滇重樓皂苷對前列腺癌細胞周期與凋亡的影響

申正超，申吉泓，謝星星，宋 娜，李旭華，石西南，柯坤彬

(1.昆明醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院 泌尿外一科，云南昆明 650032；2.云南中醫(yī)藥大學，云南昆明 650500)

前列腺癌在歐美國家是男性最多見的惡性腫瘤之一，并且在男性癌癥致死病因中排名第1位[1]。在中國，隨著老齡人口增加以及檢查手段的普及，前列腺癌發(fā)病率逐年上升[2]。早期前列腺癌患者的主要治療方式是手術、化療等，但大部分前列腺癌患者在初診時已出現(xiàn)遠端轉(zhuǎn)移，目前晚期轉(zhuǎn)移性前列腺癌的標準方案仍為抗雄激素內(nèi)分泌治療[3]。然而幾乎全部患者在接受雄激素去勢治療1～2年后將進展為去勢抵抗性前列腺癌，此類患者一般預后較差，并且現(xiàn)有治療方法有限[4]。因此急需新型藥物來控制前列腺癌，改善患者預后。

滇重樓(Paris polyphylla)運用于中醫(yī)已有上千年歷史，臨床上用于癰腫、咽喉腫痛、乳腺炎以及惡性腫瘤等治療[5]。從滇重樓根莖中提取的滇重樓皂苷(Polyphyllin Ⅰ，PPⅠ)是1種具有生物活性的甾體皂苷。最近許多學者發(fā)現(xiàn)，滇重樓皂苷在肺癌、乳腺癌、胃癌等惡性腫瘤中具有廣泛的抗腫瘤作用[6-9]。有研究發(fā)現(xiàn)滇重樓皂苷在肺癌中具有增高p21蛋白的作用[10]，但滇重樓皂苷在前列腺癌中的研究還相對較少。本文旨在評估滇重樓皂苷影響去勢抵抗性前列腺癌細胞株PC-3和DU145的增殖、周期以及凋亡的作用，并進一步觀察p21以及磷酸化CDK2蛋白表達的變化，為后期的臨床試驗提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細胞株、藥物與試劑去勢抵抗性前列腺癌細胞株PC-3和Du145于中科院上海細胞庫購買。滇重樓皂苷購買自瀚香生物科技有限公司(Shanghai,China)，純度大于98%，以10 mmol/L的濃度溶于二甲基亞砜(dimethyl sulphoxide，DMSO)中，避光儲存于-20 ℃中。F-12、DMEM培養(yǎng)基，胎牛血清、胰蛋白酶、青霉素-鏈霉素混合液購自HyClone(USA)；MTT粉末購自美倫生物(China)；Annexin V-FITC凋亡試劑盒購自BD Pharmingen(USA)；pho-RB(Ser795)、GAPDH、Caspase-3、p21waf/cip1、pho-CDK2(Thr160)購自CELL Signaling Technology (USA)；RNA酶、BCA蛋白檢測試劑盒購自Thermo(USA)；ECL超敏顯色試劑購自蘇州宇恒生物科技有限公司(China)。

1.2 細胞培養(yǎng)PC-3與Du145分別采用含有體積分數(shù)為10%的胎牛血清、100 U/mL青霉素及100 mg/mL鏈霉素的F-12和DMEM培養(yǎng)基，于37 ℃、含體積分數(shù)5%的CO2恒溫箱中培養(yǎng)。細胞傳代時胰蛋白酶消化，800～1 000 r/min離心3～5 min。

1.3 克隆形成實驗檢測滇重樓皂苷對PC-3和Du145克隆增殖的影響將細胞以500個/孔的密度接種在6孔板中，連續(xù)培養(yǎng)3 d后加入含濃度為0.1 μmol/L滇重樓皂苷的完全培養(yǎng)基，每2～3 d換液1次，培養(yǎng)7 d后吸出培養(yǎng)液，磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)洗滌3次，加入預冷無水甲醇溶液固定10 min后加入2.5 g/L結晶紫溶液染色10 min，流水將殘余溶液洗去后晾干、拍照，在顯微鏡下計數(shù)細胞克隆數(shù)(大于50個細胞的細胞群)，計算細胞克隆形成率。

