前列腺特異性膜抗原靶向近紅外熒光手術(shù)導(dǎo)航技術(shù)在前列腺癌中的應(yīng)用進(jìn)展

馮科森，焦健華,，張景良，秦衛(wèi)軍

(1.中國人民解放軍61035部隊(duì)衛(wèi)生隊(duì)，北京昌平 102205；2.空軍軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院泌尿外科，陜西西安 710032)

前列腺癌是男性最常見惡性腫瘤之一，近年來其發(fā)病率在全球及國內(nèi)均迅速上升[1-2]。目前，手術(shù)是治療前列腺癌最有效的方法之一，而根治性前列腺癌切除術(shù)和盆部淋巴結(jié)清掃術(shù)是最常用術(shù)式[3]。根治性前列腺癌切除術(shù)中，術(shù)者確定切緣范圍主要依靠術(shù)前影像學(xué)檢查、術(shù)中肉眼所見及探查、術(shù)者自身經(jīng)驗(yàn)和術(shù)中冰凍病理檢查。手術(shù)切除范圍過大會(huì)損傷正常組織，影響尿控等正常功能；而切除范圍過小會(huì)導(dǎo)致陽性切緣，患者容易出現(xiàn)復(fù)發(fā)。在盆部淋巴結(jié)清掃術(shù)中，術(shù)者也很難在手術(shù)中實(shí)時(shí)分辨淋巴結(jié)是否已出現(xiàn)轉(zhuǎn)移。目前，歐洲泌尿外科學(xué)會(huì)(European Association of Urology，EAU)和美國國立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)(National Comprehensive Cancer Network，NCCN)指南均推薦對高風(fēng)險(xiǎn)患者進(jìn)行擴(kuò)大盆部淋巴結(jié)清掃術(shù)[3]。但淋巴結(jié)清掃范圍越大，導(dǎo)致相關(guān)并發(fā)癥發(fā)生的可能性也越高[4]。因此，如何在手術(shù)中盡可能保留正常組織和功能，同時(shí)對前列腺癌侵犯區(qū)域進(jìn)行徹底切除是臨床醫(yī)生經(jīng)常需要面對和解決的問題。靶向熒光術(shù)中導(dǎo)航技術(shù)正是解決這一問題的良方，本文就前列腺癌中前列腺特異性膜抗原(prostate membrane specific antigen,PSMA)靶向近紅外熒光(near-infrared fluorescence，NIRF)手術(shù)導(dǎo)航技術(shù)的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 靶向NIRF手術(shù)導(dǎo)航技術(shù)的基本概念

1.1 光學(xué)分子影像學(xué)光學(xué)分子影像學(xué)源自1999年WEISSLEDER教授最早提出的分子影像學(xué)(mo-lecular imaging)技術(shù)[5]，是利用生物體自發(fā)熒光對分子和分子作用途徑檢測的一種無創(chuàng)技術(shù)，成像依靠不同波長熒光[6]。該技術(shù)常用波長為400～1 000 nm，包括可見光波段(波長：400～650 nm)和NIRF波段(波長>650 nm)[6]。與可見光波段相比，NIRF具有波長較長、組織穿透力較強(qiáng)、散射較小等優(yōu)點(diǎn)，更適合進(jìn)行體內(nèi)成像。

1.2 靶向光學(xué)分子影像手術(shù)導(dǎo)航靶向光學(xué)分子影像手術(shù)導(dǎo)航是一種基于光學(xué)分子影像學(xué)技術(shù)，對腫瘤進(jìn)行細(xì)胞及分子層面靶向?qū)崟r(shí)在體成像的技術(shù)[7]。在靜脈注射腫瘤靶向NIRF染料后，腫瘤靶向熒光染料通過配體-受體結(jié)合作用實(shí)現(xiàn)體內(nèi)自動(dòng)尋靶。施術(shù)者利用高敏感度的熒光采集設(shè)備及快速圖像融合計(jì)算，實(shí)現(xiàn)術(shù)中實(shí)時(shí)熒光成像以精準(zhǔn)切除腫瘤組織及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移[7]。

