RNAi沉默王漿主蛋白1(Mrjp1)基因?qū)σ獯罄鄯涔し鋵W(xué)習(xí)和記憶的影響

蔚添添, 邱園妹, 候夢(mèng)賞, 王天寶, 蘇松坤, 李志國(guó)

(福建農(nóng)林大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院(蜂學(xué)學(xué)院)，福州 350002)

蜜蜂作為典型的社會(huì)性昆蟲，擁有與其他昆蟲類似且相對(duì)簡(jiǎn)單的神經(jīng)系統(tǒng)以及數(shù)量較少的神經(jīng)元(Pahletal., 2010)。蜜蜂腦體積雖小卻擁有強(qiáng)大認(rèn)知能力，因此成為多種研究領(lǐng)域的模式昆蟲。蜜蜂工蜂存在依賴于日齡的勞動(dòng)分工，工蜂在低日齡時(shí)主要從事一些巢內(nèi)的工作，達(dá)到一定日齡時(shí)轉(zhuǎn)而擔(dān)任外界的采集任務(wù)(Johnson, 2010)，這種劇烈的內(nèi)外環(huán)境變化以及職能的轉(zhuǎn)變，導(dǎo)致不同日齡的工蜂感官能力不同，從而呈現(xiàn)出不同水平的認(rèn)知能力(Groh and R?ssler, 2020)。認(rèn)知能力是蜜蜂等社會(huì)性昆蟲在野外賴以生存的基本能力，例如采集蜂依靠空間認(rèn)知來(lái)尋找蜜源(Zhangetal., 2000)，通過(guò)氣味學(xué)習(xí)來(lái)識(shí)別花的氣味(Pahletal., 2010)，以及聯(lián)想記憶來(lái)記住花的顏色或形狀(Bittermanetal., 1983; Horietal., 2006)等，甚至巢內(nèi)的蜂群正常秩序也必須依靠蜜蜂識(shí)別各種調(diào)節(jié)信息素來(lái)維持(Kucharskietal., 1998)。在蜜蜂認(rèn)知能力中，基于伸吻反應(yīng)(proboscis extension response, PER)的蜜蜂嗅覺(jué)學(xué)習(xí)，已被廣泛應(yīng)用于研究與蜜蜂學(xué)習(xí)相關(guān)的神經(jīng)生理機(jī)制及研究生物和非生物因子脅迫對(duì)蜜蜂嗅覺(jué)學(xué)習(xí)的影響(Laloietal., 2001; Matsumotoetal., 2012; Wuetal., 2017)。

