骨病回生丸對(duì)激素性股骨頭壞死大鼠的作用*

羅丹，曹玉舉，郭永昌

鄭州中醫(yī)骨傷病醫(yī)院，河南 鄭州 450016

激素性股骨頭壞死是指由于長(zhǎng)期使用激素導(dǎo)致的股骨頭局部血運(yùn)不良、骨細(xì)胞缺血性壞死、骨小梁斷裂、股骨頭塌陷的病變，常出現(xiàn)髖部疼痛、跛行、髖關(guān)節(jié)活動(dòng)不利等癥狀［1］。調(diào)查指出［2］，我國股骨頭壞死的患病率約為7.92／萬～11.76／萬，其中激素性股骨頭壞死占比超過57%，且隨著激素類藥物應(yīng)用的不斷增加，激素性股骨頭壞死的患病率逐漸升高，危害極大。目前，臨床上對(duì)于激素性股骨頭壞死無特效治療方案，早期患者多采用藥物治療改善骨代謝，如阿侖膦酸鈉等，但療效并不理想［3］。骨病回生丸以三七、丹參、土鱉蟲、穿山甲、沒藥等中藥材入藥，具有活血化瘀、補(bǔ)氣養(yǎng)血、舒筋通絡(luò)的功效，主治各類骨壞死，尤其是瘀血型股骨頭壞死。研究指出，骨病回生丸對(duì)早中期激素性、創(chuàng)傷性、酒精性等股骨頭壞死有較好療效，可改善髖關(guān)節(jié)功能［4］，但其對(duì)激素性股骨頭壞死的作用機(jī)制尚不明確。Toll樣受體4（toll like receptor 4，TLR4）是Toll樣受體家族最重要、作用最活躍的成員之一，可參與炎癥反應(yīng)、細(xì)胞增殖與凋亡、免疫紊亂等病理生理過程，而其下游的核因子－κB（nuclear factor－κB，NF－κB）可參與細(xì)胞對(duì)外界刺激的響應(yīng)，如介導(dǎo)腫瘤壞死因子－α（tumor necrosis factor－α，TNF－α）、白細(xì)胞介素－6（interleukin－6，IL－6）的合成和分泌而引發(fā)炎性損傷等。既往報(bào)道中指出，TLR4過度激活可參與激素性股骨頭壞死的發(fā)生，且股骨組織可見明顯的炎性損傷［5－6］?；诖?，本研究選用激素性股骨頭壞死大鼠模型，探討骨病回生丸治療激素性股骨頭壞死的作用機(jī)制，以期為該藥物的臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 動(dòng)物SPF級(jí)SD大鼠58只，雌雄各半，7～9周齡，180～220 g，購自上海醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（滬）2019－0001，使用許可證號(hào)：SYXK（滬）2019－0058。飼養(yǎng)環(huán)境：溫度18～26℃，相對(duì)濕度40%～60%，12 h光照／12 h黑暗，自由飲食和進(jìn)水。本研究經(jīng)河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心審批通過，倫理批號(hào)：201910－004。

1.2 藥物與試劑骨病回生丸（鄭州中醫(yī)骨傷病醫(yī)院，規(guī)格：6 g／丸，豫藥制字：Z04010272）；注射用甲潑尼龍琥珀酸鈉（比利時(shí)輝瑞公司，規(guī)格：0.5 g／支，進(jìn)口藥品注冊(cè)證號(hào)：H20080284）；注射用青霉素鈉（華北制藥集團(tuán)有限責(zé)任公司，規(guī)格：80萬U，國藥準(zhǔn)字：H13020657）；阿侖膦酸鈉（杭州默沙東制藥有限公司，規(guī)格：70 mg／片，國藥準(zhǔn)字：J20130085）。大腸桿菌內(nèi)毒素（美國Sigma公司，貨號(hào)：QM8005P）；乙二胺四乙酸二鈉溶液（北京豫維科技有限公司，貨號(hào)：GBW060340）；蘇木素－伊紅（hematoxylin－eosin，HE）染色試劑盒（上海信帆生物科技有限公司，批號(hào)：201904）；大鼠TLR4、TNF－α、IL－6 ELISA檢測(cè)試劑盒（北京中衫金橋生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：201903126、201905241、201904268）；Trizol試劑盒（美國Invitrogen公司，貨號(hào)：R1613574）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國Fermentas公司，批號(hào)：1904A）；5×細(xì)胞裂解液（上海曼博生物醫(yī)藥科技有限公司，貨號(hào)：RP05－100）；二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白定量試劑盒（美國Sigma公司，批號(hào)：20190816002）；兔抗鼠TLR4、NF－κB、p－NF－κB、TNF－α、IL－6、β－actin單克隆抗體及過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔TLR4、NF－κB、p－NF－κB、TNF－α、IL－6、β－actin多克隆抗體（美國Maxim公 司，批 號(hào)：190415、190512、190627、190520、190618、190821、190514、190621、190830、190611、190720、190914）；TLR4、NF－κB、TNF－α、IL－6引物序列委托寶生物工程（大連）有限公司合成。

