雙酚A(BPA)與黑腹果蠅雌激素相關(guān)受體(dERR)的結(jié)合模式及對其基因表達(dá)的影響

王利超, 李佳鵬, 鄭相相, 王 娟, 廖艷鳳, 歐陽霞輝

(西北民族大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院, 蘭州 730030)

內(nèi)分泌干擾化學(xué)物質(zhì)(endocrine disrupting chemicals, EDCs)是指能夠干擾生物體內(nèi)天然激素的合成、分泌、運(yùn)輸、結(jié)合、作用和代謝的外源性物質(zhì)或混合物(Atli, 2013)，可以通過干擾脊椎動(dòng)物和無脊椎動(dòng)物的激素或核受體(nuclear receptor, NR)來干擾正常的激素系統(tǒng)(Canesi and Fabbri, 2015; Bovieretal., 2019)。EDCs可能會(huì)通過改變生理控制機(jī)制而對人類和環(huán)境健康產(chǎn)生不利影響(Elobeid and Allison, 2008)。雙酚A(bisphenol A, BPA)是一種屬于EDCs家族的非甾體異種雌激素(Nanjappaetal., 2014)，作為一種工業(yè)用化學(xué)品，它通常用作聚碳酸酯合成中的單體，環(huán)氧樹脂生產(chǎn)中的增塑劑(Koniecznaetal., 2015)。BPA在脊椎動(dòng)物中起著致畸劑和內(nèi)分泌干擾物的作用，高劑量(1～10 mg/L)具有致畸作用(Soneetal., 2004)，低劑量(在μg/L范圍)具有內(nèi)分泌和多效性效應(yīng)(Flintetal., 2012)。在毒理學(xué)和流行病學(xué)研究中表明，長期或高劑量暴露在BPA下，會(huì)影響人體肝臟與腎臟功能，同時(shí)對生殖、神經(jīng)、免疫、代謝、心血管系統(tǒng)有潛在影響(Acconciaetal., 2015; Siracusaetal., 2018; Tassinarietal., 2020)。

雌激素相關(guān)受體(estrogen-related receptor, ERR)屬于核受體(nuclear receptor, NR)超家族。在果蠅Drosophila基因組中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)屬于NR3亞家族的新的NR，這表明在后口和原口進(jìn)化分裂之前就存在一個(gè)祖先，這種受體被稱為果蠅雌激素相關(guān)受體(Drosophilaestrogen-related receptor, dERR)(?stbergetal., 2003)。目前對dERR的研究發(fā)現(xiàn)，dERR參與生物體脂類的合成和代謝、線粒體的生物發(fā)生及能量代謝的調(diào)控。果蠅幼蟲發(fā)育特征是體重增加約200倍，這種増加需要高效地轉(zhuǎn)換營養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞，從而合成氨基酸、脂肪酸、核苷酸等，而正是dERR觸發(fā)胚胎發(fā)生類似Warburg效應(yīng)的代謝交換機(jī)制來支持幼蟲生長發(fā)育(Tennessenetal., 2011)。迄今為止，雖然在脊椎動(dòng)物及無脊椎動(dòng)物ERR研究中均未發(fā)現(xiàn)其生理配體，但是僅含兩個(gè)苯環(huán)的小分子BPA卻成了ERR配體的最佳候選者。Bannister等(2013) 研究發(fā)現(xiàn)蝸牛ERR(MarisacornuarietisERR, mcERR)配體結(jié)合域(ligand binding domain, LBD)與BPA之間有弱相互作用。最近的研究也證明BPA與人類ERRγ緊密結(jié)合(Liu Xetal., 2014)。Grimaldi等(2019)證明BPA及其類似物可與ERRγ結(jié)合并激活其表達(dá)。目前對昆蟲的研究表明，不同濃度EDCs家族成員能影響不同昆蟲ERR基因的表達(dá)水平。Martínez-Paz 等(2017)認(rèn)為目前在昆蟲上研究的EDCs對昆蟲有相似的影響，Liu T等(2014)認(rèn)為EP能夠模擬BPA的效應(yīng)。低劑量的雙酚A會(huì)影響脊椎動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)，這些作用的分子機(jī)制可能至少部分涉及BPA與ERRγ的高親和力結(jié)合(Okadaetal., 2008)。同時(shí)BPA在果蠅某些發(fā)育障礙(如自閉癥和注意力缺陷多動(dòng)障礙)中可能起著致病作用(Kauretal., 2015)。但尚未評估BPA對dERR的影響。昆蟲ERR與人類ERRγ直系同源(Jinetal., 2017)，由此我們推測BPA可能與dERR存在類似ERRγ的特異性結(jié)合，且BPA可能通過dERR發(fā)揮其毒性作用。