蜂王漿是蜂王和蜜蜂幼蟲的主要食物，分為水溶性蛋白和非水溶性蛋白(Simúth, 2001)。蜂王漿由蜜蜂工蜂咽下腺與上顎腺所分泌，具有抗高血壓，抗感染和抗氧化作用(Kimuraetal., 1996; Watanabeetal., 1998)。蜂王漿的主要營(yíng)養(yǎng)成分為王漿主蛋白(major royal jelly proteins, MRJPs)，MRJPs家族目前為止有9個(gè)成員(MRJP1～MRJP9)。MRJPs是多功能蛋白，主要參與蜜蜂生理、發(fā)育和行為等的調(diào)控(Buttstedt,etal., 2014)。研究顯示，蜂王漿可提高人體U-937細(xì)胞(Watanabeetal., 1998)和小鼠肝細(xì)胞的增殖速率，也可促進(jìn)小鼠肝細(xì)胞DNA的合成(Kamakuraetal., 2001)。隨后，Majtan等(2010)證明MRJP1可以促進(jìn)角質(zhì)細(xì)胞的增殖，表明MRJP1可能是王漿中促進(jìn)細(xì)胞增殖的主要作用因子。蜂王漿是促進(jìn)幼蟲發(fā)育成蜂王的主要食物，其中王漿中的MRJP1被證明是幼蟲發(fā)育成蜂王的關(guān)鍵調(diào)控因子(Kamakura, 2011)。王漿主蛋白1(major royal jelly protein 1, MRJP1)占蜂王漿水溶性蛋白含量的48%(Srisuparbhetal., 2003)，是蜂王漿的主要蛋白組分。研究表明，MRJP1在蜜蜂體內(nèi)分布廣泛，除在哺育蜂和外勤蜂的咽下腺中大量表達(dá)之外，在雄蜂和蜂王體內(nèi)也檢測(cè)到Mrjp1基因表達(dá)(Drapeauetal., 2006; Huangetal., 2012)。 同時(shí)，MRJP1也在蜜蜂腦細(xì)胞間隙中表達(dá)，說(shuō)明MRJP1很可能以一種分泌蛋白的形式存在(Lietal., 2019)。MRJP1在蜜蜂腦部可能作為蛋白質(zhì)合成的儲(chǔ)備氨基酸，在哺育蜂向采集蜂發(fā)育過(guò)程和行為轉(zhuǎn)變過(guò)程中合成王漿主蛋白發(fā)揮作用(Tamuraetal., 2009)。隨著對(duì)MRJP1的深入研究發(fā)現(xiàn)，MRJP1除了具有豐富的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值外，還具有多種生物學(xué)功能和保健功效(Tamuraetal., 2009)，并可能參與調(diào)控蜜蜂行為。有研究表明，脫離蜂群飼養(yǎng)的蜜蜂學(xué)習(xí)能力低于蜂群中蜜蜂學(xué)習(xí)能力，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)脫離蜂群飼養(yǎng)的蜜蜂體內(nèi)Mrjp1表達(dá)降低(Lietal., 2019)。同時(shí)，前人研究發(fā)現(xiàn)MRJP1也在蜜蜂腦部的蘑菇體中高表達(dá)，蘑菇體正是涉及蜜蜂學(xué)習(xí)與記憶的神經(jīng)中樞(Kucharskietal., 1998)。受吡蟲啉脅迫蜜蜂的嗅覺(jué)學(xué)習(xí)能力下降，同時(shí)，其大腦中的Mrjp1表達(dá)顯著下調(diào)(Desneuxetal., 2007; Lietal., 2019)。

目前關(guān)于MRJP1在蜜蜂中的功能與作用研究已有一定進(jìn)展，但是關(guān)于MRJP1表達(dá)在蜜蜂學(xué)習(xí)與記憶過(guò)程中起到的確切作用的研究卻鮮有報(bào)道。利用RNA干擾(RNA interference, RNAi)技術(shù)將Mrjp1基因表達(dá)沉默后，研究Mrjp1基因表達(dá)與蜜蜂嗅覺(jué)學(xué)習(xí)之間的關(guān)系，進(jìn)一步挖掘和驗(yàn)證MRJP1的潛在生物學(xué)功能，為蜜蜂學(xué)習(xí)的分子機(jī)制提供佐證。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試意大利蜜蜂Apismelliferaligustica(簡(jiǎn)稱“意蜂”)取自福建農(nóng)林大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院(蜂學(xué)學(xué)院)實(shí)驗(yàn)蜂場(chǎng)。從蜂場(chǎng)4個(gè)不同蜂群分別取出1張健康封蓋子脾，放入4個(gè)限王產(chǎn)卵器中，在恒溫恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(溫度34±1℃，相對(duì)濕度40%±10%，黑暗)，每天用不同顏色的油漆筆對(duì)剛出房的蜜蜂工蜂胸部進(jìn)行標(biāo)記，連續(xù)標(biāo)記4 d。標(biāo)記后的蜜蜂放入蜂群中，待蜜蜂達(dá)到12日齡時(shí)從蜂群中取出，用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.2 蜜蜂腦部總RNA提取