1.3 儀器ZQP－86型組織切片機(jī)（上海之信儀器有限公司）；DSX100型光學(xué)顯微鏡（日本Olympus公司）；UV2550型紫外分光光度計(jì)（上海島津器材有限公司）；Premier 6軟件（加拿大Premier公司）；7500型PCR儀（美國Thermo公司）；1658033型凝膠電泳儀及Quantity One配套分析系統(tǒng)（美國Bio－Rad公司）。

2 方法

2.1 動(dòng)物建模、分組與藥物干預(yù)58只SD大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為建模組（n＝50）和空白對(duì)照組（n＝8）。建模組大鼠首先腹腔注射97.92μg·kg－1的大腸桿菌內(nèi)毒素，每天1次，連續(xù)2次，并于末次注射24 h后臀部肌肉注射24.5 mg·kg－1的注射用甲潑尼龍琥珀酸鈉，每周1次，連續(xù)6周，建立激素性股骨頭壞死大鼠模型［7］，同時(shí)注射8萬U青霉素鈉預(yù)防感染，每周2次?？瞻讓?duì)照組注射等體積無菌生理鹽水。建模結(jié)束后，隨機(jī)取2只建模組大鼠處死進(jìn)行HE染色，光鏡下觀察大鼠股骨組織的病理變化。若出現(xiàn)骨小梁減少或斷裂、空骨陷窩增加、脂肪細(xì)胞增加等，表明建模成功。建模成功后，建模組大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組（n＝8）、阿侖膦酸鈉組（n＝10）、骨病回生丸低劑量組（n＝10）、骨病回生丸中劑量組（n＝10）及骨病回生丸高劑量組（n＝10）。阿侖膦酸鈉組大鼠頸部皮下注射150μg·kg－1阿侖膦酸鈉，骨病回生丸低、中、高劑量組大鼠的給藥量按人與大鼠的體表面積折算系數(shù)進(jìn)行計(jì)算（骨病回生丸臨床劑量為18 g·d－1，成人體重按60 kg計(jì)，給藥劑量為0.3 g·kg－1·d－1，大鼠臨床等效劑量：0.3 g·kg－1·d－1×6.3＝1.89 g·kg－1·d－1），分別灌胃給予骨病回生丸溶液1.89 g·kg－1、3.78 g·kg－1、7.56 g·kg－1，給藥體積為10 mL·kg－1，空白對(duì)照組和模型組予以等體積生理鹽水灌胃，每天1次，持續(xù)4周。給藥期間，骨病回生丸低、高劑量組各有1只大鼠因灌胃操作不慎穿破食管而死，剔除本研究。

2.2 HE染色觀察大鼠股骨組織的病理變化取大鼠右側(cè)股骨組織，固定24 h后，加入10%的乙二胺四乙酸二鈉溶液脫鈣，乙醇溶液梯度洗脫，石蠟包埋，冷凍，切片（厚度為4μm），40℃溫水展開，烤干后采用HE染色試劑盒染色，中性樹膠封固，光鏡下觀察大鼠股骨組織的病理變化。

2.3 ELISA法檢測(cè)大鼠血清中TLR4、TNF－α、IL－6的水平分別于干預(yù)前及干預(yù)1周、2周、4周后取大鼠尾靜脈血，嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作，采用ELISA法檢測(cè)大鼠血清中TLR4、TNF－α、IL－6的水平。