1.3 靶向NIRF染料靶向NIRF染料通過將NIRF染料與靶向惡性腫瘤特異性標(biāo)志物的配體，如抗體、多肽、小分子化合物相結(jié)合從而實(shí)現(xiàn)熒光染料在手術(shù)中對惡性腫瘤的靶向成像。傳統(tǒng)非靶向NIRF染料如吲哚菁綠(indocyanine green,ICG)等主要依靠實(shí)體惡性腫瘤的高通透性和滯留效應(yīng)(enhanced permeability and retention,EPR)進(jìn)行成像，不連接腫瘤靶向特異性配體，不具有針對惡性腫瘤特異靶向性，因而難以在手術(shù)中準(zhǔn)確分辨前列腺癌和正常組織。與這些傳統(tǒng)NIRF染料相比，靶向NIRF染料可通過配體-受體特異性結(jié)合作用，精準(zhǔn)識別惡性腫瘤，因此具有靶向性更好、特異性更高、與惡性腫瘤結(jié)合時(shí)間更長等優(yōu)點(diǎn)。靶向NIRF染料的使用與否也是靶向NIRF手術(shù)導(dǎo)航技術(shù)與非靶向NIRF手術(shù)導(dǎo)航技術(shù)的區(qū)別所在。

1.4 PSMAPSMA是一種具有葉酸水解酶和N-乙酰化α-鍵酸性二肽酶(N-acetylated a-linked acidic dipeptidase，NAALADase)活性的Ⅱ型跨膜糖蛋白，在前列腺癌細(xì)胞中顯著高表達(dá)且其表達(dá)量為生理表達(dá)量的100倍以上[8]。有研究表明，PSMA可在絕大多數(shù)原發(fā)性前列腺癌和98%前列腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中高表達(dá)[9]，并且其表達(dá)量隨Gleason分期升高而增加[10]。因此，PSMA作為一種前列腺癌特異性高表達(dá)膜蛋白，便于和靶向染料結(jié)合，是靶向NIRF染料的理想靶點(diǎn)。

2 常用設(shè)備

靶向NIRF手術(shù)導(dǎo)航技術(shù)所使用的設(shè)備一般是具有近紅外波段熒光成像功能的熒光手術(shù)設(shè)備。國外研究中常用的設(shè)備包括Artemis、FDPM imager、FLARE、Fluobeam、HyperEye、熒光腹腔鏡Karl Strorz/PINPOINT、Kit-FLARE、Mini-FLARE、Photodynamic Eye(PDE)、Munich/SurgOptix原型攝像系統(tǒng)、Goggle系統(tǒng)、加裝NIRF成像模塊的達(dá)芬奇手術(shù)機(jī)器人等設(shè)備[11-12]。目前國內(nèi)報(bào)道的臨床研究中所使用的設(shè)備有：楊曉峰等[13]在前列腺癌根治性切除術(shù)和擴(kuò)大盆腔淋巴結(jié)清掃中使用的熒光腹腔鏡系統(tǒng)。以上具有近紅外波段成像功能的設(shè)備均可進(jìn)行靶向NIRF手術(shù)導(dǎo)航，因此靶向NIRF染料的研發(fā)也就成為該研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。與傳統(tǒng)的非靶向NIRF成像相比，PSMA靶向NIRF染料是PSMA靶向NIRF手術(shù)的關(guān)鍵技術(shù)，能夠極大提高前列腺癌病灶的信噪比，為減少陽性切緣和精準(zhǔn)清除轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)提供重要保證。下面我們進(jìn)一步對PSMA靶向NIRF染料研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