對(duì)3頭蜜蜂樣本進(jìn)行解剖，獲得完整、干凈的腦。將3個(gè)腦置于1.5 mL離心管中，加入700 μL的Trizol試劑和兩顆磁珠，于組織破碎儀中震蕩研磨；研磨后繼續(xù)加入300 μL的Trizol試劑，室溫靜置10 min；加入200 μL氯仿，于旋渦振蕩器劇烈振蕩數(shù)十秒，使兩相徹底混勻，室溫靜置3 min后，4℃ 12 000 g離心15 min；將上清液轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管，加入500 μL異丙醇，室溫靜置10 min后，4℃ 12 000 g離心10 min，棄上清；加入1 mL預(yù)冷75%乙醇[無(wú)水乙醇∶DEPC=3∶1(v/v)配制]，輕彈懸浮沉淀，上下顛倒充分洗滌，4℃ 7 400 g離心5 min，棄上清，重復(fù)洗滌兩次；將離心管置于超凈工作臺(tái)中風(fēng)干10 min，干燥沉淀；加入30 μL RNA溶解水，反復(fù)吸打幾次，55℃金屬浴中加熱5 min。利用NanoDrop 2000核酸濃度測(cè)定儀測(cè)定RNA的質(zhì)量和濃度。OD260/OD280值在1.9～2.1之間的RNA為合格，并用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA降解程度，置于-80℃保存。

1.3 RNA反轉(zhuǎn)錄為 cDNA

首先使用 TaKaRa PrimeScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser 試劑盒去除RNA中的基因組 DNA，按照說(shuō)明書在冰上配制反應(yīng)混合液，反應(yīng)體系: 5×gDNA Eraser Buffer 2 μL, gDNA Eraser 1 μL, 用移液槍吸取3 μL, RNA 1 μg, 最后加入RNase-Free dH2O將反應(yīng)體系補(bǔ)足至10 μL。42℃反應(yīng)2 min。隨后往上述反應(yīng)體系繼續(xù)加入PrimeScript RT Enzyme Mix Ⅰ 1 μL, RT Primer Mix 1 μL, 5×PrimeScript BufferⅡ 4 μL和 RNase-Free dH2O 4 μL混合均勻。37℃反應(yīng)15 min，85℃反應(yīng)5 s 后4℃保存。

1.4 基因引物設(shè)計(jì)和擴(kuò)增

通過(guò)NCBI確定Mrjp1基因的CDS區(qū)域，利用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)擴(kuò)增該基因引物，經(jīng)RT-PCR(reverse transcription PCR, RT-PCR)擴(kuò)增，獲得基因序列長(zhǎng)度為654 bp。增強(qiáng)綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescent protein, EGFP)基因與蜜蜂無(wú)同源基因，作為對(duì)照基因，擴(kuò)增出的基因序列長(zhǎng)度為720 bp，序列片段位于6 895-7 614 bp。引物序列信息見(jiàn)表1。

1.5 dsRNA合成與純化

將cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)產(chǎn)物使用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)分離，隨后通過(guò)Wizard DNA Clean-up System (Promega)試劑盒切膠回收純化后，將擴(kuò)增的Mrjp1基因片段克隆到質(zhì)粒載體pEASY-T3中，并根據(jù)試劑盒說(shuō)明書將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞中。通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳分析和測(cè)序篩選出攜帶含有Mrjp1基因片段的重組質(zhì)粒的陽(yáng)性克隆。 根據(jù)說(shuō)明書使用T7 RiboMAXTMExpress RNAi試劑盒(Promega)將含有Mrjp1的重組質(zhì)粒和T7啟動(dòng)子標(biāo)簽的Mrjp1引物用于Mrjp1 dsRNA合成。使用相同的方法，使用pGFP載體和T7啟動(dòng)子標(biāo)簽的EGFP引物合成EGFPdsRNA。相關(guān)引物序列信息見(jiàn)表1。合成后純化dsRNA：沉淀dsRNA，向離心管中按照dsRNA∶NaAC=10∶1(v/v)添加4 μL 3 mol/L NaAC(pH 5.2)，按照dsRNA∶異丙醇=1∶1的比例(v/v)添加40 μL異丙醇，混合均勻后在冰上放置5 min，在NaAc和異丙醇沉淀作用下出現(xiàn)混濁；清洗沉淀，微型離心機(jī)高速旋轉(zhuǎn)10 min，在離心管底部可見(jiàn)白色沉淀，棄上清，向離心管中加入0.5 mL冰浴過(guò)的70%乙醇，13 000 g離心5 min，此步驟重復(fù)兩遍；干燥，在通風(fēng)櫥中室溫干燥15 min，除掉殘余的乙醇；溶解，將RNA沉淀重新懸浮在Nuclease-Free Water中。用1%瓊脂糖凝膠檢查dsRNA的完整性，然后用Nuclease-Free Water進(jìn)一步稀釋以獲得最終濃度5 μg/μL，-80℃儲(chǔ)存用于后續(xù)注射實(shí)驗(yàn)。

