納米粒子載體對(duì)灰飛虱RNAi效率的影響

周 晨, 朱先敏, 朱 鳳, 張海波, 韓召軍, 楊榮明,*, 王康旭1,,*

(1. 南京財(cái)經(jīng)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院, 江蘇省現(xiàn)代糧食流通與安全協(xié)同創(chuàng)新中心, 南京 210023;2. 江蘇省植物保護(hù)植物檢疫站, 南京 210036; 3. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院, 南京 210095)

灰飛虱Laodelphaxstriatellus是一種極具破壞性的水稻害蟲，給我國(guó)水稻生產(chǎn)造成了嚴(yán)重的損失，影響了我國(guó)糧食和食品安全(程家安等, 2008)。目前最普遍的灰飛虱控制策略是在水稻生長(zhǎng)期內(nèi)施加化學(xué)殺蟲劑，但是灰飛虱對(duì)現(xiàn)有的主要?dú)⑾x劑已經(jīng)發(fā)展出較高水平的抗藥性，降低了化學(xué)防治對(duì)于灰飛虱的有效性(徐鹿等, 2018)。因此，探尋防治有效而環(huán)保的灰飛虱的防治方法具有重要意義。RNA干擾(RNA interference, RNAi)是由雙鏈RNA (double-stranded RNA, dsRNA)引發(fā)的轉(zhuǎn)錄后基因沉默現(xiàn)象(Tsaietal., 2015)。該技術(shù)通過抑制必需基因的表達(dá)能夠?qū)е潞οx適應(yīng)性下降和死亡，進(jìn)而在害蟲防治領(lǐng)域顯示出巨大潛力(Maoetal., 2007; Zhu and Palli, 2020)。由于灰飛虱基因組數(shù)據(jù)已解析(Zhuetal., 2017)，使得有更多的基因功能需要被注釋，同時(shí)也產(chǎn)生了許多RNAi候補(bǔ)靶標(biāo)基因可以用于灰飛虱的防治，因此RNAi技術(shù)在灰飛虱功能基因組學(xué)和蟲害防治領(lǐng)域展現(xiàn)出極大的應(yīng)用前景。其中，dsRNA喂食是最具經(jīng)濟(jì)效益的dsRNA遞送方式，可直接用于蟲害防治(Yang and Han, 2014; Zottietal., 2018)。然而在灰飛虱研究中，大量的數(shù)據(jù)表明，相較于dsRNA注射，dsRNA喂食產(chǎn)生的 RNAi效率較低(張倩等, 2012; Jiaetal., 2015)，這直接影響了RNAi技術(shù)在灰飛虱害蟲防治中的應(yīng)用。目前的研究發(fā)現(xiàn)，dsRNA在害蟲體內(nèi)的快速降解和低效的細(xì)胞吸收能力可能是導(dǎo)致部分昆蟲RNAi敏感性較低的重要因素(Garbuttetal., 2013; Luoetal., 2013; Renetal., 2014; Wynantetal., 2014)。因此發(fā)展可靠的喂食遞送方法，提高dsRNA的體內(nèi)穩(wěn)定性和細(xì)胞吸收能力是實(shí)現(xiàn)RNAi技術(shù)在灰飛虱防治應(yīng)用的關(guān)鍵。

納米粒子(nanoparticle, NP)介導(dǎo)的RNAi防治逐漸發(fā)展成為害蟲防治中的熱點(diǎn)。Whyard等(2009)發(fā)現(xiàn)被脂質(zhì)體(liposomes)包裹的dsRNA在喂食后可以在不同的果蠅品種中產(chǎn)生高效RNAi效應(yīng)。在亞洲玉米螟Ostriniafurnacalis中，一種陽(yáng)離子熒光納米粒子(FNP)介導(dǎo)的喂食RNAi可以有效地沉默亞洲玉米螟關(guān)鍵發(fā)育基因的表達(dá)，產(chǎn)生高致死率(Heetal., 2013)。在大豆蚜Aphisglycines中，Zheng等(2019)利用聚合物攜帶dsRNA突破了害蟲體壁屏障。在岡比亞按蚊Anophelesgambiae中，殼聚糖(chitosan)能夠顯著提高試蟲對(duì)于喂食dsRNA的敏感性(Zhangetal., 2010)。然而在半翅目昆蟲中，尤其是飛虱科害蟲中很少有關(guān)于納米粒子介導(dǎo)的RNAi實(shí)驗(yàn)報(bào)道，因此本研究選擇灰飛虱為研究對(duì)象，探索納米載體對(duì)其RNAi效率的影響。本研究通過應(yīng)用納米粒子介導(dǎo)的dsRNA喂食對(duì)灰飛虱若蟲進(jìn)行RNAi，對(duì)3種代表性納米粒子[殼聚糖，碳量子點(diǎn)(carbon quantum dot, CQD)和脂質(zhì)體(lipofectamine 2000)]介導(dǎo)的dsRNA喂食，在基因沉默和防控中的效率進(jìn)行系統(tǒng)性比較，初步確定了針對(duì)灰飛虱的dsRNA高效納米遞送載體，為基于RNAi的害蟲防控奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx

本實(shí)驗(yàn)采用的灰飛虱品系采自江蘇興化田間，室內(nèi)用稻苗飼養(yǎng)。養(yǎng)蟲室溫度為28±1℃，相對(duì)濕度維持在65%～70%，光周期為16L∶8D?；绎w虱RNAi實(shí)驗(yàn)從初孵若蟲階段開始統(tǒng)一收集，待其長(zhǎng)至2齡若蟲后，用于后續(xù)dsRNA喂食處理。

1.2 總RNA提取和cDNA合成

20頭灰飛虱若蟲蟲體經(jīng)過液氮研磨后，利用RNeasy Mini Kit試劑盒進(jìn)行總RNA的提取，利用NanoDrop ND-1000測(cè)定其濃度，利用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)核酸質(zhì)量，總RNA樣品于-80℃超低溫冰箱內(nèi)保存待用。利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimeScriptTMRT Reagent Kit)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第1鏈，保存于-20℃冰箱內(nèi)待用。

1.3 dsRNA的合成

根據(jù)已知的灰飛虱膜結(jié)合型海藻糖酶基因LsStre序列(GenBank登錄號(hào): JQ027051)設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增產(chǎn)物克隆入載體，以測(cè)序正確的重組質(zhì)粒DNA作為模板，采用300～400 μL的體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分離，回收模板DNA條帶，選擇Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System回收試劑盒進(jìn)行模板純化，用T7 RiboMAXTMExpress RNAi System試劑盒體外合成dsRNA，利用NanoDrop ND-1000測(cè)定dsRNA的濃度。同時(shí)以綠色熒光蛋白基因(Egfp)為模板，以相同方法合成對(duì)應(yīng)dsEgfp作為對(duì)照組。最后，用于喂食灰飛虱的dsRNA分別為dsLsStre(420 bp)以及對(duì)照dsEgfp(414 bp)，用于dsRNA合成的特異性引物見表1。

表1 本研究使用的引物Table 1 Primers used in this study

1.4 NP-dsRNA復(fù)合物的制備

使用Zhang等(2010)描述的方法準(zhǔn)備殼聚糖包裹的dsRNA復(fù)合物。將≥75%脫乙?；瘹ぞ厶侨芙庥?.1 mol/L醋酸鈉中配成0.02% (m∶v)殼聚糖溶液，再將100 μL殼聚糖溶液加入100 μL含有32 μg dsRNA的硫酸鈉溶液之中，55℃孵育1 min后迅速在渦旋儀上高速渦旋30 s形成殼聚糖/dsRNA顆粒。使用微波法制備CQD(Dasetal., 2015)。將9 mL的PEG-200加至2 mL去核酸酶水中，再將100 mg PEI溶于2 mL去核酸酶水后同制好的PEG溶液混勻，再放入微波爐中800 W處理3 min，CQD和含有dsRNA的硫酸鈉在4℃下進(jìn)行過夜孵育，CQD與dsRNA的比例為20∶1(v/v)。將dsRNA同lipofectamine 2000混勻和處理得到dsRNA-脂質(zhì)體復(fù)合物。為了測(cè)定這幾種NP的包裹效率，將NP-dsRNA復(fù)合物在21 000 g下離心30 min，使用光譜儀測(cè)量上清中dsRNA含量。通過比較起始dsRNA與上清中殘存的dsRNA含量，計(jì)算與NP形成復(fù)合物的dsRNA所占百分比(即dsRNA裝載率)。