分子動(dòng)力學(xué)模擬方法由Alder和Wainwight于20世紀(jì)50年代提出，可以在分子及原子水平上觀察到生物大分子行為(Dodsonetal., 2008)，通過對分子、原子在一定時(shí)間內(nèi)運(yùn)動(dòng)狀態(tài)的模擬，以動(dòng)態(tài)觀點(diǎn)考察系統(tǒng)隨時(shí)間演化的行為。本研究擬以黑腹果蠅Drosophilamelanogaster為研究對象，通過AutoDock Vina模擬小分子BPA與Modeller 9.25構(gòu)建的dERR蛋白的分子對接，基于Gromacs進(jìn)行分子動(dòng)力學(xué)模擬并結(jié)合自由能的計(jì)算研究兩者的結(jié)合模式，同時(shí)評估不同濃度BPA在不同時(shí)間段對dERR基因轉(zhuǎn)錄水平的影響，初步闡明BPA影響dERR的分子作用機(jī)理，為進(jìn)一步研究昆蟲ERR的功能及作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 黑腹果蠅的培養(yǎng)及處理

選用黑腹果蠅成蟲及2齡幼蟲將其飼養(yǎng)在培養(yǎng)箱中，溫度為24±1℃，相對濕度為50%～60%，光周期為12L∶12D，飼喂標(biāo)準(zhǔn)的玉米粉果蠅培養(yǎng)基(蒸餾水180 mL, 玉米粉16.8 g, 蔗糖13.2 g, 瓊脂粉1.5 g, 酵母粉1.5 g, 丙酸1 mL)。將1 mg純度大于99.0%雙酚A結(jié)晶(克拉馬爾, 上海)固體化合物溶解于100 mL丙酮(>99.5%)中，取1 mL于10 mL容量瓶中逐級(jí)定容至10, 1, 0.1 μg/mL制備母液。取1 mL BPA母液，用5%的蔗糖溶液定容至1 L，用以制備BPA處理組所需原液(0.1, 1和10 μg/L)。研究表明丙酮在任何實(shí)驗(yàn)中都不會(huì)對生物體產(chǎn)生影響(Kwak and Lee, 2005)，將1 mL丙酮用5%蔗糖溶液定容至1 L為對照組，處理組與對照組中丙酮濃度相同。黑腹果蠅成蟲和2齡幼蟲分別放置于含有BPA原液和丙酮對照的玉米粉果蠅培養(yǎng)基中，每隔6 h更換一次含相同濃度BPA原液及丙酮對照的果蠅培養(yǎng)基。

1.2 黑腹果蠅ERR與人類ERRγ氨基酸序列比對

昆蟲ERR與人類ERRγ直系同源，為了確定dERR與ERRγ的保守性，基于在線多序列比對工具Clustal Omega(https:∥www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/)對dERR和人類ERRγ氨基酸序列進(jìn)行比對。采用Jalview展示兩者完全一致的氨基酸。

1.3 黑腹果蠅dERR三維結(jié)構(gòu)構(gòu)建

基于NCBI蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫中已有的dERR氨基酸序列，使用基本局部比對搜索工具(BLAST)從Protein Data Bank(PDB)數(shù)據(jù)庫中搜索模板。采用Modeller 9.25以4NQA(PDB ID)的A鏈為模板對dERR蛋白進(jìn)行同源性建模 (Webb and Sali, 2016)，使用PDBsum(http:∥www.ebi.ac.uk/pdbsum)服務(wù)器對dERR結(jié)構(gòu)質(zhì)量進(jìn)行PROCHECK分析(Peachetal., 2017)，計(jì)算的Ramachandran圖(Rose, 2019)對預(yù)測的dERR進(jìn)行評估和驗(yàn)證。通過3Drefine (Bhattacharyaetal., 2016)改善蛋白結(jié)構(gòu)，使用ModRefiner (Xu and Zhang, 2011)對側(cè)鏈重新定位。