3 靶向熒光染料

根據(jù)靶向PSMA的配體種類不同，可以將PSMA靶向NIRF染料分為抗體靶向染料、小分子靶向染料、可激活靶向染料和雙模靶向染料(圖1)。

圖1 PSMA靶向NIRF染料結(jié)構(gòu)示意圖

3.1 抗體PSMA靶向NIRF染料抗體PSMA靶向NIRF染料是指將全抗體或抗體片段偶聯(lián)NIRF染料構(gòu)成的PSMA靶向NIRF染料。J591是1種PSMA靶向人源化單克隆抗體，其以良好的特異性最早應(yīng)用于PSMA抗體靶向染料的合成。2011年，NAKAJIMA等[15]首先將J591抗體連接吲哚菁綠(indocyanine green，ICG)，構(gòu)建首個(gè)PSMA抗體靶向NIRF染料。但在該染料中，ICG連接于J591抗體后便發(fā)生熒光淬滅，只有在與PSMA陽性前列腺癌細(xì)胞結(jié)合并內(nèi)化后才能再次發(fā)出熒光[15]。這種連接配體后易發(fā)生熒光淬滅的缺點(diǎn)限制了ICG在合成靶向熒光染料中的應(yīng)用，但這一缺點(diǎn)在商業(yè)化NIRF染料IRDye800CW中得以克服。2016年，約翰斯·霍普金斯大學(xué)醫(yī)學(xué)院團(tuán)隊(duì)MUKHERJEE等[16]首次將J591抗體連接NIRF染料IRDye800CW構(gòu)建J591-IRDye800CW(又名ProstaFluor)，并且在PSMA+LMD前列腺癌細(xì)胞荷瘤裸鼠模型中證明該染料對PSMA+前列腺癌在注射后24～120 h具有良好的成像效果，且目前ProstaFluor已進(jìn)入臨床試驗(yàn)。同時(shí)，NAGAYA等[17]通過將PSMA單抗連接IR-700DX構(gòu)建Anti-PSMA-IR700同時(shí)實(shí)現(xiàn)了NIRF成像和光熱治療的效果。

隨著近年來抗體技術(shù)發(fā)展，單鏈抗體等新抗體的研發(fā)也進(jìn)一步推進(jìn)了抗體PSMA靶向NIRF染料的發(fā)展。2016年，MAZZOCCO等[18]將PSMA單鏈抗體ScFvD2B連接于近紅外染料X770構(gòu)建PSMA靶向NIRF染料X770-ScFvD2B，并順利用該染料對PSMA陽性前列腺癌細(xì)胞(LNCaP細(xì)胞)荷瘤鼠在靜脈注射后24～ 240 h進(jìn)行體內(nèi)成像。在另一項(xiàng)研究中，本課題組HAN等[19]從大型酵母展示單鏈抗體庫中篩選出一株人源PSMA單鏈抗體gy1并連接近紅外染料IRDye800CW構(gòu)建首個(gè)人源PSMA單鏈抗體NIRF染料，并使用該靶向染料順利對PSMA+PC3前列腺癌細(xì)胞荷瘤鼠進(jìn)行體內(nèi)成像且取得較好效果。在此工作基礎(chǔ)上，研究人員進(jìn)一步將單鏈抗體gy1構(gòu)建為PSMA人源性全抗體PSMAb，將其連接至IRDye800CW上構(gòu)建出PSMAb-IRDye800CW，它是首個(gè)靶向PSMA人源全抗體NIRF染料，同時(shí)該研究順利對PSMA+PC3前列腺癌細(xì)胞荷瘤鼠進(jìn)行了體內(nèi)成像[20]。

目前，抗體偶聯(lián)的NIRF探針在前列腺癌術(shù)中顯像具有獨(dú)特優(yōu)勢，一方面是由于抗體代謝相對較慢，可在3～7 d達(dá)到術(shù)中成像的最佳信噪比，為手術(shù)提供了較為充裕的時(shí)間；另一方面是由于抗體分子量相對較大，主要經(jīng)肝臟代謝而非腎臟代謝，其熒光在尿液中含量較少，避免了術(shù)中尿液滲漏導(dǎo)致的手術(shù)視野熒光污染。與PSMA靶向小分子配體相比，PSMA靶向抗體臨床試驗(yàn)的進(jìn)度相對較慢，在臨床試驗(yàn)方面仍需努力。