1.5 dsRNA喂食

利用褐飛虱人工飼料飼養(yǎng)方法進(jìn)行灰飛虱dsRNA喂食處理(張倩等, 2012)。首先將雙通管(12 cm×3 cm)一端用細(xì)紗布封口，之后將25～30頭的2齡初期灰飛虱若蟲吸至管內(nèi)，將封口膜(parafilm)拉伸后封住雙通管，再將50 μL包含1.75 μg dsEgfp或dsLsStre的NP-dsRNA液體飼料吸打在封口膜上，之后再用另一塊封口膜貼在包含dsRNA的液體飼料上重復(fù)封口，使得雙通管一端形成飼料膜包；將雙通管橫放在養(yǎng)蟲架上，用濕潤(rùn)的黑布將其包裹，露出帶有飼料的一端，利用趨光性讓灰飛虱進(jìn)行取食。每天更換飼料，并使用細(xì)頭毛筆挑出死蟲進(jìn)行記錄數(shù)據(jù)，連續(xù)記錄6 d數(shù)據(jù)。每個(gè)處理進(jìn)行5次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)，每次實(shí)驗(yàn)設(shè)3～5管重復(fù)。

1.6 靶基因表達(dá)量的qPCR分析

使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)檢測(cè)靶標(biāo)基因LsStre的表達(dá)水平來評(píng)價(jià)RNAi效果。選用喂食處理2 d后的試蟲將其保存在液氮內(nèi)，進(jìn)行總RNA提取和cDNA合成，利用AceQ qPCR SYBR Green Master Mix進(jìn)行qPCR測(cè)定。反應(yīng)程序：95℃ 30 s; 95℃ 5 s， 60℃ 34 s, 40個(gè)循環(huán)。內(nèi)參基因?yàn)棣?actin(Act)。每個(gè)樣品至少設(shè)置5組生物學(xué)重復(fù)，每組進(jìn)行3次技術(shù)重復(fù)測(cè)定。采用2-ΔΔCt方法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)水平，dsEgfp被用作陰性對(duì)照來計(jì)算dsRNA產(chǎn)生的RNAi效率。qPCR中使用的引物見表1，靶標(biāo)基因LsStre和內(nèi)參基因Actin的qPCR引物的擴(kuò)增效率分別為96.4%和93.5%。

1.7 數(shù)據(jù)分析

使用GraphPad 8.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和作圖，qPCR數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤進(jìn)行表示，mRNA相對(duì)表達(dá)量采用單因素方差分析，并進(jìn)行Tukey氏檢驗(yàn)。采用Abbott公式(劉影等, 2008)計(jì)算試蟲的校正死亡率，其中，以喂食dsEgfp的為對(duì)照對(duì)無載體遞送的裸dsLsStre進(jìn)行校正，以不同NP-dsEgfp喂食為對(duì)照對(duì)相應(yīng)NP-dsLsStre喂食處理組進(jìn)行校正計(jì)算，公式如下：

式中：T0為喂食dsLsStre灰飛虱的初始數(shù)量，T為喂食dsLsStre灰飛虱的終期數(shù)量，CK0為喂食dsEgfp灰飛虱的初始數(shù)量，CK為喂食dsEgfp灰飛虱的終期數(shù)量。

之后，利用如下公式來計(jì)算不同納米載體的增效系數(shù)，其中，增效系數(shù)大于1.6的為增效作用(Jonkeretal., 2005)。

2 結(jié)果

2.1 NP-dsEgfp復(fù)合體的制備

本研究首先以Egfp基因?yàn)槟０搴铣傻膁sEgfp，再將dsEgfp與不同的納米粒子復(fù)合制成不同組合的NP-dsEgfp復(fù)合體。NP-dsEgfp復(fù)合物離心后，使用光譜儀測(cè)量上清中dsEgfp含量。通過比較起始dsEgfp與上清中殘存dsEgfp含量，測(cè)定納米材料對(duì)dsEgfp的包裹裝載能力。結(jié)果表明，不同納米載體的dsEgfp裝載率都在95%以上(圖1: A)。另外，由于很多納米粒子對(duì)生物體都存在潛在的毒性，因此我們向灰飛虱2齡若蟲喂食含有不同NP-dsEgfp復(fù)合物的人工飼料和含有相同含量dsEgfp的人工飼料。通過連續(xù)喂食實(shí)驗(yàn)，在處理7 d后對(duì)不同處理組的死亡率進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)各組間死亡率無顯著差異(P>0.05)，表明這3種納米載體對(duì)灰飛虱2齡若蟲的毒性均較小(圖1: B)。