1.4 MTT檢測PC-3、Du145細胞增殖抑制率取對數(shù)生長期PC-3、Du145以6 000個/孔種于96孔板中。實驗組及對照組均設5個重復孔，四周孔使用PBS填充。過夜培養(yǎng)后吸出培養(yǎng)液，將含體積分數(shù)為0.1%DMSO的完全培養(yǎng)基加入對照組中，實驗組加入終濃度為0.1、0.3、1.0、3.0、10.0 μmol/L的含滇重樓皂苷的培養(yǎng)基100 μL，分別孵育24、48、72 h后加入5 mg/mL的MTT溶液10 μL，孵育4 h后吸出液體，使用100 μL的DMSO溶解結晶，震蕩5 min后于570 nm、630 nm處檢測吸光度，計算細胞活性率。

1.5 流式細胞術檢測細胞周期PC-3、Du145按3×105個/孔接種于6孔板中培養(yǎng)24 h，加入梯度為0.1、0.3、1.0 μmol/L的含藥完全培養(yǎng)基，陰性對照孔加入含有體積分數(shù)為0.1%的DMSO培養(yǎng)基，24 h后收集細胞，PBS洗2遍，重懸后加預冷體積分數(shù)為75%的乙醇于4 ℃固定12 h以上，1 000 r/min離心去上清，用預冷PBS洗2次后加入RNase和PI染液37 ℃孵育30 min，離心后用PBS重懸細胞上機(BD，Biosciences,USA)檢測細胞周期。

1.6 流式細胞術檢測細胞凋亡將PC-3、Du145以6×105個/孔接種于6孔板中培養(yǎng)24 h后，加入最終濃度梯度為1、3、5 μmol/L的含藥完全培養(yǎng)基，陰性對照孔加入含有0.1%DMSO的培養(yǎng)基，12 h后收集細胞，使用Annexin V-FITC流式凋亡盒檢測，流式細胞儀分析細胞凋亡。

1.7 Western blotting檢測p21、p-CDK2、p-RB以及Caspase-3蛋白的表達將PC-3、Du145細胞以6×105個/孔接種于6孔板中培養(yǎng)24 h后，加入最終藥物濃度梯度為0.1、0.3、1.0 μmol/L，對照孔加入含有體積分數(shù)為0.1%的DMSO培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后加入RIPA細胞裂解液，冰上裂解30 min，吸取裂解產(chǎn)物至1.5 mL離心管中，低溫13 000 r/min離心5 min，吸取上清為細胞總蛋白。使用聚氰基丙烯酸正丁酯(bicinchoninic acid，BCA)法蛋白濃度定量試劑盒測定蛋白濃度，將各組蛋白濃度調(diào)節(jié)至相等。使用10% SDS-PAGE凝膠進行電泳。每組加入30 μg蛋白以90 V電泳10～20 min，待marker分層后使用120 V電泳45 min，對目的蛋白分離后進行180 mA濕轉(zhuǎn)45 min，再用50 g/L脫脂牛奶室溫下封閉1 h。加入一抗后4 ℃過夜孵育。第2天吸出一抗，用TBST洗45 min后加入二抗孵育1 h。洗膜后加入電化學發(fā)光(electrochemiluminescence，ECL)發(fā)光液，反應5 min后放入化學發(fā)光成像儀(Invitrogen,USA)中檢測目的蛋白。

2 結 果

2.1 滇重樓皂苷使前列腺癌細胞集落形成減少克隆形成實驗結果顯示，滇重樓皂苷(0.1 μmol/L)處理后PC-3和Du145細胞的克隆形成集落少于對照組(圖1A)，與對照組相比實驗組克隆形成率下降，差異有統(tǒng)計學意義(圖1B)。表明滇重樓皂苷具有抑制前列腺癌細胞克隆形成的能力。