1.6 RNAi干擾時(shí)效檢測(cè)

抓取12日齡意蜂工蜂，將蜜蜂單獨(dú)裝入小瓶中于冰上麻醉，待蜜蜂一動(dòng)不動(dòng)后取出進(jìn)行注射。利用拉針儀處理后的毛細(xì)管吸取2 μL dsRNA(5 μg/μL)從蜜蜂的第4-5腹節(jié)節(jié)間膜注入蜜蜂血淋巴中，若被注射蜜蜂有血淋巴滲出，則丟棄該蜜蜂。對(duì)照組dsEGFP和處理組dsMrjp1分別注射60頭蜜蜂，分別在24 h和48 h后液氮凍斃取樣，之后進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)對(duì)照組和處理組在兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)的Mrjp1相對(duì)表達(dá)量，確定注射時(shí)效。反應(yīng)體系: 2×SYBR Premix Ex Taq Ⅱ 5 μL, PCR Primer(F+R)(10 μmol/L) 0.8 μL, cDNA 1 μL, RNase-Free dH2O 3.2 μL(引物信息見(jiàn)表1)。qRT-PCR程序: 95℃ 30 s; 95℃ 5 s, 60℃ 30 s, 40個(gè)循環(huán);添加熔解曲線： 65℃ 5 s, 95℃ 0.5 s。

1.7 dsRNA的注射

dsEGFP和dsMrjp1抓取12日齡工蜂，每25頭為一組，處理組與對(duì)照組各設(shè)置3組重復(fù)。處理組注射dsMrjp1，對(duì)照組注射dsEGFP。將蜜蜂于冰上麻醉，待蜜蜂冷凍麻醉后進(jìn)行注射。利用拉針儀處理后的毛細(xì)管吸取2 μL dsRNA(5 μg/μL)從蜜蜂腹部背面第4-5腹節(jié)節(jié)間膜注入蜜蜂體內(nèi)，若被注射蜜蜂有血淋巴滲出，則丟棄該蜜蜂。注射完成后，在恒溫恒濕培養(yǎng)箱中(溫度30±1℃，相對(duì)濕度40%±10%，黑暗)飼養(yǎng)48 h后做氣味聯(lián)想性學(xué)習(xí)實(shí)驗(yàn)。

1.8 聯(lián)想性學(xué)習(xí)實(shí)驗(yàn)

1.8.1固定蜜蜂：將蜜蜂置于特制的固定裝置前，單頭意蜂工蜂轉(zhuǎn)移至小玻璃瓶中，并冰上冷凍麻醉。待蜜蜂凍暈后立即取出，將蜜蜂固定于特制銅管，只留其頭部在管外，保證吻部能自由活動(dòng)。為了減小冷凍和飽食對(duì)蜜蜂行為的影響，將固定好的蜜蜂重新放入恒溫恒濕培養(yǎng)箱(溫度30±1℃，相對(duì)濕度40%±10%，黑暗)中2 h。