圖1 不同納米粒子的dsEgfp裝載率(A)及不同納米粒子介導(dǎo)dsEgfp喂食處理7 d后灰飛虱2齡若蟲的死亡率(B)Fig. 1 dsEgfp loading efficacy of different nanoparticles (NPs) (A) and mortality of the 2nd nymphs of Laodelphax striatellusfeeding with dsEgfp mediated by different NPs for 7 d (B) chi: 殼聚糖Chitosan; CQD: 碳量子點(diǎn)Carbon quantum dots; L2000: Lipofectamine 2000; Control: 空白對(duì)照Blank control; Naked dsEgfp: 未用納米粒子包裹的dsEgfp (dsEgfp not encapsulated with nanoparticles); chi-dsEgfp: 殼聚糖包裹的dsEgfp (dsEgfp encapsulated with chitosan); CQD-dsEgfp: 碳量子點(diǎn)包裹的dsEgfp (dsEgfp encapsulated with carbon quantum dots); L2000-dsEgfp: Lipofectamine 2000包裹的dsEgfp (dsEgfp encapsulated with lipofectamine 2000). 圖中數(shù)據(jù)為3次重復(fù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤；柱上相同小寫字母代表不同處理之間差異不顯著(P>0.05, Tukey氏檢驗(yàn))。Data in the figure are mean±SE of three replications. The same lowercase letters above bars indicate no significant difference between different treatments (P>0.05, Tukey’s test).

2.2 喂食NP-dsLsStre復(fù)合體后靶標(biāo)基因表達(dá)量變化

將NP-dsLsStre復(fù)合物同灰飛虱人工飼料混合，分別利用裸dsEgfp和添加了NP-dsEgfp的人工飼料作為對(duì)照，保證人工飼料中dsRNA含量為35 ng/μL。由于在開始喂食后2～3 d灰飛虱的死亡情況出現(xiàn)明顯增加，因此選擇在開始dsRNA處理后的第2天對(duì)靶標(biāo)基因LsStre的mRNA水平進(jìn)行檢測(cè)(圖2)。qPCR數(shù)據(jù)表明，同喂食dsEgfp的對(duì)照組相比，使用無載體遞送的dsLsStre喂食后的灰飛虱2齡若蟲中LsStre表達(dá)量的抑制率為46%，而使用殼聚糖和CQD包裹后的dsLsStre能夠顯著增強(qiáng)LsStre的RNAi效率，對(duì)LsStre表達(dá)量的抑制率分別達(dá)到78%和84%；與此同時(shí)，由lipofectamine 2000介導(dǎo)的dsLeStre喂食對(duì)LsStre表達(dá)量的抑制率為52%，分析可知，脂質(zhì)體lipofectamine 2000不能顯著提高LsStredsRNA的RNAi效率。

圖2 不同納米粒子介導(dǎo)dsRNA喂食2 d后灰飛虱2齡若蟲中的LsStre相對(duì)表達(dá)量Fig. 2 Relative expression levels of LsStre in the 2nd nymphs of Laodelphax striatellus after feeding with dsRNA mediated by different nanoparticles (NPs) for 2 d Naked dsEgfp: 未用納米粒子包裹的dsEgfp (dsEgfp not encapsulated with nanoparticles); chi-dsEgfp: 殼聚糖包裹的dsEgfp (dsEgfp encapsulated with chitosan); CQD-dsEgfp: 碳量子點(diǎn)包裹的dsEgfp (dsEgfp encapsulated with carbon quantum dots); L2000-dsEgfp: Lipofectamine 2000包裹的dsEgfp (dsEgfp encapsulated with lipofectamine 2000); Naked dsLsStre: 未用納米粒子包裹的dsLsStre (dsLsStre not encapsulated with nanoparticles); chi-dsLsStre: 殼聚糖包裹的dsLsStre (dsLsStre encapsulated with chitosan); CQD-dsLsStre: 碳量子點(diǎn)包裹的dsLsStre (dsLsStre encapsulated with carbon quantum dots); L2000-dsLsStre: Lipofectamine 2000包裹的dsLsStre (dsLsStre encapsulated with lipofectamine 2000). 圖中數(shù)據(jù)為 3 次重復(fù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤；柱上不同小寫字母代表不同處理之間差異顯著(P<0.05, Tukey 氏檢驗(yàn))。Data in the figure are mean±SE of three replications. Different lowercase letters above bars indicate significant difference between different treatments (P<0.05, Tukey’s test).

