沙蔥螢葉甲卵滯育的轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析

李艷艷, 馬紅悅, 李 玲, 譚 瑤, 龐保平,*, 張 恒

(1. 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)草原昆蟲研究中心, 呼和浩特010020; 2. 正鑲白旗草原工作站, 內(nèi)蒙古正鑲白旗013800)

滯育是昆蟲面對不良環(huán)境而維持種群延續(xù)的一種適應(yīng)性策略，其特征在于呼吸微弱、生殖器官發(fā)育緩慢、激素及代謝機(jī)制發(fā)生變化和抗逆性增強等(Kostál, 2006; Hahn and Denlinger, 2011)。滯育可發(fā)生于昆蟲任何發(fā)育階段，但對于某一種昆蟲滯育只發(fā)生于特定的發(fā)育階段。按滯育發(fā)生的發(fā)育階段可將滯育分為卵滯育、幼蟲滯育、蛹滯育和成蟲滯育。卵滯育又稱為胚胎滯育，廣泛發(fā)生于直翅目、半翅目、鱗翅目和雙翅目昆蟲中，但對于卵(胚胎)滯育的調(diào)控機(jī)理卻了解得很少(Denlingeretal., 2012)。滯育激素(diapause hormone, DH)在家蠶Bombyxmori胚胎滯育中起著重要的調(diào)控作用(Yamashitaetal., 2001)，兩個基因(cyclindependentkinase2和cdc-2relatedkinase)(Takahashietal., 1998)和ERK/MAPK信號通路(Fujiwaraetal., 2006)被認(rèn)為在其滯育解除過程中起著重要的作用，該通路也參與了葉甲Atrachyamenetriesi胚胎滯育的調(diào)控(Kidokoroetal., 2006b)。在某些昆蟲如舞毒蛾Lymantriadispar(Leeetal., 1997)、沙漠蝗Schistocercagregaria(Slama, 2000)和蟋蟀Allonemobiussocius(Reynolds and Hand, 2009) 中，蛻皮激素滴度上升誘導(dǎo)胚胎滯育，而對于澳洲疫蝗Chortoicetesterminifera(Greggetal., 1987)和飛蝗Locustamigratoria(Tawfketal., 2002)卻是蛻皮激素滴度下降誘導(dǎo)胚胎滯育，外用蛻皮激素促進(jìn)了飛蝗卵滯育的解除(Kidokoroetal., 2006a)。Hao等(2017)應(yīng)用轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白組學(xué)技術(shù)分析了飛蝗滯育卵和非滯育卵的差異基因和蛋白，結(jié)果發(fā)現(xiàn)昆蟲激素生物合成、胰島素和過氧化物酶體增殖物激活受體 (peroxisome proliferator-activated receptor, PPAR)信號通路可能在飛蝗卵滯育中起著重要的調(diào)控作用。保幼激素(juvenile hormone, JH)在昆蟲生長發(fā)育、變態(tài)及滯育過程中起著重要的調(diào)控作用(李勝等, 2004)。目前研究表明，JH缺乏是導(dǎo)致成蟲滯育的主要因素，而JH在卵滯育調(diào)節(jié)中作用卻很少了解(Denlingeretal., 2012)。施用JH類似物可促進(jìn)飛蝗和小翅稻蝗Oxyayezoensis卵滯育的解除，但胚胎發(fā)生、著色及骨化不正常(Kidokoroetal., 2006a)。

