子1（steroidogenic factor 1，SF-1）42例，POU結(jié)構(gòu)域1類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子1（POU class 1 homeobox 1，POU1F1）37例，T盒垂體限制轉(zhuǎn)錄因子19（T-box pituitary restricted transcription factor 19，TBX19）5例；磁共振成像檢查顯示海綿竇受壓37例（44.05%）；隨訪27～69個(gè)月，復(fù)發(fā)22例（26.2%）。本研究經(jīng)唐山市人民醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)（審批號(hào)：RMYYLLKS-2020-004），所有患者或法定代理人對(duì)本研究知情并簽署知情同意書(shū)。

1.2 HIF-1α、LAMP1、OPA1、TOMM20的 mRNA 相對(duì)表達(dá)量檢測(cè)方法 稱(chēng)量腫瘤標(biāo)本10 mg，采用總RNA提取試劑盒〔天根生化科技（北京）有限公司生產(chǎn)，貨號(hào)：DP419〕提取總RNA，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國(guó)Thermo公司生產(chǎn)，貨號(hào)：#1622）合成cDNA，而后采用TaqManTM基因表達(dá)反應(yīng)試劑盒（美國(guó)Thermo公司生產(chǎn)，貨號(hào)：4369016）進(jìn)行RT-PCR，熱循環(huán)條件為：95 ℃變性 10 s，60 ℃退火 1 min，72 ℃延伸 10 s，共40個(gè)循環(huán)。以GAPDH作為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算HIF-1α、LAMP1、OPA1、TOMM20的mRNA相對(duì)表達(dá)量，引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。計(jì)量資料以（±s）表示，組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以相對(duì)數(shù)表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。HIF-1α mRNA相對(duì)表達(dá)量與LAMP1、OPA1及TOMM20的mRNA相對(duì)表達(dá)量的相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)分析。采用多因素Logistic回歸分析探討垂體腺瘤患者腫瘤侵襲和復(fù)發(fā)的影響因素。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HIF-1α、LAMP1、OPA1、TOMM20的 mRNA 相對(duì)表達(dá)量及相關(guān)性分析 RT-PCR結(jié)果顯示，垂體腺瘤患者HIF-1α mRNA相對(duì)表達(dá)量為0.008～0.210，平均（0.087±0.005）；OPA1 mRNA相對(duì)表達(dá)量為0.006～0.063， 平 均（0.031±0.002）；LAMP1 mRNA相對(duì)表達(dá)量為0.019～0.345，平均（0.156±0.009）；TOMM20 mRNA相對(duì)表達(dá)量為0.037～0.504，平均（0.226±0.011）。Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示，HIF-1α mRNA相對(duì)表達(dá)量與LAMP1、OPA1及TOMM20的mRNA相對(duì)表達(dá)量均呈正相關(guān)（r值分別為0.814、0.600、0.771，P值均＜0.001）。

2.2 侵襲性與無(wú)侵襲性垂體腺瘤患者臨床資料比較 與無(wú)侵襲性垂體腺瘤患者相比，侵襲性垂體腺瘤患者的腫瘤體積較大，Ki-67增殖指數(shù)、海綿竇受壓發(fā)生率、復(fù)發(fā)率及HIF-1α mRNA相對(duì)表達(dá)量較高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；侵襲性與無(wú)侵襲性垂體腺瘤患者的性別、年齡、腫瘤起源及LAMP1、OPA1、TOMM20 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表2。

2.3 復(fù)發(fā)與未復(fù)發(fā)的垂體腺瘤患者臨床資料比較與未復(fù)發(fā)的垂體腺瘤患者相比，復(fù)發(fā)的垂體腺瘤患者Ki-67增殖指數(shù)、侵襲性腫瘤者占比、海綿竇受壓發(fā)生率、TOMM20 mRNA相對(duì)表達(dá)量較高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；復(fù)發(fā)與未復(fù)發(fā)的垂體腺瘤患者的性別、年齡、腫瘤體積、腫瘤起源及HIF-1α、LAMP1、OPA1 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表3。

2.4 多因素Loistic回歸分析 將表2、表3中有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的指標(biāo)作為自變量，腫瘤侵襲情況、復(fù)發(fā)情況分別作為因變量，變量賦值見(jiàn)表4，進(jìn)行多因素Logistic回歸分析，結(jié)果顯示，腫瘤體積、海綿竇受壓、HIF-1α mRNA相對(duì)表達(dá)量是垂體腺瘤患者腫瘤侵襲的獨(dú)立影響因素（P＜0.05），見(jiàn)表5；TOMM20 mRNA相對(duì)表達(dá)量是垂體腺瘤患者腫瘤復(fù)發(fā)的獨(dú)立影響因素（P＜0.05），見(jiàn)表6。

表2 侵襲性與無(wú)侵襲性垂體腺瘤患者臨床資料比較Table 2 Comparison of clinical data between invasive patients and noninvasive patients with pituitary adenoma

表3 復(fù)發(fā)與未復(fù)發(fā)的垂體腺瘤患者臨床資料比較Table 3 Comparison of clinical data between recurrence patients and nonrecurrence patients with pituitary adenoma

表4 垂體腺瘤患者腫瘤侵襲或復(fù)發(fā)影響因素的多因素Logistic回歸分析變量賦值Table 4 Variable assignment of multivariate Logistic regression analysis of influencing factors of tumor invasion or recurrence in patients with pituitary adenoma

表5 垂體腺瘤患者腫瘤侵襲影響因素的多因素Logistic回歸分析Table 5 Multivariate Logistic regression analysis of influencing factors of tumor invasion in patients with pituitary adenoma

表6 垂體腺瘤患者腫瘤復(fù)發(fā)影響因素的多因素Logistic回歸分析Table 6 Multivariate Logistic regression analysis of influencing factors of tumor recurrence in patients with pituitary adenoma