1.4 BPA與dERR分子對接

使用AutoDockTools(ADT)(版本1.5.6)(Morrisetal., 2009)將極性氫和部分電荷添加到dERR蛋白結(jié)構(gòu)中。通過Discovery Studio Client 2020預(yù)測對接位點(diǎn)。小分子化合物BPA從PubChem數(shù)據(jù)庫獲取(CID： 6623)。采用AutoDock Vina進(jìn)行BPA與dERR的分子對接，對接300次(Zahedietal., 2020)。最后將生成的結(jié)果直接加載到Discovery Studio Client 2020中進(jìn)行相互作用力的分析，使用Pymol作圖。

1.5 分子動(dòng)力學(xué)模擬及結(jié)合能的計(jì)算

分子動(dòng)力學(xué)模擬使用Gromacs 5.1.9在內(nèi)部超級(jí)計(jì)算平臺(tái)上進(jìn)行。采用SPC水模型，將dERR蛋白溶于立方盒中。AMBER99SB力場生成蛋白質(zhì)拓?fù)浜虯mbertools生成配體拓?fù)?。系統(tǒng)顯示10個(gè)負(fù)電荷，因此，添加了10個(gè)Na+離子來中和核電荷。為了消除空間碰撞，系統(tǒng)受到最陡峭的能量最小化，使最大作用力低于1 000 kJ·mol·nm。采用粒子網(wǎng)格Ewald方法計(jì)算了長程靜電力。采用網(wǎng)格法確定鄰居列表。在能量最小化后，分別在NVT(固定粒子數(shù)、體積和溫度)和NPT(固定粒子數(shù)、壓力和溫度)條件下進(jìn)行了5 000步(每陡峭2 fs)的位置約束模擬。最后，進(jìn)行了6 ns的MD模擬。用Gromacs均方根偏差(root mean squared deviation, RMSD)和均方根波動(dòng)(root mean square fluctuation, RMSF)工具計(jì)算評價(jià)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的重要指標(biāo)均方根偏差(RMSD)和均方根波動(dòng)(RMSF)。 使用Gromacs 5.1.9模塊的g_mmpbsa，根據(jù)軌道法計(jì)算dERR-BPA復(fù)合物MD軌跡的3-6 ns的結(jié)合自由能，結(jié)合自由能可以反映各能量分項(xiàng)對BPA親和力的影響程度。基于單個(gè)殘基水平對結(jié)合自由能進(jìn)行分解，進(jìn)一步觀察單個(gè)氨基酸結(jié)合能及其在對接中的貢獻(xiàn)。數(shù)據(jù)可視化均采用R語言的Plot包實(shí)現(xiàn)。

1.6 基因表達(dá)量的qRT-PCR檢測

收集1.1節(jié)處理組和對照組的黑腹果蠅成蟲和2齡幼蟲，采用RNAiso Plus試劑盒(TaKaRa, 大連)提取RNA，每組由3個(gè)重復(fù)組成(分別由3頭成蟲和5頭幼蟲組成)。采用PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit (TaKaRa, 大連)合成cDNA。內(nèi)參基因?yàn)镽p49，引物通過在線程序Primer-BLAST設(shè)計(jì)，由上海生工生物股份有限公司合成。dERR引物ERR-F: 5′-AGAAGGTGCTCAACTCGGAC-3′；ERR-R: 5′-GACATGTTCGTGCCTTGGATAA-3′。Rp49引物rp49-F: 5′-ATGACCATCCGCCCAGCATAC-3′；rp49-R: 5′-GCATCAGATACTGTCCCTTGAAGC-3′。qRT-PCR使用CFX96熱循環(huán)儀(Bio-Rad, 美國)進(jìn)行，每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)技術(shù)重復(fù)。qRT-PCR反應(yīng)體系(10 μL): TB Green Premix Ex Taq(Tli RNase H Plus)(2×) 5 μL, 上下游引物(0.5 μmol/L)各0.75 μL, cDNA 1 μL, RNase-Free H2O 2.5 μL。反應(yīng)程序: 95℃ 3min; 95℃ 5 s, 59.5℃ 15 s, 65℃延伸10 s, 35個(gè)循環(huán)。