沙蔥螢葉甲Galerucadaurica是一種近年來在內(nèi)蒙古草原上猖獗成災(zāi)的新害蟲，發(fā)生范圍不斷擴(kuò)大，危害日趨嚴(yán)重，主要危害沙蔥Alliummongolium、多根蔥A.polyrhizum和野韭A.ramosum等百合科蔥屬植物，給草原畜牧業(yè)和草原生態(tài)系統(tǒng)造成嚴(yán)重威脅(昊翔等, 2015)。沙蔥螢葉甲為一化性專性滯育昆蟲，一年發(fā)生1代，以卵滯育越冬，越冬卵最早于4月中旬孵化，5月下旬至6月初成蟲羽化，取食約1周后，聚集于牛糞、石塊及草叢下滯育越夏，整個越夏期間幾乎不取食，約3個月后滯育解除，開始取食及產(chǎn)卵越冬，為昆蟲滯育研究提供了理想的模式材料(Zhouetal., 2016; 陳龍等, 2018b)。目前關(guān)于沙蔥螢葉甲滯育的研究主要集中于成蟲夏滯育不同階段生化物質(zhì)含量的變化(陳龍等, 2018b)、蛋白組學(xué)分析(Maetal., 2019)、miRNA分析(Duanetal., 2021)以及滯育相關(guān)基因的克隆及表達(dá)譜分析等(陳龍等, 2018a, 2019, 2020; 段天鳳等, 2020; 李爽等, 2020; 馬紅悅等, 2020； 李艷艷等, 2021)，而對卵滯育的研究卻很少。本實驗室前期研究表明，秋季沙蔥螢葉甲卵被產(chǎn)出后即進(jìn)入滯育，必須經(jīng)過秋末和冬季至少2個月低溫或5℃恒溫下處理1個月才能解除滯育(Zhouetal., 2016)。本研究對沙蔥螢葉甲滯育卵和解除滯育卵進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測序，挖掘了其差異表達(dá)基因，對差異表達(dá)基因進(jìn)行KEGG通路富集分析，揭示了與卵滯育相關(guān)的主要代謝及信號通路，為進(jìn)一步開展卵滯育相關(guān)基因的克隆、表達(dá)及功能研究奠定了必要的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

2019年9月20日從內(nèi)蒙古錫林郭勒盟鑲黃旗天然草原采集沙蔥螢葉甲卵，帶回實驗室后，部分卵用液氮迅速冷凍后置于-80℃下作為滯育卵(D)保存?zhèn)溆茫涣硪徊糠致阎糜?℃低溫培養(yǎng)箱中，2個月后取出用液氮迅速冷凍后置于-80℃下作為解除滯育卵(DT)保存?zhèn)溆?Zhouetal., 2016)。

1.2 cDNA文庫構(gòu)建和轉(zhuǎn)錄組測序

沙蔥螢葉甲滯育卵和解除滯育卵兩類卵的轉(zhuǎn)錄組測序工作由北京百邁客生物科技有限公司完成。每類卵轉(zhuǎn)錄組測序包括3個生物學(xué)重復(fù)，每個生物學(xué)重復(fù)約300粒卵，共構(gòu)建6個cDNA文庫。構(gòu)建好的文庫采用Illumina NovaSeq 6000高通量測序平臺進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，對測序獲得的原始數(shù)據(jù)(raw data)進(jìn)行過濾，去除接頭序列和低質(zhì)量read，最終獲得高質(zhì)量序列(clean read)，利用Trinity軟件對clean read進(jìn)行序列拼接與組裝，獲得unigene。

1.3 差異表達(dá)基因分析及注釋

采用DESeq軟件進(jìn)行沙蔥螢葉甲滯育卵和解除滯育卵樣品間的差異表達(dá)基因(differentially expressed genes, DEGs)分析，差異表達(dá)基因分析過程采用公認(rèn)有效的Benjamin-Hochbery方法對P值進(jìn)行校正，并采用最終校正后的P值，即FDR(false discovery rate)作為篩選差異表達(dá)基因的關(guān)鍵指標(biāo)，其中FDR<0.01且差異表達(dá)倍數(shù)(fold change, FC)>2作為差異表達(dá)基因的篩選標(biāo)準(zhǔn)，F(xiàn)C表示滯育卵與解除滯育卵樣品間基因表達(dá)量比值。采用BLAST軟件將差異表達(dá)基因序列與Nr, Swiss-Prot, GO, COG, KOG, eggNOG4.5和KEGG數(shù)據(jù)庫比對(E-value<1×10-5)，獲得相應(yīng)的注釋信息。使用ClusterProfiler進(jìn)行KEGG通路富集分析，以校正后P值(q)≤0.05為顯著富集的KEGG通路。