A：含0.1 μmol/L的滇重樓皂苷培養(yǎng)基與對照組PC-3和Du145細胞克隆形成集落的對比，結晶紫染色；B：PC-3和Du145細胞克隆形成率[克隆形成率=(克隆數(shù)/接種細胞數(shù))×100%]；與對照組相比，***P<0.001。圖1 滇重樓皂苷對PC-3和Du145細胞克隆形成的抑制作用

2.2 滇重樓皂苷抑制前列腺癌細胞增殖的作用隨著滇重樓皂苷濃度和作用時間的增加，MTT結果顯示PC-3、Du145細胞活性明顯降低，表明其對前列腺癌細胞的增殖抑制作用具有時間-劑量依賴效應。作用時間在72 h時達到最佳的抑制效果(圖2)。經(jīng)統(tǒng)計分析，滇重樓皂苷在PC-3、Du145細胞株中的半數(shù)抑制率(IC50)分別為3.0、5.7 μmol/L。

A：PC-3；B：Du145。[細胞活性率=(實驗組A值/對照組A值)×100%]，與對照組相比，*P<0.05。圖2 不同濃度滇重樓皂苷在不同時間下對前列腺癌細胞增殖的抑制作用

2.3 滇重樓皂苷對細胞周期的影響經(jīng)過滇重樓皂苷處理24 h后，可見隨著藥物劑量的上升，實驗組細胞G0/G1期比例逐漸升高，S期與G2期比例下降(圖3A)。在1 μmol/L時滇重樓皂苷抑制效果最好，前列腺癌細胞G0/G1期比例達到80%以上，與對照組相比差異有統(tǒng)計學意義(圖3B)，表明滇重樓皂苷具有阻斷細胞G0/G1期的作用。

A：PC-3；B：Du145。與對照組相比，*P<0.05；**P<0.01。圖3 不同濃度的滇重樓皂苷對前列腺癌細胞周期分布的影響

2.4 滇重樓皂苷促進前列腺癌細胞株發(fā)生凋亡用不同濃度的滇重樓皂苷(1、3、5 μmol/L)分別處理PC-3和Du145細胞12 h(圖4A)，結果顯示各劑量組可明顯升高細胞凋亡率(P<0.05)，與對照組比差異具有統(tǒng)計學意義(圖4B)。

A:流式細胞術檢測凋亡，滇重樓皂苷各個濃度可促細胞凋亡；B:PC-3和Du145細胞凋亡率[細胞凋亡率%=晚期凋亡細胞率%+早期細胞凋亡率%]，與對照組相比，*P<0.05。圖4 滇重樓皂苷誘導PC-3、Du145細胞凋亡

2.5 滇重樓皂苷對p21、p-CDK2、p-RB蛋白和凋亡蛋白的影響使用滇重樓皂苷(0.1、0.3、1.0、3.0 μmol/L)分別處理PC-3和Du145細胞24 h后，Western blotting檢測p21waf/cip1、pho-RB(Ser795)、pho-CDK2(Thr160)和Caspase-3蛋白的表達情況。結果顯示p21蛋白含量增高，細胞周期相關蛋白p-CDK2、p-RB降低，凋亡剪切酶Caspase-3含量增多，且呈劑量依賴趨勢。在3 μmol/L濃度下，p-RB的表達幾乎被完全抑制(圖5)。

