益氣健骨補(bǔ)腎法對(duì)股骨骨折模型大鼠的作用及機(jī)制研究*

郇義超，趙佳，魏迎亮

1.沈陽(yáng)市骨科醫(yī)院，遼寧 沈陽(yáng) 110044；2.遼寧電力中心醫(yī)院，遼寧 沈陽(yáng) 110006；3.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院，遼寧 沈陽(yáng) 110004

近年來(lái)，骨折創(chuàng)傷發(fā)病率呈逐年上升且年輕化趨勢(shì)。下肢骨折是外科骨折傷中最易發(fā)生的情況，其中股骨骨折在臨床中最為常見(jiàn)［1－2］。骨折愈合是一個(gè)多種細(xì)胞因子共同參與的極其復(fù)雜而又緩慢的過(guò)程。一般而言，多數(shù)急性骨折創(chuàng)傷及時(shí)接受常規(guī)治療后便能逐漸痊愈，但仍可能出現(xiàn)大段骨缺損及骨不連的現(xiàn)象，導(dǎo)致骨折創(chuàng)傷有較高的致殘率［3］。骨折創(chuàng)傷后可能出現(xiàn)的畸形愈合、延遲愈合或不愈合等情況［4］，對(duì)患者的身心、工作和生活產(chǎn)生巨大的影響。因此，如何加快骨折愈合、縮短治療周期，有效規(guī)避骨折愈合延遲或不愈合風(fēng)險(xiǎn)，降低骨折對(duì)患者帶來(lái)的不良影響是骨創(chuàng)傷中亟須解決的問(wèn)題。中醫(yī)治療骨折歷史悠久，主張筋骨并重、內(nèi)外兼治，療效顯著［5－6］。益氣健骨補(bǔ)腎方是中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院院內(nèi)協(xié)定處方，具有補(bǔ)腎壯骨、益氣活血化瘀的功效，治療股骨骨折臨床療效確切，但具體作用機(jī)制尚不明確。本研究從血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子－β1（transforming growth factor－β1，TGF－β1）角度出發(fā)探討益氣健骨補(bǔ)腎方治療大鼠股骨骨折的作用機(jī)制。

1 材料

1.1 動(dòng)物60只SPF級(jí)雄性SD大鼠，7～8周齡，體質(zhì)量（250±20）g，購(gòu)于遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)：SCXK（遼）2017－0001。飼養(yǎng)室溫度20～25℃，相對(duì)濕度50%～65%，自由飲水、進(jìn)食。本研究經(jīng)中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審查通過(guò)，倫理編號(hào)：ZGYKDX202009001。

1.2 藥物與試劑益氣健骨補(bǔ)腎方（熟地黃20 g，杜仲15 g，骨碎補(bǔ)15 g，淫羊藿15 g，山藥15 g，菟絲子15 g，龍骨15 g，紫丹參10 g，當(dāng)歸10 g，紅花10 g，茯苓10 g，獨(dú)活10 g，續(xù)斷10 g，川芎10 g，牛膝10 g，甘草10 g，沈陽(yáng)中藥飲片藥業(yè)有限公司，由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院中藥房提供）；辛伐他?。ㄉ綎|鑫齊藥業(yè)有限公司，規(guī)格：20 mg／片，國(guó)藥準(zhǔn)字：H20084420）；注射用青霉素鈉（河南新鄉(xiāng)華星藥廠，國(guó)藥準(zhǔn)字H41020817，規(guī)格：80萬(wàn)U）。水合氯醛（天津市瑞金特化學(xué)品有限公司，批號(hào)：20190324）；Ⅰ型膠原、bFGF、TGF－β1、VEGF、抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate resistant acid phosphatase，TRAP）、Ⅰ型膠原羧基端交聯(lián)肽（typeⅠcollagen cross－linked C－telopeptide，CTX）試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號(hào)：20200514、20200712、20200819、20200622、20191103、20200811）；堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、骨鈣素（osteocalcin，OC）ELISA試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：20191121、20200317）。