1.8.2氣味聯(lián)想性學(xué)習(xí)：參考Bitterman等(1983)描述的方法對(duì)意蜂進(jìn)行氣味聯(lián)想性學(xué)習(xí)實(shí)驗(yàn)。選擇對(duì)50%(w/v)蔗糖溶液有伸吻反應(yīng)的意蜂工蜂作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中呈現(xiàn)1-壬醇和己醇兩種不同的氣味，1-壬醇(條件刺激，CS)與糖水獎(jiǎng)勵(lì)(非條件刺激，US)配對(duì)訓(xùn)練(CS+)，己醇作為對(duì)照氣味，不與糖水獎(jiǎng)勵(lì)相配對(duì)(CS-)，按照ABABBABAAB順序?qū)γ款^蜜蜂分別進(jìn)行5次聯(lián)想性學(xué)習(xí)和非聯(lián)想性學(xué)習(xí)。首先將蜜蜂置于空氣流中適應(yīng)15 s，單獨(dú)通入1-壬醇3 s，用50%(w/v)糖水觸碰蜜蜂觸角引發(fā)PER行為；與1-壬醇聯(lián)想訓(xùn)練1 s后，撤掉1-壬醇，獎(jiǎng)勵(lì)蜜蜂50%(w/v)糖水2 s，最后蜜蜂處于空氣流中20 s，視為一次氣味聯(lián)想性學(xué)習(xí)。而非聯(lián)想性學(xué)習(xí)則只提供己醇，蜜蜂不進(jìn)行氣味與糖水獎(jiǎng)勵(lì)配對(duì)訓(xùn)練。每頭蜜蜂進(jìn)行兩種學(xué)習(xí)試驗(yàn)間隔為10 min。在單獨(dú)通入1-壬醇或己醇的2 s時(shí)間內(nèi)觀察蜜蜂是否有伸吻反應(yīng)，有PER行為的記為“+”，無(wú)PER行為的記為“-”，5次聯(lián)想性學(xué)習(xí)分別為C1-C5。5次學(xué)習(xí)后的蜜蜂立即用液氮凍斃，蜜蜂樣本儲(chǔ)存在-80℃用于下一步分析。

1.8.32 h記憶測(cè)試：意蜂工蜂5次學(xué)習(xí)完成后放入恒溫恒濕培養(yǎng)箱(溫度30±1℃，相對(duì)濕度40%±10%，黑暗)中，2 h后測(cè)定蜜蜂記憶。記憶測(cè)試單獨(dú)用1-壬醇?xì)馕秾?duì)每頭蜜蜂進(jìn)行刺激，記錄伸吻狀況。若對(duì)1-壬醇?xì)馕洞碳け憩F(xiàn)出伸吻反應(yīng)，表明該蜜蜂對(duì)1-壬醇?xì)馕侗憩F(xiàn)出記憶，記為“+”;若對(duì)1-壬醇?xì)馕洞碳の幢憩F(xiàn)出伸吻反應(yīng)，表明該蜜蜂對(duì)1-壬醇?xì)馕段幢憩F(xiàn)出記憶，記為“-”。2 h記憶測(cè)試完成后的蜜蜂立即用液氮凍斃，蜜蜂樣本儲(chǔ)存在-80℃用于下一步分析。

1.9 RT-qPCR驗(yàn)證

隨機(jī)抽取2 h記憶測(cè)試后的 dsEGFP組和dsMrjp1組樣本cDNA各5個(gè)，利用SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ(TaKaRa)熒光定量PCR試劑盒檢測(cè)樣本腦部Mrjp1基因的相對(duì)表達(dá)量，內(nèi)參基因?yàn)閍ctin和rp49。反應(yīng)體系: 2×SYBR Premix Ex Taq Ⅱ 5 μL, PCR Primer(F+R)(10 μmol/L) 0.8 μL, cDNA 1 μL(在初始cDNA基礎(chǔ)上以1∶3稀釋), RNase-Free dH2O 3.2 μL(引物信息見(jiàn)表1)。程序: 95℃ 30 s; 95℃ 5 s, 60℃ 30 s, 40個(gè)循環(huán);添加熔解曲線： 65℃ 5 s， 95℃ 0.5 s。