2.4 RT－qPCR法檢測(cè)股骨組織TLR4 m RNA、NF－κB m RNA、TNF－αm RNA及IL－6 m RNA的相對(duì)表達(dá)量每組取3只大鼠的股骨組織研磨，采用Trizol標(biāo)準(zhǔn)分離法提取總RNA，采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。不同基因的引物序列和擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度見表1。反應(yīng)體系共25μL，反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30 s，95℃變性5 s，59℃退火30 s，50℃延伸10 s，重復(fù)35個(gè)循環(huán)。PCR反應(yīng)產(chǎn)物純化后，以β－actin為內(nèi)參基因，采用配套的分析系統(tǒng)，以2－△△Ct法計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量。

表1 不同基因引物序列和擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度

2.5 Western Blot法檢測(cè)大鼠股骨組織中TLR4、NF－κB、TNF－α、IL－6及p－NF－κB的蛋白表達(dá)水平 每組取3只大鼠的股骨組織研磨，加入細(xì)胞裂解液，提取總蛋白，BCA試劑盒對(duì)總蛋白進(jìn)行定量。蛋白凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉過夜。加入一抗（1∶1 000），4℃孵育過夜，加入二抗（1∶5 000），室溫孵育2 h。洗膜、曝光、顯影。將目的蛋白條帶灰度值與內(nèi)參條帶灰度值的比值記為目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 24.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。重復(fù)測(cè)量的計(jì)量資料采用重復(fù)測(cè)量方差分析和LSD－t檢驗(yàn)；多樣本計(jì)量資料采用單因素方差分析和SNK－q檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 骨病回生丸對(duì)激素性股骨頭壞死大鼠股骨組織病理改變的影響光鏡下顯示，空白對(duì)照組大鼠軟骨細(xì)胞排列整齊，骨小梁排列規(guī)則、致密飽滿、周邊可見成骨細(xì)胞和少量破骨細(xì)胞，空骨陷窩少見，髓腔內(nèi)未見脂肪細(xì)胞增生及肥大；模型組大鼠軟骨細(xì)胞呈簇狀肥大、排列不規(guī)則，骨小梁減少、斷裂，骨細(xì)胞壞死，空骨陷窩和脂肪空泡數(shù)目多；各給藥組大鼠股骨組織病理改變得到明顯改善，其中以骨病回生丸高劑量組作用最佳，大鼠股骨組織軟骨細(xì)胞基本排列整齊，骨小梁基本規(guī)則排列，空骨陷窩、脂肪空泡數(shù)目少。見圖1。

圖1 骨病回生丸對(duì)激素性股骨頭壞死大鼠股骨組織病理改變的影響（HE染色，×200）

3.2 骨病回生丸對(duì)激素性股骨頭壞死大鼠血清中TLR4、TNF－α、IL－6水平的影響干預(yù)前，與空白對(duì)照組比較，其余各組大鼠血清中TLR4、TNF－α、IL－6水平均顯著升高（P＜0.05）。干預(yù)1周、2周、4周后，與空白對(duì)照組比較，模型組大鼠血清中TLR4、TNF－α、IL－6水平顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，阿侖膦酸鈉組和骨病回生丸給藥組大鼠血清中TLR4、TNF－α、IL－6的水平均顯著降低（P＜0.05）。見表2－表4。

表2 骨病回生丸對(duì)激素性股骨頭壞死大鼠血清中TLR4水平的影響 （±s，μg·L－1）

表2 骨病回生丸對(duì)激素性股骨頭壞死大鼠血清中TLR4水平的影響 （±s，μg·L－1）

注：與空白對(duì)照組比較，a P＜0.05；與模型組比較，b P＜0.05

組別 n TLR4干預(yù)前 干預(yù)1周 干預(yù)2周 干預(yù)4周2.52±0.48 2.62±0.42 2.58±0.46 2.60±0.44模型組 8 8.79±1.52a 10.17±1.80a 12.48±1.90a 15.87±2.01a阿侖膦酸鈉組 10 8.81±1.60a 6.02±1.13b 5.04±1.08b 4.05±0.82b骨病回生丸低劑量組 9 8.76±1.58a 7.14±1.46b 6.01±1.25b 5.00±1.04b骨病回生丸中劑量組 10 8.80±1.59a 6.00±1.15b 5.06±1.10b 4.07±0.82b骨病回生丸高劑量組 9 8.78±1.61a 5.11±0.96b 4.08±0.81b 3.15±0.59空白對(duì)照組8 b