1.4 差異表達(dá)基因的驗證

隨機(jī)選取10個1.3節(jié)篩選出的差異表達(dá)基因，進(jìn)行qRT-PCR驗證，包括保幼激素酯酶(juvenile hormone esterase, JHE)、保幼激素誘導(dǎo)蛋白(juvenile hormone-inducible protein, JHIP)、保幼激素酸O-甲基轉(zhuǎn)移酶(juvenile hormone acid O-methyltransferase, JHAMT)、卵黃原蛋白受體(vitellogenin receptor, VgR)、海藻糖酶(trehalase, TRE)、熱激蛋白68(heat shock protein 68, HSP68)、脂肪酸合酶(fatty acid synthase, FAS)、生長激素誘導(dǎo)的跨膜蛋白(growth hormone-inducible transmembrane protein, GHITM)、己糖激酶2(hexokinase type 2, HK2)和類鈣粘蛋白(cadherin-like protein, CAD)基因。在FTC-3000實時熒光定量儀(Funglyn Biotech, 加拿大)上進(jìn)行qRT-PCR。使用Primer Premier 6.0設(shè)計目的基因的引物和內(nèi)參基因SDHA的引物序列(Tan Yetal., 2017)(表1)。所需引物由上海生工生物有限公司合成，以測序返回樣品為cDNA為模板。PCR反應(yīng)體系(20 μL): GoTaq?qPCR Master Mix 10 μL, cDNA模板2 μL, 正反向引物(10 μmol/L)各0.4 μL, ddH2O 7.2 μL。反應(yīng)程序: 95℃預(yù)變性2 min; 95℃變性20 s, 60℃退火1 min和72℃延伸30 s, 40個循環(huán)；溶解曲線: 95℃ 15 s, 65℃ 15 s, 95℃ 15 s。每類卵樣品設(shè)3個生物學(xué)重復(fù)，進(jìn)行4次技術(shù)重復(fù)，采用2-ΔΔCt方法計算相對表達(dá)量(Livak and Schmittgen, 2001)。

表1 引物信息Table 1 Primer information

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果

本研究對沙蔥螢葉甲滯育卵(3個樣本)和解除滯育卵(3個樣本)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，共獲得44.37 Gb的clean data，轉(zhuǎn)錄組原始數(shù)據(jù)已經(jīng)上傳至NCBI的SRA數(shù)據(jù)庫(登錄號: PRJNA675752; 各樣本序列登錄號: SRR13015776-SRR13015781)，各樣品clean data均達(dá)到6.84 Gb，G+C含量為37.26%～37.38%，各樣品的Q20堿基比例均為100%，Q30堿基比例不少于93.84%；共獲得53 389條unigene，平均長度為1 229.72131 bp，N50為2 059 bp，表明測序組裝結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可用于進(jìn)一步分析(表2)。

表2 沙蔥螢葉甲滯育和解除滯育卵轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫unigene數(shù)據(jù)統(tǒng)計Table 2 Summary for unigenes in the transcriptomesof diapause and diapause-terminated eggsof Galeruca daurica

2.2 差異表達(dá)基因及注釋

以解除滯育卵為對照，在滯育卵與解除滯育卵之轉(zhuǎn)錄組間共鑒定到2 145個差異表達(dá)基因(DEGs)，其中1 297個上調(diào)和848個下調(diào)。差異表達(dá)基因的注釋信息顯示，共有1 604(74.78%)個差異基因在至少一個數(shù)據(jù)庫中得到注釋信息。其中Nr數(shù)據(jù)庫中注釋到的DEGs數(shù)目最多為1 555個，占總DEGs的72.49%；eggNOG4.5數(shù)據(jù)庫注釋到1 403個(65.41%)；Pfam數(shù)據(jù)庫注釋到1 148個(53.52%)；KOG數(shù)據(jù)庫注釋到1 028個(47.93%)；Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫注釋到891個(41.54%)；KEGG數(shù)據(jù)庫注釋到727個(33.89%)，GO數(shù)據(jù)庫注釋到648個(30.21%)，COG數(shù)據(jù)庫注釋到533個(24.85%)。