1.3 儀器ElectroForce 3200型生物材料實(shí)驗(yàn)儀（美國(guó)Instron公司）；TD－4M型離心機(jī)（離心半徑：12.5 cm，博科控股集團(tuán)有限公司）；BioTek aQuant型全自動(dòng)酶標(biāo)儀（上海坤肯生物化工有限公司）；PDiscovery QDR型雙能X線(xiàn)骨密度儀（美國(guó)Hologic公司）；WDS－200型數(shù)顯式電子試驗(yàn)機(jī)（濟(jì)南恒思盛大儀器有限公司），計(jì)算機(jī)X射線(xiàn)攝像儀（日本柯尼卡美能達(dá)公司）；TE2000型熒光顯微鏡（日本Nikon公司）；J－D200型生物顯微鏡（深圳拓天儀器設(shè)備有限公司）；OLYMPUS BX－51型骨組織形態(tài)計(jì)量?jī)x（美國(guó)BIOQUANT公司）。

2 方法

2.1 藥物制備取益氣健骨補(bǔ)腎方組方藥材，加入8倍量水，煎煮2次，趁熱過(guò)濾，合并濾液，濃縮至濃度為1 kg·L－1，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 分組、建模及給藥60只SD大鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、阿侖膦酸鈉組及益氣健骨補(bǔ)腎方低、中、高劑量組，每組10只。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，采用閉合骨折法制備股骨骨折模型［7］。具體如下：水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，克氏針自左股骨髁間凹處穿入髓腔后拔出，徒手折斷股骨中段，骨折后停止用力，避免移位，克氏針再次沿穿針點(diǎn)進(jìn)針到骨折遠(yuǎn)端，針尾埋于皮下并消毒。手術(shù)完成后，大鼠肌內(nèi)注射青霉素鈉100萬(wàn)U·kg－1預(yù)防感染，并采用X線(xiàn)判定造模是否成功。造模成功后第2天開(kāi)始藥物干預(yù)，阿侖膦酸鈉組以5 mg·kg－1劑量灌胃給予阿侖膦酸鈉溶液，益氣健骨補(bǔ)腎方各組給藥劑量按人和大鼠的體表面積比進(jìn)行折算，即益氣健骨補(bǔ)腎方低、中、高劑量組分別灌胃給予益氣健骨補(bǔ)腎方溶液2.5 g·kg－1、5.0 g·kg－1、10.0 g·kg－1，空白組和模型組給予生理鹽水灌胃，每天1次，連續(xù)15 d。由于操作不當(dāng)，阿侖膦酸鈉組和益氣健骨補(bǔ)腎方低劑量組大鼠各死亡2只，其余組大鼠死亡1只。

2.3 ELISA法檢測(cè)大鼠血清Ⅰ型膠原、bFGF、TGF－β1、VEGF的水平大鼠麻醉后心臟取血，2 000 r·min－1離心15 min，收集血清。嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書(shū)要求進(jìn)行操作，采用ELISA法檢測(cè)大鼠血清中Ⅰ型膠原、bFGF、TGF－β1、VEGF的水平。

2.4 骨轉(zhuǎn)化指標(biāo)測(cè)定嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，采用ELISA法檢測(cè)血清中TRAP、CTX、ALP、OC的水平。

2.5 雙能X線(xiàn)骨密度儀檢測(cè)大鼠股骨骨密度大鼠麻醉處死后，超凈臺(tái)剝離雙側(cè)股骨，清水沖洗，剔除軟組織，在體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇中4℃避光保存，雙能X線(xiàn)骨密度儀設(shè)置為2 cm階段測(cè)量大鼠股骨骨密度（bonemineral density，BMD）和組織礦物密度（tissue bonemineral density，TMD）。