1.10 數(shù)據(jù)分析

利用SPSS19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。記錄對(duì)照組和處理組蜜蜂在配對(duì)訓(xùn)練(CS+)與非配對(duì)訓(xùn)練(CS-)中伸吻數(shù)量，通過(guò)卡方檢驗(yàn)分析處理組與對(duì)照組蜜蜂聯(lián)想性學(xué)習(xí)與記憶差異。RT-qPCR驗(yàn)證時(shí)選擇actin和rp49作為內(nèi)參基因，利用兩者的幾何平均值歸一目標(biāo)基因的Ct值(Louren?oetal., 2008; Villar and Grozinger, 2017)，計(jì)算△Ct(測(cè)試樣本)=Ct(目標(biāo))-Ct(內(nèi)參)，△Ct(校準(zhǔn)樣本)=Ct(校準(zhǔn))-Ct(內(nèi)參)；用校準(zhǔn)樣本的△Ct 歸一測(cè)試樣本的△Ct值，即△△Ct=△Ct(測(cè)試樣本)-△Ct(校準(zhǔn)樣本)，相對(duì)表達(dá)量=2-△△Ct。利用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析對(duì)照組與處理組之間基因相對(duì)表達(dá)量差異顯著性。

2 結(jié)果

2.1 dsRNA干擾時(shí)效

通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)24 h和48 h兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)的沉默效果。結(jié)果顯示,注射24 h后dsMrjp1的干擾效果不明顯，注射48 h后dsMrjp1在蜜蜂體內(nèi)發(fā)揮作用，與dsEGFP注射組相比，dsMrjp1注射組的Mrjp1相對(duì)表達(dá)量顯著下調(diào)(圖1)。因此，選擇注射后48 h作為dsMrjp1干擾效果最明顯的時(shí)間點(diǎn)并進(jìn)行后續(xù)行為實(shí)驗(yàn)。

圖1 意大利蜜蜂工蜂體內(nèi)dsMrjp1的RNA干擾時(shí)效Fig. 1 Efficiency of RNA interference with dsMrjp1 in Apis mellifera ligustica workers over time柱上雙星號(hào)表示在同一處理時(shí)間點(diǎn)dsMrjp1注射組與dsEGFP注射組(CK)間Mrjp1的相對(duì)表達(dá)量經(jīng)獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)差異極顯著(P<0.01)。Double asterisk above bar indicates extremely significant difference in the relative expression level of Mrjp1 between the dsMrjp1-injected group and the dsEGFP-injected group (CK) at the same treatment time point by independent samples t-test (P<0.01).

2.2 RNAi沉默Mrjp1對(duì)蜜蜂氣味學(xué)習(xí)的影響

將蜂群中取出的12日齡蜜蜂注射dsEGFP(對(duì)照組)和dsMrjp1(處理組)，48 h后檢測(cè)蜜蜂學(xué)習(xí)能力，在5次聯(lián)想性學(xué)習(xí)訓(xùn)練后，結(jié)果如圖2所示。對(duì)照組和處理組蜜蜂在5次配對(duì)訓(xùn)練(CS+)中，從第2次訓(xùn)練開(kāi)始，對(duì)照組蜜蜂的學(xué)習(xí)能力優(yōu)于dsMrjp1組蜜蜂，隨訓(xùn)練次數(shù)的增加，兩組蜜蜂的學(xué)習(xí)能力差異增大。在第3-5次訓(xùn)練(C3-C5)中，對(duì)照組(n=69)伸吻反應(yīng)率為67%～70%，處理組(n=79)伸吻反應(yīng)率為48%～50%，兩組學(xué)習(xí)結(jié)果存在顯著性差異(C3: χ2=4.441,P<0.05; C4: χ2=5.369,P<0.05; C5: χ2=5.244,P<0.05)。結(jié)果表明RNAi沉默Mrjp1對(duì)蜜蜂學(xué)習(xí)產(chǎn)生抑制影響。

圖2 注射48 h后dsMrjp1對(duì)意大利蜜蜂工蜂學(xué)習(xí)的影響Fig. 2 Effects of dsMrjp1 on learning in Apis melliferaligustica workers at 48 h after injection星號(hào)表示在第3-5次學(xué)習(xí)實(shí)驗(yàn)中dsMrjp1注射組與dsEGFP注射組(CK)喙伸反應(yīng)率經(jīng)χ2檢驗(yàn)差異顯著(P<0.05)。Single asterisk indicates that the proboscis extension response rates from the 3rd to the 5th learning experiments are significantly different by χ2 test between the dsMrjp1-injected group and the dsEGFP-injected group (CK).