3.2 小分子PSMA靶向NIRF染料小分子PSMA靶向NIRF染料是通過化學(xué)合成PSMA小分子化合物配體或抑制劑后偶聯(lián)NIRF染料構(gòu)成的靶向染料。2005年，HUMBLET等[21]通過合成一種PSMA靶向小分子化合物GPI，并且連接四磺化七甲川吲哚菁綠類染料IRDye78構(gòu)建首個(gè)小分子PSMA靶向近紅外染料GPI-78并順利將其用于PSMA+LNCaP前列腺癌細(xì)胞荷瘤鼠的體內(nèi)成像。

Cy5.5和IRDye800CW等商業(yè)化NIRF染料的出現(xiàn)及使用促進(jìn)了PSMA小分子靶向染料迅速發(fā)展。一項(xiàng)研究將PSMA小分子抑制劑CTT-54.2與NIRF染料Cy5.5連接構(gòu)建成Cy5.5-CTT-54.2，其在體外實(shí)驗(yàn)中顯示出對PSMA+前列腺癌細(xì)胞較強(qiáng)靶向性[22]。另一項(xiàng)研究通過合成一種PSMA靶向小分子抑制劑YC-27 3與IRDye800CW連接構(gòu)建小分子PSMA靶向NIRF染料并且成功用于PSMA+前列腺癌PC3pip細(xì)胞荷瘤鼠模型體內(nèi)成像[23]。此外，一項(xiàng)研究通過合成一種靶向PSMA小分子化合物PSMA-1，并將其分別與IRDye800CW和Cy5.5相連接，構(gòu)建2種PSMA靶向近紅外染料，PSMA-1-IRDye800CW和PSMA-1-Cy5.5[24]。2種PSMA靶向熒光染料均在注射4 h后在對PSMA+PC3pip前列腺癌細(xì)胞荷瘤鼠進(jìn)行活體成像中達(dá)到較好的成像效果[24]。另一項(xiàng)研究通過化學(xué)合成PSMA小分子抑制劑SCE(一種尿素化合物)并連接IRDye800CW構(gòu)建PSMA靶向近紅外染料SCE-IRDye800CW，并用該染料順利對PSMA+LNCaP細(xì)胞荷瘤鼠進(jìn)行體內(nèi)成像[25]。

除IRDye800CW和Cy5.5外，一些新的NIRF染料也進(jìn)入臨床前期研究。一項(xiàng)研究通過合成PSMA小分子抑制劑賴氨酸尿素谷氨酸鹽(Lysine-urea-glutamate，KUE)連接一種含鋅NIRF染料ZW800-1(zwitterionic fluorophores)并用KUE-ZW800-1成功對PSMA+前列腺癌LNCaP細(xì)胞荷瘤鼠進(jìn)行體內(nèi)成像[26]。同時(shí)，目前將PSMA靶向小分子配體KUE連接Cy5.5、Cy7、Cy7.5等陸續(xù)進(jìn)入臨床前研究階段[26-27]。另一項(xiàng)研究設(shè)計(jì)PSMA靶向近紅外染料OTL78，該染料包括一個(gè)PSMA小分子配體DUPA和一種NIRF染料S0456，應(yīng)用于PSMA+前列腺癌22Rv1和LNCaP細(xì)胞荷瘤鼠的體內(nèi)成像并獲得信噪比5∶1的良好效果[28]。此外，還有研究將BODIPY熒光染料與PSMA小分子配體連接，構(gòu)建PSMA靶向NIRF染料[29]。

近年來，小分子PSMA靶向NIRF染料的快速發(fā)展得益于以PSMA小分子配體為基礎(chǔ)的PSMA正電子發(fā)射型計(jì)算機(jī)斷層顯像(positron emission computed tomography，PET)在臨床中的快速應(yīng)用和發(fā)展。但小分子配體分子量較小，主要經(jīng)腎臟代謝，術(shù)中尿液滲漏可能導(dǎo)致的術(shù)野熒光污染問題有待進(jìn)一步地研究。