2.6 骨組織形態(tài)計(jì)量?jī)x檢測(cè)大鼠骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)相關(guān)指標(biāo)大鼠麻醉處死后，超凈臺(tái)剝離雙側(cè)股骨，取股骨遠(yuǎn)端干骺端組織，骨組織形態(tài)計(jì)量?jī)x檢測(cè)骨小梁數(shù)量（number of trabecular bone，Tb.N）、骨小梁厚度（trabecular thickness，Tb.Th）、骨小梁面積百分?jǐn)?shù)（bone trabecular area percentage，TbAr%）、骨小梁分離度（bone trabecular separation，Tb.Sp）。

2.7 骨生物力學(xué)測(cè)量大鼠麻醉處死后，超凈臺(tái)剝離雙側(cè)股骨，紗布包裹置于生理鹽水中，－20℃保存。取大鼠股骨樣本采用數(shù)顯式電子試驗(yàn)機(jī)進(jìn)行三點(diǎn)彎曲實(shí)驗(yàn)，股骨放置試驗(yàn)機(jī)上，將立柱間長(zhǎng)度設(shè)置為22 mm，壓頭下壓速度2 mm·min－1，直至樣本斷折，測(cè)量大鼠股骨最大應(yīng)力、最大載荷和最大撓度。

2.8 HE染色觀察股骨組織病理變化取股骨上端標(biāo)本，4%多聚甲醛固定24 h，脫鈣1月，石蠟包埋，常規(guī)HE染色，顯微鏡下觀察股骨組織病理變化。

2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 22.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 益氣健骨補(bǔ)腎方對(duì)大鼠血清中Ⅰ型膠原、bFGF、TGF－β1、VEGF水平的影響與空白組比較，模型組大鼠血清中Ⅰ型膠原、bFGF、TGF－β1、VEGF的水平顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，各給藥組大鼠血清中Ⅰ型膠原、bFGF、TGF－β1、VEGF水平明顯升高（P＜0.05）；與阿侖膦酸鈉組比較，益氣健骨補(bǔ)腎方高劑量組大鼠血清中Ⅰ型膠原、bFGF、TGF－β1、VEGF的 水 平 顯 著 升 高（P＜0.05）。提示，益氣健骨補(bǔ)腎方可顯著升高股骨骨折模型大鼠血清中Ⅰ型膠原、bFGF、TGF－β1、VEGF的水平。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠血清中Ⅰ型膠原、bFGF、TGF－β1、VEGF的水平比較 （±s）

表1 各組大鼠血清中Ⅰ型膠原、bFGF、TGF－β1、VEGF的水平比較 （±s）

注：與空白組比較，*P＜0.05；與模型組比較，▲P＜0.05；與阿侖膦酸鈉組比較，▼P＜0.05

組別 n Ⅰ型膠原（ρ／μg·L－1） bFGF（ρ／ng·L－1） TGF－β1（ρ／ng·L－1） VEGF（ρ／ng·L－1）3.20±26.78模型組 9 14.65±0.93* 23.31±2.42* 100.07±11.45* 112.87±12.26*阿侖膦酸鈉組 8 57.04±2.02▲ 85.27±4.36▲ 151.74±17.29▲ 169.46±20.53▲益氣健骨補(bǔ)腎方低劑量組 8 49.63±2.78▲ 70.17±3.88▲ 138.75±15.32▲ 148.82±18.39▲益氣健骨補(bǔ)腎方中劑量組 9 66.85±3.26▲ 96.74±4.03▲ 173.68±18.26▲ 184.28±20.64▲益氣健骨補(bǔ)腎方高劑量組 9 84.48±3.63▲▼ 112.52±6.41▲▼ 200.59±20.02▲▼ 226.28±27.71▲▼空白組 9 113.49±14.21 126.75±11.89 234.86±25.47 36