2.3 NP-dsLsStre復(fù)合體介導(dǎo)的灰飛虱致死效應(yīng)

通過連續(xù)喂食實(shí)驗(yàn)，利用2齡灰飛虱若蟲來研究不同NP-dsLsStre復(fù)合物喂食后的致死情況。采用NP-dsEgfp作為對(duì)照來計(jì)算NP-dsLsStre引起的校正死亡率。如圖3所示，在NP-dsLsStre開始喂食的2 d后，殼聚糖、CQD和lipofectamine 2000介導(dǎo)的2齡若蟲的校正死亡率分別為23%, 19%和9%；4 d后，校正死亡率分別上升到53%, 64%和22%；而在連續(xù)喂食第6天2齡若蟲的校正死亡率則分別達(dá)到76%, 82%和38%。而使用無載體遞送的裸dsLsStre喂食6 d后所導(dǎo)致的2齡若蟲校正死亡率則為35%。計(jì)算可知，喂食6 d后，殼聚糖、CQD和lipofectamine 2000介導(dǎo)的致死增效系數(shù)分別為2.17, 2.34和1.09。結(jié)果表明，同脂質(zhì)體lipofectamine 2000相比，殼聚糖和CQD可以顯著提高dsLsStre的致死效率。

圖3 用不同納米粒子介導(dǎo)dsLsStre喂食處理6 d內(nèi)灰飛虱2齡若蟲的校正死亡率Fig. 3 Corrected mortality of the 2nd nymphs of Laodelphaxstriatellus feeding with dsLsStre mediated by different nanoparticles (NPs) within 6 d Naked dsLsStre: 未用納米粒子包裹的dsLsStre (dsLsStre not encapsulated with nanoparticles); chi-dsLsStre: 殼聚糖包裹的dsLsStre (dsLsStre encapsulated with chitosan); CQD-dsLsStre: 碳量子點(diǎn)包裹的dsLsStre (dsLsStre encapsulated with carbon quantum dots); L2000-dsLsStre: Lipofectamine2000包裹的dsLsStre(dsLsStre encapsulated with lipofectamine2000). 圖中數(shù)據(jù)為3 次重復(fù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤；不同小寫字母代表同一時(shí)間點(diǎn)不同處理之間差異顯著(P<0.05, Kruskal-Wallis檢驗(yàn))。Data in the figure are mean±SE of three replications. Different lowercase letters indicate significant difference between different treatments at the same time point (P<0.05, Kruskal-Wallis test).

3 討論

RNAi已經(jīng)展示了在害蟲防治方面的重要前景(Baumetal., 2007; Zhangetal., 2015)，但是dsRNA在昆蟲體內(nèi)的快速降解和較低的細(xì)胞吸收效率，導(dǎo)致了昆蟲RNAi效果不佳的問題，限制了這種新型害蟲防治技術(shù)的進(jìn)一步應(yīng)用(Zhu and Palli, 2020)。研究表明，納米粒子可以通過提高dsRNA體內(nèi)持續(xù)性和跨膜運(yùn)輸能力增強(qiáng)了其在生物體內(nèi)的活性(Wangetal., 2020)。然而RNAi增效載體在昆蟲學(xué)研究中的范例較少，尤其在半翅目這種RNAi較為不敏感昆蟲中的探索相對(duì)缺乏。因此，我們挑選了水稻上重要的半翅目害蟲灰飛虱作為試蟲，來系統(tǒng)性地測(cè)試納米載體介導(dǎo)的RNAi的增效作用。團(tuán)隊(duì)前期研究發(fā)現(xiàn)，膜結(jié)合型海藻糖酶基因LsStre受抑制后會(huì)導(dǎo)致灰飛虱試蟲的死亡(校正死亡率為39%)(張倩等, 2012)。在此基礎(chǔ)上，我們利用納米粒子殼聚糖、CQD以及l(fā)ipofectamine 2000建立了納米載體對(duì)RNAi干擾LsStre的增效評(píng)價(jià)系統(tǒng)。首先對(duì)3種納米粒子的dsRNA包裹效率進(jìn)行了檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)3種載體的dsRNA裝載率均在95%以上(圖1)；之后，對(duì)納米載體介導(dǎo)的LsStredsRNA喂食灰飛虱2齡若蟲后LsStre的RNAi效率和對(duì)應(yīng)的2齡若蟲死亡率進(jìn)行了比較研究，發(fā)現(xiàn)殼聚糖和CQD能夠顯著提高LsStre的RNAi效率(抑制率分別為78%和84%)(圖2)；同時(shí)在確認(rèn)3種納米粒子對(duì)灰飛虱若蟲的毒性較弱后，我們發(fā)現(xiàn)殼聚糖和CQD大大提高了LsStredsRNA的致死效應(yīng)，連續(xù)喂食6 d后灰飛虱若蟲的校正后死亡率分別達(dá)到76%和82%(增效系數(shù)分別為2.17和2.34)，而脂質(zhì)體lipofectamine 2000的增效能力較弱(增效系數(shù)為1.09)(圖3)。