1.7 數(shù)據(jù)分析

采用2-△△Ct法進(jìn)行基因相對表達(dá)量計(jì)算，通過SPSS 22(IBM)軟件進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA)(Inetal., 2020)，采用t檢驗(yàn)分析處理組和對照組數(shù)據(jù)間的差異顯著性。使用GraphPad Prism8.3.0軟件實(shí)現(xiàn)數(shù)據(jù)可視化。此外，實(shí)驗(yàn)組及對照組之間的相關(guān)性分析及數(shù)據(jù)可視化通過使用R語言(https:∥www.r-project.org/)和可公開獲得的R包進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 黑腹果蠅dERR序列比對結(jié)果

采用Clustal Omega 對dERR和人類ERRγ氨基酸序列進(jìn)行比對，結(jié)果顯示氨基酸序列相似度為44.61%，一致度是57%(圖1)，可見兩者在進(jìn)化上是保守的。

圖1 黑腹果蠅dERR與人類ERRγ氨基酸序列比對Fig. 1 Amino acid sequence alignment between ERR of Drosophila melanogaster and human ERRγ蛋白質(zhì)來源物種及GenBank登錄號(hào)Origin species of proteins and their GenBank accession numbers: 黑腹果蠅Drosophila melanogaster ERR, NP_729340.1; 人Homo sapiens ERRγ, NP_001127757.1.

2.2 黑腹果蠅dERR蛋白建模

采用Modeller 9.25，模擬得到1 000個(gè)dERR蛋白模型，并根據(jù)它們的離散優(yōu)化勢能(DOPE)得分進(jìn)行排名，最終選用得分(-40 203.22656)最低的作為最佳模型(圖2)。PDBsum計(jì)算dERR的Phi/Psi角的殘基百分比(1.2%位于Ramachandran不允許區(qū)域，84.8%位于最受歡迎區(qū)域，1.6%位于慷慨允許區(qū)域)(圖3)表明預(yù)測結(jié)構(gòu)的立體化學(xué)質(zhì)量很好，可進(jìn)一步用于分子對接。

圖2 黑腹果蠅dERR蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測圖Fig. 2 Prediction map of tertiary structure of dERR of Drosophila melanogasterLBD: 配體結(jié)合域Ligand binding domain; DBD: DNA結(jié)合域DNA-binding domain.

圖3 黑腹果蠅dERR蛋白三維模型的Ramachandran圖Fig. 3 Ramachandran plot of three-dimensional model of dERR protein of Drosophila melanogaster最受歡迎的區(qū)域、不允許的區(qū)域和允許的區(qū)域分別以紅色、米白色和黃色著色，其中，只有1.2%的氨基酸殘基位于Ramachandran不允許區(qū)域，84.8%位于最受歡迎的區(qū)域，1.6%位于慷慨允許區(qū)域。The most popular area, the disallowed area, and the allowed area are in red, off-white, and yellow, respectively, among which only 1.2% amino acid residues are located in Ramachandran disallowed areas, 84.8% in the most popular areas, and 1.6% in generously allowed areas.

2.3 BPA與dERR對接

采用Discovery Studio Client 2020預(yù)測對接位點(diǎn)，通過AutoDock Vina進(jìn)行對接，結(jié)果顯示(圖4)，BPA能夠與dERR進(jìn)行對接，能夠完全進(jìn)入dERR蛋白活性口袋。綜合能量越低越穩(wěn)定的原理及對接位點(diǎn)等因素，確定BPA與dERR結(jié)合最有可能的構(gòu)象最優(yōu)對接分?jǐn)?shù)為-8.2 kcal/mol，下線偏差(rmsd u. b.)及上限偏差均為(rmsd l. b.)均為0；BPA和dERR之間結(jié)合不存在氫鍵作用力，而BPA的作用靶點(diǎn)與側(cè)鏈氨基酸殘基Leu338, Arg458和ILe289分別形成Pi-Alkyl鍵、Pi-Cation鍵和Alkyl鍵，鍵長分別為5.49, 2.96和4.07 ?。