3.2 益氣健骨補(bǔ)腎方對(duì)大鼠骨轉(zhuǎn)化指標(biāo)的影響與空白組比較，模型組大鼠血清中TRAP、CTX的水平顯著升高（P＜0.05），ALP、OC的水平顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，各給藥組大鼠血清中TRAP、CTX的水平顯著降低（P＜0.05），ALP、OC的水平顯著升高（P＜0.05）；與阿侖膦酸鈉組比較，益氣健骨補(bǔ)腎方高劑量組大鼠血清中TRAP、CTX的水平顯著降低，ALP、OC的水平顯著升高（P＜0.05）。提示，益氣健骨補(bǔ)腎方可顯著改善模型大鼠的骨轉(zhuǎn)化指標(biāo)，且效果優(yōu)于陽(yáng)性對(duì)照藥阿侖膦酸鈉。見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠骨轉(zhuǎn)化指標(biāo)比較 （±s）

表2 各組大鼠骨轉(zhuǎn)化指標(biāo)比較 （±s）

注：與空白組比較，*P＜0.05；與模型組比較，▲P＜0.05；與阿侖膦酸鈉組比較，▼P＜0.05

組別 n TRAP（ρ／μg·L－1） CTX（c／μmol·L－1） ALP（ρ／ng·L－1） OC（ρ／ng·L－1）6.78模型組 9 54.65±3.93* 193.31±43.42* 40.07±1.45* 239.97±30.26*阿侖膦酸鈉組 8 47.04±2.02▲ 30.27±4.36▲ 51.74±1.29▲ 291.46±20.53▲益氣健骨補(bǔ)腎方低劑量組 8 49.63±2.78▲ 34.17±4.88▲ 48.75±1.32▲ 278.82±18.39▲益氣健骨補(bǔ)腎方中劑量組 9 46.85±1.86▲ 26.74±4.03▲ 53.68±1.26▲ 300.28±21.64▲益氣健骨補(bǔ)腎方高劑量組 9 44.48±1.63▲▼ 21.52±3.41▲▼ 57.59±1.02▲▼ 311.28±17.71▲▼空白組 9 43.49±1.21 10.35±3.19 59.86±1.47 337.20±2

3.3 益氣健骨補(bǔ)腎方對(duì)大鼠骨密度指標(biāo)的影響與空白組比較，模型組大鼠BMD、TMD顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，各給藥組大鼠BMD、TMD顯著升高（P＜0.05）；與阿侖膦酸鈉組比較，益氣健骨補(bǔ)腎方高劑量組大鼠BMD、TMD顯著升高（P＜0.05）。提示，益氣健骨補(bǔ)腎方可顯著改善模型大鼠的骨密度相關(guān)指標(biāo)，且作用效果優(yōu)于陽(yáng)性對(duì)照藥阿侖膦酸鈉。見(jiàn)表3。

表3 各組大鼠股骨骨密度相關(guān)指標(biāo)比較（±s）

表3 各組大鼠股骨骨密度相關(guān)指標(biāo)比較（±s）

注：與空白組比較，*P＜0.05；與模型組比較，▲P＜0.05；與阿侖膦酸鈉組比較，▼P＜0.05

組別 n BMD／g·cm－2 TMD／g·cm－2 9 0.38±0.03 0.85±0.02模型組 9 0.23±0.02* 0.73±0.01*阿侖膦酸鈉組 8 0.29±0.02▲ 0.79±0.02▲益氣健骨補(bǔ)腎方低劑量組8 0.27±0.02▲ 0.77±0.01▲益氣健骨補(bǔ)腎方中劑量組9 0.31±0.01▲ 0.80±0.02▲益氣健骨補(bǔ)腎方高劑量組9 0.34±0.02▲▼0.82±0.02▲▼空白組