3 討論

氧穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)是調(diào)節(jié)生理氧變化最基本的細(xì)胞過(guò)程，氧穩(wěn)態(tài)紊亂可導(dǎo)致包括惡性腫瘤在內(nèi)的各種疾?。?］。缺氧與癌癥的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，缺氧/氧感應(yīng)信號(hào)在調(diào)節(jié)惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展中具有關(guān)鍵作用［9］。

HIF-1是由HIF-1α和HIF-1β組成的異源二聚體，在常氧環(huán)境下可經(jīng)泛素-蛋白酶體系統(tǒng)降解，但該途徑在缺氧環(huán)境下可受到抑制［10］。HIF-1α可反映機(jī)體缺氧程度，通過(guò)代謝、增殖和血管生成等多個(gè)生理過(guò)程而參與癌癥的發(fā)生發(fā)展［11］。HIF-1α表達(dá)量上調(diào)有助于血管生成、代謝重編程、細(xì)胞外基質(zhì)重塑、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化、運(yùn)動(dòng)、侵襲、轉(zhuǎn)移、腫瘤干細(xì)胞維持、腫瘤免疫逃逸以及抵抗化療、放療［12］。HIF-1α能通過(guò)促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞向低氧組織遷移，即上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，進(jìn)而促進(jìn)新生血管形成，最終導(dǎo)致腫瘤的惡性轉(zhuǎn)歸［13］。本研究結(jié)果顯示，HIF-1α mRNA相對(duì)表達(dá)量是垂體腺瘤患者腫瘤侵襲的獨(dú)立影響因素。

線粒體功能障礙是多種疾病發(fā)生的標(biāo)志，功能失調(diào)的線粒體可以導(dǎo)致基因表達(dá)改變，從而改變細(xì)胞的形態(tài)和功能［14］。LAMP屬于糖基化蛋白家族成員，主要存在于溶酶體膜上，不同組織中其表達(dá)可能有所不同，可影響細(xì)胞的吞噬、自噬、脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和衰老等過(guò)程［15］。OPA1可調(diào)控腫瘤血管的生成和發(fā)育，臨床實(shí)驗(yàn)已證實(shí)小分子OPA1抑制劑可以抑制腫瘤生長(zhǎng)［16］。TOMM20已被證實(shí)是外線粒體膜復(fù)合物易位酶的一個(gè)重要亞基，負(fù)責(zé)識(shí)別線粒體蛋白并將其從細(xì)胞溶質(zhì)轉(zhuǎn)移到線粒體中［17］，較大線粒體質(zhì)量和較高線粒體活性細(xì)胞的TOMM20表達(dá)水平較高［18］，TOMM20水平已成為臨床評(píng)估多種腫瘤患者預(yù)后的生物標(biāo)志物之一［19-21］。有研究表明，TOMM20過(guò)表達(dá)能夠促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，而siRNA介導(dǎo)的TOMM20表達(dá)可抑制細(xì)胞增殖、遷移和侵襲［19］。TOMM20表達(dá)直接影響線粒體功能，包括ATP產(chǎn)生和膜電位的維持，這有助于致瘤細(xì)胞活動(dòng)，包括調(diào)節(jié)S期細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡。在間質(zhì)性腫瘤中，TOMM20是誘導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和代謝重編程的標(biāo)志物［20］。本研究結(jié)果顯示，TOMM20 mRNA相對(duì)表達(dá)量是垂體腺瘤患者腫瘤復(fù)發(fā)的獨(dú)立影響因素。

HIF-1α、線粒體功能障礙均會(huì)導(dǎo)致能量代謝重編程，包括限制線粒體能量代謝、增加葡萄糖攝取量和增強(qiáng)糖無(wú)氧酵解能力［22］。因此HIF-1α與線粒體功能障礙之間可能存在聯(lián)系。本研究結(jié)果顯示，垂體腺瘤患者HIF-1α mRNA相對(duì)表達(dá)量與LAMP1、OPA1及TOMM20的mRNA相對(duì)表達(dá)量均呈正相關(guān)，推測(cè)垂體腺瘤患者機(jī)體缺氧狀態(tài)可導(dǎo)致線粒體功能改變，而腫瘤細(xì)胞代謝重編程可進(jìn)一步誘導(dǎo)腫瘤上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，從而導(dǎo)致不良預(yù)后。

綜上所述，HIF-1α mRNA相對(duì)表達(dá)量與LAMP1、OPA1、TOMM20的mRNA相對(duì)表達(dá)量均呈正相關(guān)，且HIF-1α mRNA相對(duì)表達(dá)量是垂體腺瘤患者腫瘤侵襲的獨(dú)立影響因素，TOMM20 mRNA相對(duì)表達(dá)量是垂體腺瘤患者腫瘤復(fù)發(fā)的獨(dú)立影響因素。受限于實(shí)驗(yàn)條件，本研究未進(jìn)行線粒體數(shù)量、形態(tài)學(xué)和相關(guān)代謝產(chǎn)物的檢測(cè)，因此線粒體途徑是否可作為垂體腺瘤新的治療靶點(diǎn)仍需更多的臨床研究證實(shí)。

作者貢獻(xiàn)：石文建、劉永亮、董偉進(jìn)行文章的構(gòu)思與設(shè)計(jì)；張于進(jìn)行數(shù)據(jù)的收集、整理、分析；李景武、董桂蘭進(jìn)行結(jié)果分析與解釋?zhuān)粡垰g撰寫(xiě)、修訂論文；董偉負(fù)責(zé)文章的質(zhì)量控制及審校，并對(duì)文章整體負(fù)責(zé)、監(jiān)督管理。

本文無(wú)利益沖突。