2.3 差異表達(dá)基因的KEGG富集

差異表達(dá)基因的KEGG通路富集分析表明，上調(diào)的DEGs富集于124條通路，主要富集通路(P<0.05)有20條(圖1: A)，其中僅有核糖體(ribosome)通路顯著富集(q<0.05)。下調(diào)的差異表達(dá)基因富集于73條通路(圖1: B，僅顯示前20個富集通路)，主要富集通路(P<0.05)包括MAPK信號通路-果蠅(MAPK signaling pathway-fly)、糖胺聚糖生物合成-硫酸乙酰肝素/肝素(glycosaminoglycan biosynthesis-heparan sulfate/heparin)、凋亡-多物種(apoptosis-multiple species)、Hippo信號通路-果蠅(Hippo signaling pathway-fly)、細(xì)胞凋亡-果蠅(apoptosis-fly)、FOXO信號通路(FOXO signaling pathway)、過氧化物酶體(peroxisome)、糖胺聚糖生物合成-硫酸軟骨素/硫酸皮膚素(glycosaminoglycan biosynthesis-chondroitin sulfate/dermatan sulfate)和Hedgehog信號通路-果蠅(Hedgehog signaling pathway-fly)等，其中MAPK信號通路和糖胺聚糖生物合成通路顯著富集(q<0.05)。

圖1 沙蔥螢葉甲滯育卵與解除滯育卵轉(zhuǎn)錄組間上調(diào)(A)和下調(diào)(B)差異表達(dá)基因的KEGG通路富集分析Fig. 1 KEGG pathway enrichment analysis of the up-regulated (A) and down-regulated (B) differentially expressed genes (DEGs) in the transcriptomes between diapause eggs and diapause-terminated eggs of Galeruca daurica

KEGG富集分析還表明，17個差異表達(dá)基因富集于脂肪酸生物合成(fatty acid biosynthesis)和脂肪酸降解(fatty acid degradation)通路(表3)，7個差異表達(dá)基因與保幼激素信號相關(guān)(表4)。

表3 沙蔥螢葉甲滯育卵與解除滯育卵間轉(zhuǎn)錄組中與脂肪酸生物合成和降解相關(guān)的差異表達(dá)基因Table 3 Differentially expressed genes related to fatty acid biosynthesis and degradation in the transcriptomesof diapause eggs and diapause-terminated eggs of Galeruca daurica

表4 沙蔥螢葉甲滯育卵與解除滯育卵間轉(zhuǎn)錄組中與保幼激素信號相關(guān)的差異表達(dá)基因Table 4 Differentially expressed genes related to juvenile hormone signaling in the transcriptomes of diapause eggsand diapause-terminated eggs of Galeruca daurica

2.4 差異表達(dá)基因的驗證

根據(jù)轉(zhuǎn)錄組差異表達(dá)基因分析結(jié)果，隨機(jī)選取10個差異表達(dá)基因(JHE,JHAMT,VgR,HSP68,HK2,JHIP,FAS,CAD,TRE和GHITM)，利用qRT-PCR技術(shù)驗證其表達(dá)模式。結(jié)果表明，10個差異表達(dá)基因的qRT-PCR與RNA-Seq表達(dá)模式相一致(圖2)，說明轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)結(jié)果真實可靠，可用于進(jìn)一步研究。

圖2 沙蔥螢葉甲滯育卵與解除滯育卵轉(zhuǎn)錄組間差異表達(dá)基因RNA-seq測序數(shù)據(jù)的qRT-PCR驗證Fig. 2 Verification of RNA-Seq data of differentially expressed genes between the transcriptomes of diapause eggs and diapause-terminated eggs of Galeruca daurica by qRT-PCR