納米載體主要通過提高dsRNA體內(nèi)穩(wěn)定性和跨膜運(yùn)輸效率來影響RNAi效率(Patiletal., 2011; Gilleronetal., 2013; Madanietal., 2013; Mysoreetal., 2013; Rameshetal., 2016; Vermeulenetal., 2018)。目前對(duì)于納米載體提高dsRNA在昆蟲體內(nèi)穩(wěn)定性的機(jī)制較為清楚，研究表明，在東亞飛蝗Locustamigratoriamanilensis、德國(guó)小蠊Blattellagermanica和甜菜夜蛾Spodopteraexigua等害蟲中(Luoetal., 2013)，以脂質(zhì)體為代表的遞送載體可以通過保護(hù)dsRNA免受體液核酸酶的降解，顯著提高了dsRNA在昆蟲體內(nèi)的半衰期(Linetal., 2017)。而目前對(duì)于跨膜增效現(xiàn)象的報(bào)道較多，例如在亞洲玉米螟和赤擬谷盜Triboliumcastaneum中，部分納米載體能夠顯著提高dsRNA的細(xì)胞膜穿透性(Heetal., 2013; Avilaetal., 2018)，同時(shí)在草地貪夜蛾Spodopterafrugiperda細(xì)胞系和二化螟Chilosuppressalis等害蟲中，部分高效納米載體還具有輔助dsRNA穿透胞內(nèi)運(yùn)輸屏障，顯著提升了dsRNA內(nèi)體逃逸效率(Wangetal., 2020)。但是，納米載體提高dsRNA跨膜運(yùn)輸能力的內(nèi)在機(jī)制尚不明確(Cooperetal., 2019)。本研究中，我們發(fā)現(xiàn)在3種代表性納米粒子中，脂質(zhì)體的增效能力最弱，這同在二化螟中研究結(jié)果相似，而這可能是由于脂質(zhì)體無法介導(dǎo)dsRNA完成內(nèi)體逃逸過程所致(Wojnilowiczetal., 2019)。這表明不同納米粒子的對(duì)于RNAi的增效機(jī)制存在明顯差異，具體機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

以dsRNA為基礎(chǔ)的核酸農(nóng)藥被認(rèn)為具有廣泛應(yīng)用的潛力。但是，稻飛虱等刺吸式口器害蟲的喂食RNAi敏感性普遍較弱，限制了這一技術(shù)的應(yīng)用，而唾液腺中核酸酶的快速降解可能是導(dǎo)致這一現(xiàn)象的關(guān)鍵 (Zottietal., 2018)。因此，可以提高喂食dsRNA在害蟲體內(nèi)的持續(xù)時(shí)間來增加害蟲防治效果：其一是如本文所述，通過納米粒子等遞送介質(zhì)的作用，保護(hù)dsRNA免受體內(nèi)核酸酶的降解；其二是利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將靶向害蟲的dsRNA在作物中進(jìn)行表達(dá)，以增加dsRNA的暴露時(shí)間，提高防治效果。同時(shí)，研究人員還發(fā)現(xiàn)dsRNA可能具有穿透蚜蟲體壁從而產(chǎn)生RNAi效果的能力，而特定多聚物具有提高dsRNA穿透蚜蟲表皮的能力(Zhengetal., 2019)。這些都表明在刺吸式害蟲中，dsRNA可能兼具胃毒和觸殺兩種作用模式，后續(xù)研究需要進(jìn)一步明確這兩種方式下的dsRNA作用機(jī)理，以便開發(fā)出針對(duì)該類害蟲的RNAi高效防治技術(shù)。

本研究發(fā)現(xiàn)，殼聚糖和CQD納米載體能夠顯著提高灰飛虱對(duì)于喂食dsRNA的敏感性，而脂質(zhì)體的RNAi增效作用較弱。研究結(jié)果有助于評(píng)價(jià)納米載體在灰飛虱RNAi中的增效作用，為進(jìn)一步開發(fā)和篩選有效的RNAi納米載體，實(shí)現(xiàn)害蟲綠色防控，提供理論依據(jù)和應(yīng)用策略。