2.3 RNAi沉默Mrjp1對(duì)蜜蜂記憶的影響

RNAi沉默Mrjp1對(duì)蜜蜂記憶的影響結(jié)果如圖3所示，學(xué)習(xí)2 h后，dsMrjp1注射組蜜蜂對(duì)條件刺激(1-壬醇?xì)馕?的伸吻反應(yīng)率比dsEGFP注射組略低。dsMrjp1注射組(n=66)記憶比率為55%，dsEGFP注射組(n=59)記憶比率為66%，dsMrjp1注射組2 h記憶結(jié)果低于dsEGFP注射組，但兩者之間差異不顯著(χ2=0.758,P>0.05)，即RNAi沉默Mrjp1對(duì)蜜蜂記憶沒(méi)有顯著抑制影響。

圖3 注射dsMrjp1和dsEGFP 48 h后意大利蜜蜂工蜂2 h記憶的比較Fig. 3 Comparison of 2 h memory in Apis mellifera ligusticaworkers at 48 h after injection with dsMrjp1 and dsEGFP

2.4 RT-qPCR驗(yàn)證蜜蜂腦部Mrjp1基因的表達(dá)水平

將學(xué)習(xí)后的蜜蜂液氮凍斃后，對(duì)其腦中Mrjp1基因表達(dá)進(jìn)行定量分析，結(jié)果如圖4。結(jié)果表明dsEGFP注射組中Mrjp1基因的相對(duì)表達(dá)量顯著性高于dsMrjp1注射組中Mrjp1基因相對(duì)表達(dá)量(P<0.05)，進(jìn)一步證明通過(guò)向蜜蜂體內(nèi)注射dsMrjp1后，成功抑制了Mrjp1基因的表達(dá)，降低了Mrjp1基因在蜜蜂腦中的相對(duì)表達(dá)量，從而抑制蜜蜂學(xué)習(xí)。

圖4 注射dsMrjp1和dsEGFP 48 h后學(xué)習(xí)2 h的意大利蜜蜂工蜂腦中Mrjp1相對(duì)表達(dá)量Fig. 4 Relative expression levels of Mrjp1 in brains ofApis mellifera ligustica workers learning for 2 h at 48 h after injection with dsMrjp1 and dsEGFP柱上星號(hào)表示Mrjp1的相對(duì)表達(dá)量在dsEGFP注射組(CK)和dsMrjp1注射組間經(jīng)獨(dú)立性t檢驗(yàn)有顯著性差異(P<0.05)。Single asterisk above bar indicates significant difference in the relative expression level of Mrjp1 between the dsMrjp1-injected group and the dsEGFP-injected group (CK) by independent samples t-test (P<0.05).