3.4 益氣健骨補(bǔ)腎方對(duì)大鼠股骨骨形態(tài)計(jì)量學(xué)相關(guān)指標(biāo)的影響與空白組比較，模型組大鼠Tb.Sp顯著升高（P＜0.05），Tb.N、Tb.Th、TbAr%顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，各給藥組大鼠Tb.Sp顯著降低（P＜0.05），Tb.N、Tb.Th、TbAr%顯著升高（P＜0.05）；與阿侖膦酸鈉組比較，益氣健骨補(bǔ)腎方高劑量組Tb.Sp顯著降低（P＜0.05），Tb.N、Tb.Th、TbAr%顯著升高（P＜0.05）。提示，益氣健骨補(bǔ)腎方可顯著改善模型大鼠的股骨骨形態(tài)計(jì)量學(xué)相關(guān)指標(biāo)，且作用效果優(yōu)于陽(yáng)性對(duì)照藥阿侖膦酸鈉。見(jiàn)表4。

表4 各組大鼠股骨骨形態(tài)計(jì)量學(xué)相關(guān)指標(biāo)比較 （±s）

表4 各組大鼠股骨骨形態(tài)計(jì)量學(xué)相關(guān)指標(biāo)比較 （±s）

注：與空白組比較，*P＜0.05；與模型組比較，▲P＜0.05；與阿侖膦酸鈉組比較，▼P＜0.05

組別 n TbAr% Tb.N／個(gè)·mm－2 Tb.Th（l／μm） Tb.Sp（l／mm）9 23.35±5.78 5.69±0.42 79.36±8.57 0.20±0.01模型組 9 15.59±4.41* 4.28±0.63* 50.71±9.32* 0.31±0.03*阿侖膦酸鈉組 8 20.03±5.16▲ 5.11±0.45▲ 64.82±7.91▲ 0.25±0.02▲益氣健骨補(bǔ)腎方低劑量組 8 18.97±5.42▲ 4.93±0.54▲ 60.26±8.13 0.26±0.01▲益氣健骨補(bǔ)腎方中劑量組 9 20.54±5.17▲ 5.16±0.48▲ 68.34±8.38▲ 0.23±0.02▲益氣健骨補(bǔ)腎方高劑量組 9 21.79±6.18▲▼ 5.32±0.46▲▼ 71.49±7.48▲▼ 0.22±0.01▲▼空白組

3.5 益氣健骨補(bǔ)腎方對(duì)大鼠骨生物力學(xué)的影響與空白組比較，模型組大鼠股骨的最大應(yīng)力、最大載荷和最大撓度均顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，各給藥組大鼠股骨的最大應(yīng)力、最大載荷和最大撓度顯著升高（P＜0.05）；與阿侖膦酸鈉組比較，益氣健骨補(bǔ)腎方高劑量組大鼠股骨的最大應(yīng)力、最大載荷和最大撓度顯著升高（P＜0.05）。提示，益氣健骨補(bǔ)腎方可顯著改善模型大鼠股骨的骨生物力學(xué)相關(guān)指標(biāo)，且作用效果優(yōu)于陽(yáng)性對(duì)照藥阿侖膦酸鈉。見(jiàn)表5。

表5 各組大鼠骨生物力學(xué)指標(biāo)比較 （±s）

表5 各組大鼠骨生物力學(xué)指標(biāo)比較 （±s）

注：與空白組比較，*P＜0.05；與模型組比較，▲P＜0.05；與阿侖膦酸鈉組比較，▼P＜0.05

組別 n 最大應(yīng)力（P／MPa） 最大載荷／N 最大撓度（l／mm）13.96±0.54 150.06±19.85 1.82±0.33模型組 9 9.58±0.69* 124.64±16.96* 1.27±0.24*阿侖膦酸鈉組 8 10.65±0.44▲ 134.58±17.17▲ 1.48±0.31▲益氣健骨補(bǔ)腎方低劑量組 8 10.39±0.41▲ 135.88±16.21▲ 1.49±0.28▲益氣健骨補(bǔ)腎方中劑量組 9 11.04±0.58▲ 138.23±16.16▲ 1.56±0.26▲益氣健骨補(bǔ)腎方高劑量組 9 11.29±0.47▲▼ 142.63±17.82▲▼ 1.69±0.27▲▼空白組9