圖4 BPA與dERR 分子對接結(jié)果模擬圖Fig. 4 Simulation diagram of molecular docking results of BPA and dERR圖中Leu338, Arg458和ILe289殘基分別用紅色、綠色和藍(lán)色表示，與之對應(yīng)3種顏色虛線分別代表Pi-Alkyl, Pi-Cation和Alkyl鍵，淡紫色示小分子BPA。In the figure, the Leu338, Arg458, and ILe289 residues are represented by red, green and blue, respectively. The corresponding three color dotted lines represent Pi-Alkyl, Pi-Cation, and Alkyl bonds, respectively. Lavender indicates the small molecule BPA.

2.4 BPA-dERR分子動(dòng)力學(xué)模擬及結(jié)合能

對BPA-dERR復(fù)合物進(jìn)行了6 ns的MD模擬，運(yùn)用主鏈原子均方根偏差(RMSD) 值監(jiān)控體系的平衡，結(jié)果如圖5(A)所示，dERR-BPA復(fù)合物和dERR蛋白單體變化趨勢幾乎一致，均在3 ns左右達(dá)到平衡，RMSD值在0.95 nm左右波動(dòng)，這些數(shù)據(jù)表明BPA與dERR結(jié)合穩(wěn)定，說明分子對接的結(jié)果是可靠的。哺乳動(dòng)物ERRγ保持其活化構(gòu)象，其中α-螺旋12必須位于配體結(jié)合口袋上的適當(dāng)位置。BPA可以留在ERRγ-LBP (配體結(jié)合口袋)內(nèi)，而無需更改此激活構(gòu)象(Starovoytovetal., 2014)。可見我們的MD模擬結(jié)果是可靠的。BPA與脊椎動(dòng)物和無脊椎動(dòng)物的ERR作用方式可能是一樣的，并不會(huì)改變ERR蛋白的構(gòu)象而去影響ERR。在模擬過程中對根據(jù)蛋白質(zhì)的骨架計(jì)算的蛋白質(zhì)中每個(gè)殘基的均方根波動(dòng)(RMSF)進(jìn)行了評估，以解決靈活性增加的問題，如圖5(B)所示DNA結(jié)合域顯示出較高的靈活性，而配體結(jié)合域二級(jí)結(jié)構(gòu)元件顯示出相對較小的偏差。BPA與dERR結(jié)合后可能通過影響dERR-DBD與雌激素相關(guān)受體反應(yīng)元件(estrogen-related receptor response element, ERRE)的結(jié)合活性從而影響dERR的轉(zhuǎn)錄水平。g_mmpbsa計(jì)算的BPA與dERR的結(jié)合能為-66.799 kJ/mol，說明BPA與dERR能夠有效和穩(wěn)定的結(jié)合，同時(shí)計(jì)算靜電作用能(-42.123 kJ/mol)、范德華能(-128.214 kJ/mol)、非極性溶劑化能(-13.786 kJ/mol)、極性溶劑化能(117.324 kJ/mol)，可以看出范德華能為BPA的結(jié)合提供了主要驅(qū)動(dòng)力。為定量獲得在dERR-BPA復(fù)合物形成過程中關(guān)鍵能量貢獻(xiàn)的具體細(xì)節(jié)，基于單個(gè)殘基水平對結(jié)合自由能進(jìn)行分解。通過極性溶劑化能我們發(fā)現(xiàn)Phe370(-5.0868 kJ/mol)及Leu334(-4.7107 kJ/mol)等側(cè)鏈氨基酸是BPA和dERR兩者結(jié)合的關(guān)鍵氨基酸。

圖5 dERR-BPA復(fù)合物主鏈RMSD隨時(shí)間變化曲線(A)和dERR蛋白殘基隨時(shí)間變化曲線(B)Fig. 5 Time-dependent curves of the RMSD in complex dERR-BPA (A) and the main protein residues of dERR (B)