表4 骨病回生丸對(duì)激素性股骨頭壞死大鼠血清中IL－6水平的影響 （±s，ng·L－1）

表4 骨病回生丸對(duì)激素性股骨頭壞死大鼠血清中IL－6水平的影響 （±s，ng·L－1）

注：與空白對(duì)照組比較，a P＜0.05；與模型組比較，b P＜0.05

組別 n IL－6干預(yù)前 干預(yù)1周 干預(yù)2周 干預(yù)4周12模型組 8 89.69±8.71a 102.48±9.75a 110.89±10.83a 122.47±12.05a阿侖膦酸鈉組 10 91.22±9.15a 73.25±7.63b 66.55±6.39b 58.54±5.08b骨病回生丸低劑量組 9 90.37±9.10a 80.15±8.36b 71.77±6.53b 62.52±5.89b骨病回生丸中劑量組 10 89.97±9.50a 74.20±8.12b 66.97±6.52b 59.12±5.18b骨病回生丸高劑量組 9 90.74±9.08a 68.58±6.90b 60.43±6.11b 50.75±6.14空白對(duì)照組 8 45.47±4.85 44.88±5.08 45.30±4.96 45.07±6.b

3.3 骨病回生丸對(duì)激素性股骨頭壞死大鼠股骨組織TLR4mRNA、NF－κB m RNA、TNF－αm RNA、IL－6 m RNA相對(duì)表達(dá)量的影響與空白對(duì)照組比較，模型組大鼠股骨組織中TLR4 mRNA、NF－κB mRNA、TNF－αmRNA、IL－6 mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，阿侖膦酸鈉組和骨病回生丸給藥組股骨組織中TLR4 mRNA、NF－κB mRNA、TNF－αmRNA、IL－6 mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著降低（P＜0.05）。見表5。

表3 骨病回生丸對(duì)激素性股骨頭壞死大鼠血清中TNF－α水平的影響 （±s，ng·L－1）

表3 骨病回生丸對(duì)激素性股骨頭壞死大鼠血清中TNF－α水平的影響 （±s，ng·L－1）

注：與空白對(duì)照組比較，a P＜0.05；與模型組比較，b P＜0.05

組別 n TNF－α干預(yù)前 干預(yù)1周 干預(yù)2周 干預(yù)4周12模型組 8 59.75±5.89a 78.74±7.96a 101.33±10.20a 132.29±15.96a阿侖膦酸鈉組 10 60.22±5.96a 49.74±4.98b 40.02±4.10b 31.28±4.15b骨病回生丸低劑量組 9 59.14±5.77a 54.55±5.08b 46.41±4.93b 40.35±4.17b骨病回生丸中劑量組 10 59.47±5.53a 50.11±4.79b 40.19±4.22b 30.97±4.24b骨病回生丸高劑量組 9 60.35±6.02a 41.04±4.83b 32.01±4.05b 20.18±3.15空白對(duì)照組 8 11.48±2.02 11.94±2.10 11.85±2.07 11.55±2.b

表5 骨病回生丸對(duì)激素性股骨頭壞死大鼠股骨組織TLR4 mRNA、NF－κB mRNA、TNF－αmRNA、IL－6 m RNA相對(duì)表達(dá)量的影響 （±s）

表5 骨病回生丸對(duì)激素性股骨頭壞死大鼠股骨組織TLR4 mRNA、NF－κB mRNA、TNF－αmRNA、IL－6 m RNA相對(duì)表達(dá)量的影響 （±s）

注：與空白對(duì)照組比較，a P＜0.05；與模型組比較，b P＜0.05

組別 n TLR4 mRNA NF－κB mRNA TNF－αmRNA IL－6 mRNA空白對(duì)照組0.52±0.07 0.68±0.09 0.71±0.10 0.59±0.08模型組 3 1.45±0.19a 1.53±0.17a 1.62±0.17a 1.60±0.17a阿侖膦酸鈉組 3 0.95±0.15b 1.01±0.12b 1.07±0.13b 1.18±0.12b骨病回生丸低劑量組 3 1.18±0.15b 1.30±0.14b 1.34±0.15b 1.30±0.15b骨病回生丸中劑量組 3 0.93±0.14b 0.98±0.13b 1.09±0.13b 1.16±0.11b骨病回生丸高劑量組 3 0.76±0.12b 0.79±0.11b 0.85±0.12b 0.89±0.14 3 b