3 討論

研究表明蜂王漿可影響大鼠的認(rèn)知行為，其空間記憶力可通過(guò)口服蜂王漿得到改善(Pyrzanowskaetal., 2014)，但是尚未揭示其主要活性成分。另外，有研究發(fā)現(xiàn)脫離蜂群飼養(yǎng)的蜜蜂學(xué)習(xí)能力下降，其蘑菇體內(nèi)的Mrjp1表達(dá)水平也顯著下調(diào)(Hojoetal., 2010)。這些研究表明，MRJP1除了具有營(yíng)養(yǎng)功能以外，與蜜蜂認(rèn)知行為也存在一定的聯(lián)系。前期研究發(fā)現(xiàn)，吡蟲啉處理后的蜜蜂頭部Mrjp1和Mrjp4基因表達(dá)受到抑制(Wuetal., 2017)，氣味學(xué)習(xí)能力較弱，蜜蜂腦部表現(xiàn)出較低的Mrjp1基因表達(dá)水平(Hojoetal., 2010)。本研究利用RNAi技術(shù)沉默Mrjp1基因后，發(fā)現(xiàn)蜜蜂嗅覺(jué)學(xué)習(xí)能力受損，記憶力則沒(méi)有受到影響(圖3)。蜜蜂的學(xué)習(xí)機(jī)制復(fù)雜，可能受到多個(gè)基因聯(lián)合調(diào)控，僅沉默Mrjp1只是降低蜜蜂學(xué)習(xí)能力(圖2)，即處理組蜜蜂需要接受更多次數(shù)的訓(xùn)練才能達(dá)到與對(duì)照組相同學(xué)習(xí)結(jié)果。RNAi后兩組蜜蜂的2 h記憶無(wú)顯著差異(圖3)，這可能是由于基于RNAi的蜜蜂體內(nèi)的Mrjp1干擾效果具有時(shí)效性。此外，本研究通過(guò)RNAi技術(shù)沉默Mrjp1，結(jié)果表明蜜蜂腦部Mrjp1表達(dá)下調(diào)后(圖4)，蜜蜂的嗅覺(jué)學(xué)習(xí)能力顯著下降(圖2)，進(jìn)一步證明MRJP1參與調(diào)控蜜蜂嗅覺(jué)學(xué)習(xí)過(guò)程。

MRJP1是王漿主蛋白中豐度最高的可溶性蛋白，在蜜蜂腦部不同區(qū)域均有不同程度的表達(dá)，其中在中間神經(jīng)元的纖維和細(xì)胞周區(qū)域的表達(dá)豐度比其他區(qū)域更高(Peixotoetal., 2009)，因此推測(cè)MRJP1可能參與了蜜蜂神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育。此外，蜜蜂在腦部蘑菇體中高表達(dá)，其表達(dá)水平隨著蜜蜂年齡的變化而變化(Kucharski and Maleszka, 1998)。蜜蜂蘑菇體的主要感覺(jué)輸入?yún)^(qū)(花萼)較大，主要接受嗅覺(jué)和視覺(jué)感官的輸入(Giurfa, 2013; Groh and R?ssler, 2020)。蜜蜂的嗅覺(jué)聯(lián)想性學(xué)習(xí)主要是通過(guò)整合蘑菇體中的感官信息建立的(Menzel, 1999; Giurfa, 2007)。研究表明，蜜蜂在職能轉(zhuǎn)變的過(guò)程中，其蘑菇體結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著的變化(Schulz and Robinson, 1999)。這種結(jié)構(gòu)的變化同時(shí)伴隨著MRJP1表達(dá)水平的變化，表明MRJP1可能參與調(diào)控蘑菇體的發(fā)育。蘑菇體是由密集排列的平行神經(jīng)元組成，這些神經(jīng)細(xì)胞構(gòu)成了處理蜜蜂大腦中信息和記憶的大腦中心，稱為Kenyon細(xì)胞(Peixotoetal., 2009)。蜜蜂腦部大約有368 000個(gè)Kenyon細(xì)胞，占腦神經(jīng)元總數(shù)的40%以上(Strausfeld, 2002)。MRJP1可在Kenyon細(xì)胞內(nèi)特定表達(dá)，但是其具體功能尚不清楚(Kucharski and Maleszka, 1998)。此外，蜜蜂在嗅覺(jué)學(xué)習(xí)過(guò)程中會(huì)涉及大腦的特定區(qū)域(Farooquietal., 2003)，還需要進(jìn)一步的研究來(lái)確定在蜜蜂嗅覺(jué)學(xué)習(xí)時(shí)MRJP1在腦部的高表達(dá)區(qū)域，從而進(jìn)一步深入挖掘相關(guān)的調(diào)控通路，探索其調(diào)控分子機(jī)制。另外，當(dāng)蜜蜂到達(dá)采集日齡時(shí)，除了嗅覺(jué)學(xué)習(xí)以外，蜜蜂的學(xué)習(xí)還包括食物定位、歸巢導(dǎo)航、食物信息傳遞等。因此，MRJP1是否參與蜜蜂相對(duì)高級(jí)的學(xué)習(xí)過(guò)程，還需要進(jìn)一步的探索。