3.3 可激活NIRF染料靶向染料具有“開關(guān)”效應(yīng)，即平時(shí)保持關(guān)閉狀態(tài)不發(fā)出熒光，只有在與靶分子結(jié)合時(shí)才發(fā)出熒光。該染料利用靶分子酶活性，可在降低背景熒光的同時(shí)增加與靶分子結(jié)合熒光信號，以顯著提高信噪比[12]。由于PSMA具有葉酸水解酶和谷氨酸羧肽酶活性，因此可被設(shè)計(jì)為可激活NIRF染料的靶點(diǎn)。KAWATANI等[30]利用PSMA谷氨酸羧肽酶活性設(shè)計(jì)首個(gè)可激活PSMA靶向NIRF染料5GluAF-2MeTG。在5GluAF-2MeTG中，2MeTG是一種可以被PSMA的谷氨酸羧肽酶活性催化水解的底物，5GluAF是一種近紅外染料。當(dāng)二者結(jié)合時(shí)2MeTG可通過最低未被占據(jù)分子軌道使5GluAF發(fā)生熒光淬滅，從而實(shí)現(xiàn)“關(guān)閉”熒光；在與PSMA結(jié)合后，PSMA谷氨酸羧肽酶活性將2MeTG解離，5GluAF重新發(fā)出強(qiáng)熒光從而實(shí)現(xiàn)“打開”熒光，以實(shí)現(xiàn)對PSMA+前列腺癌的成像。同時(shí)，另一項(xiàng)研究將前列腺癌PSMA靶向和腫瘤位置相對缺氧結(jié)合，合成了PSMA靶向與缺氧協(xié)同的多功能探針，用于前列腺癌的精準(zhǔn)成像[31]。

3.4 多模態(tài)染料多模態(tài)染料是指將NIRF染料、核素等同時(shí)連接同一個(gè)配體從而實(shí)現(xiàn)同一靶向染料在多種成像方式下均可成像。由于每種成像方式都具有其自身獨(dú)特優(yōu)勢和缺陷，因此同時(shí)組合多種成像方式有望結(jié)合多種成像方式的優(yōu)勢，克服單一成像方式的缺陷。

有研究構(gòu)建了可同時(shí)進(jìn)行單光子發(fā)射計(jì)算機(jī)斷層成像術(shù)(SPECT/CT)和NIRF成像的PSMA靶向雙模態(tài)染料。一項(xiàng)研究通過合成一種PSMA靶向的新的化合物“1”并將其分別連接111In和IRDye800CW，構(gòu)建了首個(gè)PSMA靶向的雙模態(tài)染料并成功用于PSMA+LNCaP前列腺癌細(xì)胞荷瘤鼠模型的SPECT/CT和NIRF成像[32]。另一項(xiàng)研究將PSMA胞外段結(jié)合的抗體D2B與111In和IRDye800CW連接構(gòu)建了PSMA靶向雙模染料111In-DTPA-D2B-IRDye800CW，并將該染料成功用于PSMA+LNCaP前列腺癌細(xì)胞皮下荷瘤鼠模型和PSMA+LS174T前列腺癌細(xì)胞腹腔荷瘤鼠模型的SPECT/CT和NIRF成像[33]。在靜脈注射111In-DTPA-D2B-IRDye800CW后48～168 h，NIRF成像可取得較高信噪比及較好成像效果[33]。同時(shí)，該課題組進(jìn)一步嘗試IRDye700DX構(gòu)建111In-DTPA-D2B-IRDye700DX用于PSMA靶向成像和光熱治療[34]。