2.5 3種濃度BPA對黑腹果蠅dERR基因表達(dá)影響及不同的時(shí)間和BPA濃度與dERR基因表達(dá)量間相關(guān)性

結(jié)果發(fā)現(xiàn)(圖6)，在6 h時(shí)，3種濃度BPA暴露使成蟲及2齡幼蟲dERR轉(zhuǎn)錄水平都發(fā)生下降，其中0.1 μg/L濃度顯著下調(diào)成蟲和2齡幼蟲dERR基因表達(dá)(P<0.0001)；在12 h時(shí)，3種濃度BPA暴露均使成蟲及2齡幼蟲dERR轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)，其中0.1 μg/L濃度顯著上調(diào)2齡幼蟲和成蟲dERR基因的表達(dá)(P<0.0001)；在24 h時(shí)，3種濃度BPA暴露對成蟲及2齡幼蟲的dERR基因表達(dá)有不同的影響，其中0.1 μg/L處理后，2齡幼蟲和成蟲dERR基因表達(dá)幾乎接近對照水平，1 μg/L處理后，2齡幼蟲(P<0.001)和成蟲(P<0.05)dERR基因表達(dá)均呈顯著上升趨勢，而10 μg/L處理后，成蟲dERR基因表達(dá)呈顯著上調(diào)趨勢(P<0.05)，而2齡幼蟲呈顯著下調(diào)趨勢(P<0.05)。此次BPA濃度范圍的實(shí)驗(yàn)結(jié)果通過皮爾遜相關(guān)性系數(shù)觀察劑量和效應(yīng)的關(guān)系，我們發(fā)現(xiàn)成蟲和2齡幼蟲dERR基因表達(dá)量在處理組及對照組的相關(guān)性是一致的(圖7)，其中6 h時(shí)，dERR基因表達(dá)量與3種BPA濃度間均呈正相關(guān)，僅12 h(1 μg/L)和24 h(10 μg/L)處理組分別與12和24 h對照組呈正相關(guān)，其余均呈負(fù)相關(guān)。

圖6 不同濃度BPA處理不同時(shí)間對黑腹果蠅成蟲(A)和2齡幼蟲(B)dERR基因表達(dá)量Fig. 6 Expression levels of dERR gene in adults (A) and the 2nd instar larvae (B) of Drosophila melanogasterafter exposed to different concentrations of BPA for different time圖中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤；柱上星號(hào)表示同一處理時(shí)間與對照有顯著差異(*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001和****P<0.0001, t檢驗(yàn))。Data in the figure are mean±SE. Asterisks above bars indicate significant difference from the control at the same treatment time (*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001, and ****P<0.0001, t-test).

圖7 黑腹果蠅成蟲(A)和2齡幼蟲(B)dERR基因表達(dá)量與不同的時(shí)間和BPA濃度的相關(guān)性圈圖Fig. 7 Circle diagram of correlation of expression level of dERR gene in adults (A) and the 2nd instar larvae (B) of Drosophila melanogaster with BPA concentration6H.sBPA: 0.1 μg/L BPA處理6 h Treatment with 0.1 μg/L BPA for 6 h; 6H.mBPA: 1 μg/L BPA處理6 h Treatment with 1 μg/L BPA for 6 h; 6H.hBPA: 10 μg/L BPA處理6 h Treatment with 10 μg/L BPA for 6 h; 12H.sBPA: 0.1 μg/L BPA處理12 h Treatment with 0.1 μg/L BPA for 12 h; 12H.mBPA: 1 μg/L BPA處理12 h Treatment with 1 μg/L BPA for 12 h; 12H.hBPA: 10 μg/L BPA處理12 h Treatment with 10 μg/L BPA for 12 h; 24H.sBPA: 0.1 μg/L BPA處理24 h Treatment with 0.1 μg/L BPA for 24 h; 24H.mBPA: 1 μg/L BPA處理24 h Treatment with 1 μg/L BPA for 24 h; 24H.hBPA: 10 μg/L BPA處理24 h Treatment with 10 μg/L BPA for 24 h; 6H.PK: 丙酮處理6 h, 作為對照Treatment with acetone for 6 h as the control; 12H.PK: 丙酮處理12 h, 作為對照Treatment with acetone for 12 h as the control; 24H.PK: 丙酮處理24 h, 作為對照Treatment with acetone for 24 h as the control. 連線的顏色代表相關(guān)性(紅色代表正相關(guān)，綠色代表負(fù)相關(guān))；連線的寬度代表相關(guān)系數(shù)。The color of line stands for correlation (positive correlation in red, and negative correlation in green) and the width of line represents the correlation coefficient.