3.4 骨病回生丸對(duì)激素性股骨頭壞死大鼠股骨組織TLR4、NF－κB、TNF－α、IL－6及p－NF－κB蛋白表達(dá)水平的影響與空白對(duì)照組比較，模型組大鼠股骨組織TLR4、NF－κB、TNF－α、IL－6及p－NF－κB蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，阿侖膦酸鈉組和骨病回生丸給藥組股骨組織TLR4、NF－κB、TNF－α、IL－6及p－NF－κB蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著下降（P＜0.05）。見圖2、表6。

圖2 骨病回生丸對(duì)激素性股骨頭壞死大鼠股骨組織

表6 骨病回生丸對(duì)激素性股骨頭壞死大鼠股骨組織TLR4、NF－κB、TNF－α、IL－6及p－NF－κB蛋白表達(dá)水平的影響 （±s）

表6 骨病回生丸對(duì)激素性股骨頭壞死大鼠股骨組織TLR4、NF－κB、TNF－α、IL－6及p－NF－κB蛋白表達(dá)水平的影響 （±s）

注：與空白對(duì)照組比較，a P＜0.05；與模型組比較，b P＜0.05

組別 n TLR4 NF－κB TNF－α IL－6 p－NF－κB 10±0.03模型組 3 0.35±0.07a 0.49±0.09a 0.45±0.04a 0.51±0.06a 0.33±0.05a阿侖膦酸鈉組 3 0.24±0.03b 0.27±0.04b 0.25±0.04b 0.26±0.04b 0.22±0.04b骨病回生丸低劑量組 3 0.30±0.05b 0.32±0.05b 0.31±0.04b 0.30±0.04b 0.28±0.04b骨病回生丸中劑量組 3 0.25±0.04b 0.27±0.05b 0.26±0.05b 0.27±0.05b 0.23±0.05b骨病回生丸高劑量組 3 0.15±0.03b 0.19±0.04b 0.18±0.03b 0.16±0.04b 0.13±0.03空白對(duì)照組 3 0.11±0.03 0.12±0.03 0.09±0.03 0.09±0.03 0.b

4 討論

長(zhǎng)期應(yīng)用激素類藥物可導(dǎo)致脂質(zhì)代謝紊亂，血脂處于較高水平，血液黏滯性增加而流動(dòng)性減小。股骨頭因血供不豐富，容易發(fā)生血供障礙，易出現(xiàn)股骨頭壞死現(xiàn)象。而脂代謝紊亂也可影響骨代謝，導(dǎo)致骨形成減少，升高股骨頭壞死的發(fā)病率［8－10］。臨床上針對(duì)激素性股骨頭壞死多采用藥物保守治療或手術(shù)治療，阿侖膦酸鈉是常用的改善骨代謝的藥物，雖有一定作用，但綜合效果不佳。手術(shù)治療可對(duì)機(jī)體造成嚴(yán)重創(chuàng)傷，再加上術(shù)后恢復(fù)緩慢，費(fèi)用高，具有一定局限性。因而，迫切需要探討合理、可行的治療方案。

大腸桿菌內(nèi)毒素腹腔注射聯(lián)合臀部肌肉注射甲潑尼龍琥珀酸鈉是目前常用的激素性股骨頭壞死的建模方法，其中大腸桿菌內(nèi)毒素腹腔注射可影響脂代謝，臀部肌肉注射甲潑尼龍琥珀酸鈉則是直接利用激素誘導(dǎo)發(fā)揮作用，二者配合可縮短激素性股骨頭壞死的發(fā)病時(shí)間，提高建模成功率［11］。本研究中，HE染色發(fā)現(xiàn)造模大鼠出現(xiàn)骨小梁稀疏、結(jié)構(gòu)紊亂，骨細(xì)胞壞死，空骨陷窩數(shù)量增多，成骨細(xì)胞數(shù)目減少，脂肪空泡數(shù)目增多等典型激素性股骨頭壞死的病理表現(xiàn)，證實(shí)建模成功，表明該方法可行。