一些研究構(gòu)建可同時(shí)進(jìn)行PET和NIRF成像的PSMA靶向雙模態(tài)染料。在已應(yīng)用于前列腺癌患者診斷檢查的68Ga-PSMA-11 PET的基礎(chǔ)上，該研究分別將FITC、AlexaFluor488、DyLight800和IRDye800CW 4種熒光染料連接68Ga-PSMA-11，首次構(gòu)建了4種可同時(shí)進(jìn)行術(shù)前68Ga-PSMA PET和術(shù)中熒光手術(shù)導(dǎo)航的PSMA靶向雙模態(tài)染料[35]。其中68Ga-PSMA-11-DyLight800和68Ga-PSMA-11-IRDye800CW 2種染料所使用熒光波段均為NIRF，更適合體內(nèi)成像，且68Ga-PSMA-11-IRDye800CW在接種PSMA陽性LNCaP前列腺癌細(xì)胞荷瘤裸鼠中的信噪比更高，熒光成像效果更好[35]。因此該研究在大型動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，將68Ga-PSMA-11-IRDye800CW 按照30 μg/kg注射給2只2～3月齡小豬，并在1 h后對它們順利使用達(dá)芬奇手術(shù)機(jī)器人進(jìn)行NIRF引導(dǎo)下前列腺切除術(shù)，進(jìn)一步驗(yàn)證68Ga-PSMA-11-IRDye800CW應(yīng)用于臨床的可行性[35]。鑒于68Ga-PSMA-11 PET/CT已在臨床中應(yīng)用及IRDye800CW在臨床試驗(yàn)中的廣泛應(yīng)用，68Ga-PSMA-11-IRDye800CW有望快速向臨床應(yīng)用進(jìn)行轉(zhuǎn)化。

3.5 納米染料目前，隨著納米材料的快速發(fā)展，多個(gè)納米材料相關(guān)的PSMA靶向染料正在進(jìn)行臨床前研究。一方面，有研究使用納米材料包裹ICG后在材料表面修飾PSMA靶向短肽從而實(shí)現(xiàn)ICG的PSMA靶向前列腺癌成像[36]；另一方面，有研究以聚乳酸-聚乙二醇納米顆粒為載體，通過表面修飾PSMA靶向肽，從而構(gòu)建111In和IRDye800CW標(biāo)記的雙模探針[37]。另外，研究人員還嘗試使用量子點(diǎn)熒光染料進(jìn)行PSMA靶向成像，將J591抗體連接量子點(diǎn)近紅外染料Quantum dot 800并用該染料順利對PSMA+前列腺癌C4-2細(xì)胞荷瘤鼠進(jìn)行體內(nèi)成像[38]。但目前納米材料的潛在體內(nèi)毒性等問題導(dǎo)致目前尚無PSMA靶向NIRF納米染料進(jìn)入臨床試驗(yàn)。

4 臨床試驗(yàn)

目前已申請進(jìn)入臨床試驗(yàn)的PSMA靶向熒光染料有2項(xiàng)，均為PSMA抗體NIRF染料。一項(xiàng)為ProstaFluor，即HuJ591-IRDye800CW，由Spectros公司申請開展一期、二期臨床試驗(yàn)(NCT01173146)。另一項(xiàng)為美國希望之城醫(yī)療中心申請的PSMA單克隆抗體MDX1201連接熒光染料A488用于ⅡB/Ⅲ/Ⅳ期前列腺癌患者的熒光引導(dǎo)下腹腔鏡前列腺癌根治術(shù)的臨床試驗(yàn)(NCT02048150)。

5 挑戰(zhàn)與展望

近年來，PSMA靶向NIRF手術(shù)導(dǎo)航技術(shù)發(fā)展迅速，正處在由臨床前科研階段向臨床應(yīng)用轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵階段。隨著更多PSMA靶向染料研發(fā)和更多大規(guī)模臨床試驗(yàn)開展，今后在手術(shù)中實(shí)時(shí)精準(zhǔn)辨別前列腺癌與正常組織、轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)和正常淋巴結(jié)將不再困難?？杉せ罴岸嗄B(tài)PSMA靶向近紅外染料有望進(jìn)一步降低染料信噪比并不斷豐富靶向染料的功能。目前，近紅外Ⅱ區(qū)染料也在迅速發(fā)展，有望為熒光手術(shù)注入新的動(dòng)力。我們相信隨著人們對靶向NIRF染料的不斷研究，前列腺癌PSMA靶向熒光手術(shù)導(dǎo)航技術(shù)將取得新的突破。