3 討論

本研究確定了dERR與人類ERRγ蛋白的同源性(圖1)；使用Modeller 9.25構(gòu)建了dERR基于同源性的3D模型(圖2)，Phi/Psi角的殘基百分比表明了預(yù)測的同源建模結(jié)構(gòu)具有很好的立體化學(xué)質(zhì)量；基于AutoDock Vina實(shí)現(xiàn)了BPA進(jìn)入與(9cis)-視黃酸(模板4NQA的配體)一樣的結(jié)合口袋。但是非生理配體小分子與蛋白質(zhì)的相互作用不僅發(fā)生在活性口袋處，同時(shí)可能發(fā)生在蛋白質(zhì)表面的其他口袋，它們的相互作用受能量匹配、空間匹配等多方面影響。其次，通過Discovery Studio Client 2020分析了兩者的疏水相互作用、成鍵數(shù)目及鍵長，研究了兩者的結(jié)合模式。有趣的是，人類ERRγ-LBD/BPA復(fù)合物的X射線晶體分析表明，ERRγ受體殘基Leu342, Leu345, Asn346和ILe349(Liu Xetal., 2014)以及GLu275和Arg316(Okadaetal., 2008)充當(dāng)BPA的固有結(jié)合位點(diǎn)。雖然dERR蛋白晶體結(jié)構(gòu)仍未發(fā)現(xiàn)，但是從結(jié)果來看，ERR-LBD的Leu，ILe和Arg極可能是兩者結(jié)合的關(guān)鍵氨基酸。此外，進(jìn)一步從6 ns的軌道上對蛋白質(zhì)-配體復(fù)合物進(jìn)行了分子動(dòng)力學(xué)模擬分析，結(jié)果顯示dERR-BPA 復(fù)合物的結(jié)構(gòu)較穩(wěn)定(圖4)，說明分子對接的結(jié)果很可靠。利用g_mmpbsa定量獲得復(fù)合物形成過程中關(guān)鍵能量貢獻(xiàn)的具體細(xì)節(jié)，基于單個(gè)殘基水平對結(jié)合自由能進(jìn)行分解發(fā)現(xiàn)Phe370和Leu334等側(cè)鏈氨基酸是BPA和dERR兩者結(jié)合的關(guān)鍵氨基酸，在分子和原子水平上解釋了兩者相互作用的機(jī)制。EDCs在極高和極低劑量下可能會(huì)引發(fā)可觀察到的效應(yīng)，但在中等劑量下幾乎沒有效果(Flintetal., 2012)。為了進(jìn)一步明確BPA對dERR基因表達(dá)的影響，我們測定了3個(gè)時(shí)間段(6, 12和24 h) 3種濃度BPA(0.1, 1和10 μg/L)對黑腹果蠅成蟲和2齡幼蟲dERR基因表達(dá)的影響，發(fā)現(xiàn)dERR基因表達(dá)呈現(xiàn)下調(diào)、上調(diào)或幾乎接近對照表達(dá)水平的現(xiàn)象(圖5)，而且黑腹果蠅2齡幼蟲對低劑量BPA較成蟲更敏感。正如Flint等(2012)提到的一些無脊椎動(dòng)物如昆蟲幼蟲可能對低劑量BPA的暴露更加敏感。