3.6 益氣健骨補(bǔ)腎方對(duì)大鼠骨組織形態(tài)的影響空白組大鼠股骨組織形態(tài)正常；模型組大鼠股骨組織局部血腫機(jī)化，骨膜增厚，成骨細(xì)胞數(shù)量較少，可見(jiàn)大量軟骨細(xì)胞；各給藥組大鼠股骨組織局部血腫改善，骨膜變薄，軟骨細(xì)胞減少，成骨細(xì)胞數(shù)量明顯增多，骨折愈合情況較好。見(jiàn)圖1。

圖1 各組大鼠骨組織形態(tài)比較（HE染色，×100）

4 討論

中醫(yī)認(rèn)為，骨折愈合為“祛瘀、新生和骨合”的過(guò)程［6］?！饵S帝內(nèi)經(jīng)》認(rèn)為“血不活而骨不能接”，故活血化瘀是治療骨折的主要方法［8］。腎藏精，主骨生髓，髓能養(yǎng)腦、充骨、化生血液。腎精充實(shí)，則骨髓化生有源，筋骨堅(jiān)韌，強(qiáng)健有力；反之，腎精虧虛，則骨髓乏源，骨失濡養(yǎng)，脆弱無(wú)力。因此，骨折的病機(jī)主要為腎虛精虧、瘀血阻滯，臨床治療宜以補(bǔ)腎壯骨為主，補(bǔ)肝益氣、活血化瘀為輔。益氣健骨補(bǔ)腎方中熟地黃補(bǔ)血養(yǎng)陰、填精益髓；淫羊藿、菟絲子和杜仲補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨、益精；續(xù)斷和骨碎補(bǔ)補(bǔ)肝腎、強(qiáng)骨筋；獨(dú)活通痹止痛；丹參、紅花、當(dāng)歸、牛膝、川芎活血化瘀；甘草補(bǔ)脾氣、調(diào)和諸藥，全方共奏補(bǔ)腎壯骨、活血化瘀功效?，F(xiàn)代研究證實(shí)，骨碎補(bǔ)總黃酮可激活成骨細(xì)胞，明顯增加骨密度，促進(jìn)蛋白多糖合成進(jìn)而促進(jìn)鈣化，促進(jìn)骨生長(zhǎng)［9］；牛膝總皂苷可升高血清骨鈣素和堿性磷酸酶水平，改善骨代謝［10］；續(xù)斷可以增加骨密度，改善骨小梁微結(jié)構(gòu)，提高股骨強(qiáng)度，調(diào)節(jié)骨形成和骨吸收指標(biāo)，降低骨轉(zhuǎn)換率，降低骨折風(fēng)險(xiǎn)［11］；杜仲能降低血鈣水平，升高血磷水平，促進(jìn)骨折斷端礦物質(zhì)的沉積，促進(jìn)骨折愈合［12］；丹參可顯著增加骨密度，降低磷含量［13］。

膠原是細(xì)胞外基質(zhì)的一種結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)，主要存在于結(jié)締組織中，其中，Ⅰ型膠原是骨骼有機(jī)質(zhì)的重要組成部分，主要在骨骼和結(jié)締組織內(nèi)發(fā)揮作用，對(duì)骨架的形成和骨架完整性的保持具有重要意義［14－16］。本研究發(fā)現(xiàn)，股骨骨折模型大鼠血清中Ⅰ型膠原的水平顯著降低；給予益氣健骨補(bǔ)腎方干預(yù)后，大鼠血清中Ⅰ型膠原的水平顯著升高；說(shuō)明益氣健骨補(bǔ)腎方可通過(guò)改善膠原蛋白，促進(jìn)股骨骨折愈合。