圖5 不同濃度滇重樓皂苷對細胞周期相關蛋白p21、p-CDK2、p-RB和凋亡蛋白Caspase-3的影響

3 討 論

前列腺癌是老年男性最常見的腫瘤，2018年全世界約有130萬確診病例，導致近36萬人死亡。常用的治療手段包括手術去勢、內(nèi)分泌治療、放化療和靶向治療，這些治療方式的出現(xiàn)大大改善了前列腺癌患者的預后，但晚期或轉(zhuǎn)移性前列腺癌患者的5年生存率僅為26%～30%，因此需要有新的藥物能有效控制前列腺癌[11]。中醫(yī)臨床使用滇重樓根莖已有數(shù)千年歷史，滇重樓皂苷是滇重樓根莖中提取的活性成分之一。研究者發(fā)現(xiàn)滇重樓皂苷具有抑制腫瘤細胞生長、抑制腫瘤血管生成[12]、逆轉(zhuǎn)耐藥性[13]、抑制炎癥反應[14]和調(diào)節(jié)免疫功能的作用，在治療癌癥方面極具前景。

細胞周期失調(diào)是癌癥的一個特性[15]。細胞周期蛋白依賴性激酶2(cyclin-dependent kinase 2，CDK2)是調(diào)控細胞G1-S期的重要蛋白，它以磷酸化的形式參與細胞周期進程、DNA復制、組蛋白合成以及中心體復制[16-17]。當細胞受到有絲分裂信號刺激時，將激活細胞周期蛋白E(cyclin E)，隨后激活CDK2并形成復合體，CDK2-cyclinE復合體可使RB磷酸化，從而促進轉(zhuǎn)錄因子協(xié)調(diào)的基因表達，推動細胞周期的進程[18]。作為CDK2的調(diào)控基因，p21可以抑制CDK2的活性，阻止RB進一步磷酸化和DNA復制啟動，使細胞周期停滯在G1期[19]。

在胃癌及非小細胞肺癌中，滇重樓皂苷在濃度很低(0.1、0.5 μmol/L)的時候即可抑制細胞增殖[20-21]。本研究中，我們在克隆增殖實驗中發(fā)現(xiàn)滇重樓皂苷在0.1 μmol/L濃度下即可抑制前列腺癌細胞的克隆增殖，因此我們在后續(xù)實驗中使用0.1 μmol/L作為起始濃度，并以3倍濃度梯度遞增。當?shù)嶂貥窃碥諠舛仍鲋?0 μmol/L時可使細胞發(fā)生大量壞死，因此我們選擇1、3、5 μmol/L作為凋亡實驗的劑量。本研究結果顯示，前列腺癌細胞活力在遞增濃度和時間的滇重樓皂苷作用下，呈濃度-時間依賴的下降趨勢。流式技術結果示，滇重樓皂苷在低劑量(1、3 μmol/L)下，使PC-3和Du145細胞G0/G1期比例升高，S期占比下降，且G0/G1期比例隨著藥物濃度的增加，呈上升趨勢。當前列腺癌細胞在滇重樓皂苷高劑量(5 μmol/L)的作用下出現(xiàn)明顯凋亡，凋亡細胞所占比例呈濃度依賴性增高。為闡明滇重樓皂苷誘導前列腺癌細胞發(fā)生周期阻滯和凋亡的可能機制，我們進一步對相關細胞周期蛋白和凋亡通路蛋白進行檢測。結果顯示，PC-3和Du145在滇重樓皂苷的作用下，p21表達顯著上升，而p-CDK2和p-RB的表達下降。并且細胞發(fā)生凋亡中最重要的終末剪切酶Caspase-3[22]出現(xiàn)明顯裂解激活。以上結果提示，滇重樓皂苷具有激活細胞凋亡通路和抑制p21調(diào)控CDK2/RB通路的作用。

綜上所述，滇重樓皂苷能夠通過調(diào)節(jié)p21/CDK2/RB信號通路和激活細胞凋亡蛋白，從而抑制前列腺癌細胞株的增殖和生長、誘導細胞凋亡，為滇重樓皂苷運用于前列腺癌臨床治療提供了理論依據(jù)。但滇重樓皂苷激活p21的具體機制及其在前列腺癌動物模型中的抗腫瘤活性仍需進一步研究。