分子水平上的大量研究已經(jīng)揭示了不同EDCs在不同程度上對昆蟲ERR有不同的影響，但是無論是劑量效應(yīng)還是作用機(jī)理方面都仍是知之甚少。這些研究中有3個(gè)推測觀點(diǎn)幾乎是得到認(rèn)可：其一，EDCs直接或間接地與受體結(jié)合；其二，EDCs可能是一種蛻皮激素(20-hydroxyecdysone, 20E)模擬物，能夠以非單一的方式影響ERR；其三，EDCs可能擾亂保幼激素(juvenile hormone, JH)和20E之間的平衡(Liu Tetal., 2014, Bovieretal., 2018)。在哺乳動(dòng)物的研究中發(fā)現(xiàn)，BPA能夠與ERRγ特異性結(jié)合(Liuetal., 2019)。有趣的是，昆蟲ERR與人的ERRγ直系同源(Jinetal., 2017)。我們初步認(rèn)為BPA影響dERR可能基于3點(diǎn)：其一是BPA與dERR有弱結(jié)合；其二是BPA可能是一種類固醇激素的模擬物，從而引起類似激素的生理效應(yīng)；其三是BPA可能導(dǎo)致蛻皮類固醇激素紊亂，而這一點(diǎn)可能有ECR的參與。 奚耕思團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)TeERR(TeleogryllusemmaERR)和TeEcR(TeleogryllusemmaEcR)彼此可以相互調(diào)控基因表達(dá)(Jinetal., 2017)。Martinez等(1991)早期的研究發(fā)現(xiàn)，序列基序5′-GGTCA-′3存在于無脊椎動(dòng)物的ECRE中，實(shí)際上與雌激素相關(guān)受體反應(yīng)元件(ERRE)基序5′-AGGTCA-′3非常相似。ERR是轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，能夠與目標(biāo)基因上游的回文反向重復(fù)序列5′GGTCAnnnTGACC-3′相互作用，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄起始速率。

基于不同濃度BPA處理6 h的結(jié)果，我們認(rèn)為BPA在不改變dERR蛋白結(jié)構(gòu)的情況下，與側(cè)鏈氨基酸殘基作用達(dá)到弱結(jié)合，與對應(yīng)基因序列相互作用，調(diào)節(jié)自身轉(zhuǎn)錄起始速率，從而下調(diào)dERR基因表達(dá)水平。但這種影響不會(huì)一直持續(xù)。同時(shí)BPA可能造成蛻皮類固醇激素紊亂。隨著時(shí)間的增加，當(dāng)機(jī)體感受到這種脅迫后，20E的大量合成除了減弱了BPA對內(nèi)激素的影響，進(jìn)而可能通過ECR間接上調(diào)dERR基因表達(dá)。當(dāng)然也不能排除低劑量BPA會(huì)被生物降解或代謝的因素(Staplesetal., 1998; Pritchettetal., 2002; Kangetal., 2007)，如同非甾體藥物的首過效應(yīng)(Herman and Santos, 2021)。同時(shí)在哺乳動(dòng)物的研究發(fā)現(xiàn)，雙酚類物質(zhì)(BPA, BPC和BPE)對NR的活性有不同程度的調(diào)節(jié)作用，ERRγ一般被雙酚類物質(zhì)激活(Thouennonetal., 2019)。BPA上調(diào)ERRγ mRNA和蛋白表達(dá)及其核定位是由ERK1/2磷酸化介導(dǎo)的(Hafezi and Abdel-Rahman, 2019)。因此，在果蠅中這種潛在作用可能存在。在不同濃度BPA處理12 h時(shí)，我們觀察到dERR基因表達(dá)在幼蟲和成蟲中呈上調(diào)趨勢。最終當(dāng)機(jī)體恢復(fù)到初始狀態(tài)后，dERR基因表達(dá)水平有接近對照水平的趨勢。由于不同濃度的BPA及無法消除個(gè)體差異，我們在24 h也觀察到不同的結(jié)果。

本研究首次闡述了BPA能夠影響黑腹果蠅體內(nèi)dERR基因的表達(dá)，通過由靜態(tài)到動(dòng)態(tài)的分子對接和分子動(dòng)力學(xué)模擬為BPA影響dERR基因表達(dá)提供了可能的解釋，初步闡明BPA影響dERR的分子作用機(jī)理，為昆蟲ERR的研究奠定了一定的基礎(chǔ)。