bFGF是FGF2基因編碼的生長(zhǎng)因子和信號(hào)蛋白［17］，對(duì)成骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞的生長(zhǎng)具有重要作用［18］。bFGF可與成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體、肝素結(jié)合生長(zhǎng)因子－2和內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子－2特異結(jié)合并發(fā)揮作用［19－20］。正常情況下，bFGF存在于基底膜和血管內(nèi)皮下細(xì)胞外基質(zhì)中，當(dāng)機(jī)體發(fā)生損傷時(shí)，bFGF激活，介導(dǎo)形成新血管，促進(jìn)骨折愈合。此外，研究顯示，bFGF還能與bFGF－1受體結(jié)合，促使成骨前細(xì)胞加速增殖，從而促進(jìn)受損骨骼的愈合［21］。本研究顯示，股骨骨折模型大鼠血清中bFGF的水平顯著降低；給予益氣健骨補(bǔ)腎方干預(yù)后，大鼠血清中bFGF的水平顯著升高；說(shuō)明益氣健骨補(bǔ)腎方可提高模型大鼠血清中bFGF的水平。

骨痂中的TGF－β1同樣是參與骨愈合和骨生成的一種重要細(xì)胞因子，TGF－β1與受體結(jié)合后，可激活下游底物和調(diào)節(jié)蛋白，促進(jìn)細(xì)胞的分化、增殖［22－23］。骨 折 愈 合 過(guò) 程 中 蛋 白 復(fù) 合 體 激 活TGF－β1，使TGF－β1高表達(dá)［24－25］。高氧狀態(tài)下，VEGF可影響骨折修復(fù)進(jìn)程。研究顯示，VEGF可提高骨折大鼠Ⅷ因子相關(guān)抗原含量，促進(jìn)骨組織供血體系重建［26－27］。本研究顯示，股骨骨折模型大鼠血清中TGF－β1、VEGF的水平顯著降低；給予益氣健骨補(bǔ)腎方干預(yù)后，大鼠血清中TGF－β1、VEGF水平均明顯升高；說(shuō)明益氣健骨補(bǔ)腎方可提高模型大鼠血清中TGF－β1和VEGF的水平。

CTX－1是I型膠原降解產(chǎn)物，其血清水平能特異性反映破骨細(xì)胞活性。TRAP為破骨細(xì)胞分泌的非膠原蛋白，與骨吸收水平成正相關(guān)［28－30］。ALP為堿性磷酸酶，OC為骨基質(zhì)標(biāo)志物，兩者均由成骨細(xì)胞產(chǎn)生，反映骨形成狀態(tài)。骨密度是反映骨量的有效指標(biāo)［31－33］。骨強(qiáng)度、骨結(jié)構(gòu)、骨量等骨生物力學(xué)指標(biāo)是骨組織結(jié)構(gòu)和功能的有效指標(biāo)，通過(guò)剛度和硬度可反映骨折風(fēng)險(xiǎn)程度。骨生物力學(xué)性能降低為骨折的重要原因，也是評(píng)價(jià)藥物療效的重要指標(biāo)。本研究發(fā)現(xiàn)，股骨骨折模型大鼠TRAP、CTX－1、Tb.Sp的水平顯著升高，ALP、OC、BMD、TMD、Tb.N、Tb.Th、TbAr%的水平及股骨的最大應(yīng)力、最大載荷和最大撓度顯著降低；給予益氣健骨補(bǔ)腎方干預(yù)后，大鼠TRAP、CTX－1、Tb.Sp的水平顯著降低，而ALP、OC、BMD、TMD、Tb.N、Tb.Th、TbAr%的水平及股骨的最大應(yīng)力、最大載荷和最大撓度均顯著升高；提示，益氣健骨補(bǔ)腎方可顯著改善模型大鼠的骨轉(zhuǎn)化、骨密度、股骨骨形態(tài)計(jì)量學(xué)及骨生物力學(xué)相關(guān)指標(biāo)。

綜上所述，益氣健骨補(bǔ)腎方能顯著升高股骨骨折大鼠的Ⅰ型膠原、bFGF、TGF－β1、VEGF，改善骨轉(zhuǎn)化，增加骨密度，改善骨顯微結(jié)構(gòu)，提升骨生物力學(xué)性能，促進(jìn)骨折愈合。