3 討論

本研究基于Illumina NovaSeq 6000高通量測序平臺對沙蔥螢葉甲滯育卵和解除滯育卵進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測序和分析，獲得了高質(zhì)量的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，為挖掘沙蔥螢葉甲卵滯育相關(guān)的基因及其信號和代謝通路提供了有力保障。在此基礎(chǔ)上，篩選出了大量具有重要生物學(xué)意義的差異基因及信號和代謝通路。

核糖體蛋白(ribosomal protein, Rp)是一類參與蛋白質(zhì)合成、信號傳導(dǎo)、細(xì)胞代謝、卵子發(fā)生等重要生理功能的蛋白質(zhì)(Goudarzi and Lindstr?m, 2016)。據(jù)報道，核糖體蛋白在滯育誘導(dǎo)相關(guān)的上游通路中發(fā)揮作用(Qietal., 2015)。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)RPS3,RPL10A,RPS17,RPS27a和RPS9等40個核糖體蛋白基因在沙蔥螢葉甲卵滯育中均顯著上調(diào)，僅有RPL26下調(diào)表達(dá)。KEGG富集分析也揭示了大量上調(diào)差異表達(dá)基因顯著富集于核糖體通路(圖1: A)。在短光周期誘導(dǎo)的飛蝗滯育卵的轉(zhuǎn)錄組中，發(fā)現(xiàn)一組核糖體蛋白基因顯著上調(diào)表達(dá)(Jarwaretal., 2019)。Hao等(2017)的轉(zhuǎn)錄組和蛋白組研究也表明，大量飛蝗滯育卵與非滯育卵的差異基因和蛋白富集于核糖體通路。因此，核糖體蛋白在昆蟲卵滯育中可能起著重要的調(diào)控作用。

脂質(zhì)積累通常發(fā)生在滯育前的準(zhǔn)備階段(滯育前期)，為昆蟲滯育(啟動，維持和終止)提供了重要的能量儲備(Liuetal., 2016; Tan QQetal., 2017)。除了在滯育前期積累脂質(zhì)外，儲備足夠的脂肪在滯育后期尤其重要，可能會影響滯育終止后昆蟲的發(fā)育、繁殖和適應(yīng)性(Hahn and Denlinger, 2011)。沙蔥螢葉甲滯育卵中，17個參與脂肪酸生物合成和降解通路的基因差異表達(dá)，其中16個上調(diào)表達(dá)，僅有脂肪酸合成酶基因下調(diào)表達(dá)(表3)。過氧化物酶具有顯著的代謝可塑性，其蛋白質(zhì)組成和生化功能隨生理條件和代謝的需要而變化。在沙蔥螢葉甲卵滯育期間，發(fā)現(xiàn)2個編碼脂肪?；o酶A還原酶(fatty acyl-CoA reductase, FAR)的基因表達(dá)上調(diào)。FAR在長鏈脂肪醇的形成中起作用(Yangetal., 2012)。脂肪醇是昆蟲蠟脂和醚脂的前體，蠟脂在減少水分蒸發(fā)和增強對微生物的防御方面發(fā)揮作用，而醚脂是重要的膜成分，具有許多不同的作用，包括保護(hù)活性氧、介導(dǎo)膜融合和建立細(xì)胞的結(jié)構(gòu)滲透屏障等(Cheng and Russell, 2004)。我們推測FAR在滯育卵中的大量表達(dá)有助于增強卵滯育期間的抗逆能力，如越冬期間的抗寒能力。酰基輔酶AΔ11去飽和酶[acyl-CoA Delta(11) desaturase, ACD]催化不飽和鍵引入長鏈脂肪酸中合成不飽和脂肪酸。我們推測2個編碼ACD的基因在沙蔥螢葉甲滯育卵中上調(diào)表達(dá)可導(dǎo)致不飽和脂肪酸增加，以滿足滯育期間能量的需求。JH是調(diào)節(jié)昆蟲生長發(fā)育的重要內(nèi)分泌激素。在本研究中，與JH信號相關(guān)的7個基因差異表達(dá)(表4)，其中，JHE,JHAMT及JHBP在卵滯育期間上調(diào)表達(dá)。JHAMT是JH合成過程中的關(guān)鍵酶，而JHBP在JH的運輸過程中起作用。因此，JHAMT和JHBP在沙蔥螢葉甲卵滯育期間上調(diào)表達(dá)增加了JH滴度，有助于維持卵的滯育狀態(tài)，而JHAMT和JHBP的下調(diào)表達(dá)降低了JH滴度，從而誘導(dǎo)了卵滯育的解除。其他研究者也獲得了類似的結(jié)果(Haoetal., 2017)。