激素性股骨頭壞死不僅可導(dǎo)致骨形成減少，還可出現(xiàn)骨組織炎性損傷。骨病回生丸由三七、土鱉蟲、沒藥、丹參等中藥制成，三七可消腫定痛、活血化瘀，土鱉蟲可續(xù)筋接骨、逐血化瘀，丹參祛瘀活血、涼血消腫，沒藥消腫止痛、活血生肌，全蝎通絡(luò)止痛，穿山甲祛風(fēng)定驚、化瘀散結(jié)，黨參健脾益肺、養(yǎng)血生津，當(dāng)歸補(bǔ)血活血，鱉甲軟堅(jiān)散結(jié)，黃芪利尿生肌、托毒排膿、補(bǔ)氣固表，蜈蚣通絡(luò)鎮(zhèn)痛、熄風(fēng)鎮(zhèn)痙、攻毒散結(jié)，全方合用，行通經(jīng)活絡(luò)、補(bǔ)氣養(yǎng)血、活血化瘀之效［12］。現(xiàn)代藥理研究指出，三七中的有效成分有助于控制機(jī)體炎癥反應(yīng)，減輕組織炎性損傷［13］；丹參中的有效成分可改善骨代謝，促進(jìn)骨形成［14］。研究顯示，骨病回生丸治療激素性股骨頭壞死有助于改善患者的脂代謝指標(biāo)，減輕炎癥反應(yīng)［15］。本研究發(fā)現(xiàn)，與空白對(duì)照組比較，模型組大鼠血清中TLR4、TNF－α、IL－6的水平顯著升高；與模型組比較，阿侖膦酸鈉組和骨病回生丸給藥組大鼠血清中TLR4、TNF－α、IL－6的水平顯著下降，且骨病回生丸的作用呈明顯劑量依賴性。文獻(xiàn)表明，阿侖膦酸鈉可改善骨代謝，增強(qiáng)骨質(zhì)，抑制股骨細(xì)胞凋亡，減輕激素性股骨頭壞死病理狀況，降低血清TLR4、TNF－α、IL－6的水平［16］。而本研究結(jié)果顯示，骨病回生丸高劑量組的效果優(yōu)于阿侖膦酸鈉組，提示骨病回生丸在激素性股骨頭壞死臨床治療中有一定的可行性。

TLR4信號(hào)通路的過度激活與激素性股骨頭壞死的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。TLR4的結(jié)構(gòu)分為胞外域、跨膜域和胞內(nèi)域，其中胞外域是一段重復(fù)的亮氨酸序列，可介導(dǎo)病原體相關(guān)分子模式的識(shí)別，而胞內(nèi)域則 是 一 段 高 度 保 守 的 序 列［17－19］。TLR4可 使NF－κB復(fù)合物中的抑制成分磷酸化而脫顆粒，引起NF－κB持續(xù)活化和磷酸化，且NF－κB還受其他基因的調(diào)控，如蛋白激酶B等［20－21］?；罨腘F－κB可與κB序列特異性結(jié)合，促進(jìn)各種炎癥因子的轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)生級(jí)聯(lián)炎癥反應(yīng)，IL－6和TNF－α的表達(dá)水平升高，進(jìn)一步介導(dǎo)炎癥反應(yīng)［22－24］。報(bào)道指出，NF－κB屬于炎癥反應(yīng)中重要的轉(zhuǎn)錄因子，可調(diào)控成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞的功能，有助于維持骨穩(wěn)態(tài)，但是當(dāng)受到炎性反應(yīng)刺激后，TLR4過度活化，NF－κB持續(xù)激活，p－NF－κB水平增高，誘導(dǎo)TNF－α和IL－6的表達(dá)，從而對(duì)骨組織造成損害［25］。研究顯示，激素性股骨頭壞死患者血清中TLR4、TNF－α和IL－6水平較正常健康志愿者偏高，同時(shí)發(fā)現(xiàn)，激素性股骨頭壞死患者存在炎癥反應(yīng)，需予以控制［26］。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究顯示，抑制TLR4基因與蛋白的表達(dá)有助于減輕激素性股骨頭壞死大鼠股骨組織病理改變，促進(jìn)骨形成［27］。本研究中，模型組大鼠股骨組織中TLR4、NF－κB、TNF－α、IL－6基因和蛋白的表達(dá)水平及p－NF－κB的蛋白表達(dá)水平均高于空白對(duì)照組，而骨病回生丸給藥組相關(guān)蛋白和基因的表達(dá)水平均低于模型組，說明骨病回生丸可抑制激素性股骨頭壞死大鼠TLR4的過度表達(dá)，降低NF－κB、TNF－α、IL－6、p－NF－κB的表達(dá)水平，且骨病回生丸高劑量組的作用最佳。

綜上所述，骨病回生丸可明顯改善激素性股骨頭壞死，其作用機(jī)制可能與抑制機(jī)體炎癥反應(yīng)有關(guān)。