保幼激素誘導(dǎo)蛋白(JHIP)在保幼激素信號傳導(dǎo)中的功能研究還未見報道，僅推測可能作為蛋白激酶C(protein kinase C, PKC)信號通路的媒介分子，介導(dǎo)JH在昆蟲中的作用(賀華良等, 2012)。在沙蔥螢葉甲卵滯育解除后，JHIP上調(diào)表達(dá)，可能有利于促進(jìn)卵的發(fā)育。生長激素誘導(dǎo)跨膜蛋白(GHITM)是在進(jìn)化上高度保守的一類跨膜蛋白, 參與機(jī)體生長發(fā)育、生長激素誘導(dǎo)、老化及先天免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)(Yoshidaetal., 2006)。GHITM在沙蔥螢葉甲卵滯育解除后上調(diào)表達(dá)，可能促進(jìn)了沙蔥螢葉甲卵的生長發(fā)育、提高了天然免疫防御能力。

細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)在調(diào)節(jié)昆蟲滯育的發(fā)生和維持中起著重要作用。MAPK信號通路廣泛存在于生物體細(xì)胞內(nèi)，在昆蟲的生長發(fā)育及免疫方面至關(guān)重要，包括調(diào)節(jié)細(xì)胞分裂、細(xì)胞分化、代謝與凋亡和細(xì)胞免疫等(Johnson and Lapadat, 2002; Cargnello and Roux, 2011)。Hippo信號通路通過調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖與凋亡控制器官的大小，并且參與表皮發(fā)育及組織再生(Pan, 2010; Yu and Guan, 2013)。FOXO信號通路與滯育表型的特征有關(guān)，包括生長發(fā)育、壽命延長、代謝調(diào)控以及應(yīng)激耐受性等(MacRae, 2010; Melleretal., 2012)。在家蠶胚胎滯育中，發(fā)現(xiàn)Hippo信號通路和FOXO信號通路在滯育中發(fā)揮重要作用(Chenetal., 2017)。在飛蝗母體對卵滯育影響研究中，發(fā)現(xiàn)FOXO信號通路能夠刺激母體進(jìn)而調(diào)控下一代卵滯育的發(fā)生(Haoetal., 2019)。Hao等(2017)研究表明，昆蟲激素合成、胰島素和PPAR信號通路可能在飛蝗卵滯育調(diào)控中起著重要作用。在本研究中，大量下調(diào)差異表達(dá)基因顯著富集于MAPK信號通路、糖胺聚糖生物合成通路和核糖體通路(圖1: B)，這些通路可能在沙蔥螢葉甲卵滯育中起著重要的調(diào)控作用。分析造成差異的原因，可能是因為飛蝗卵滯育為兼性滯育(Haoetal., 2017)，沙蔥螢葉甲卵滯育為專性滯育(Zhouetal., 2016)，而不同類型的滯育可能具有不同的調(diào)控機(jī)制。

本研究通過對沙蔥螢葉甲滯育卵與解除滯育卵轉(zhuǎn)錄組的比較分析，揭示了與其卵滯育有潛在關(guān)聯(lián)的基因和信號通路，為今后進(jìn)一步研究主要關(guān)聯(lián)基因及信號通路的功能以闡明沙蔥螢葉甲卵滯育機(jī)理奠定了必要的基礎(chǔ)。