西葫蘆種子結(jié)構(gòu)與發(fā)芽的關(guān)系以及提高種子質(zhì)量的處理技術(shù)

王德欣 吳 萍,3* 季延海 鐘啟文 宋順華 張海軍,3 劉明池, 李海真,3

(1.北京市農(nóng)林科學院 蔬菜研究中心/農(nóng)業(yè)部華北地區(qū)園藝作物生物學與種質(zhì)創(chuàng)制重點實驗室/農(nóng)業(yè)部都市農(nóng)業(yè)(北方)重點實驗室/蔬菜種質(zhì)改良北京市重點實驗室，北京 100097；2.青海大學 農(nóng)林科學院，西寧 810016；3.京研益農(nóng)(北京)種業(yè)科技有限公司，北京 100097)

西葫蘆(CucurbitapepoL.)是葫蘆科南瓜屬蔬菜，原產(chǎn)北美洲南部，又稱美洲南瓜，具有生育期短、耐貯運和高產(chǎn)等優(yōu)點，是目前設施生產(chǎn)面積僅次于黃瓜的一種重要的瓜類蔬菜[1-2]。在西葫蘆生產(chǎn)中，種子質(zhì)量是穩(wěn)產(chǎn)和高產(chǎn)的重要基礎(chǔ)，授粉次數(shù)、種瓜節(jié)位、成熟度和環(huán)境等因素均會影響其發(fā)育成熟和種子活力[3-4]，從而影響幼苗的生長和發(fā)育，進而影響經(jīng)濟效益。

精選處理通過去除死種子和劣種子而有效提高種子質(zhì)量，該處理技術(shù)應用的前提是根據(jù)種子批特性找到適宜的精選方法。精選方法的建立主要基于找到種子批中死種子、劣種子與正常種子在大小、形狀、密度、表面質(zhì)地或顏色等物理特性方面存在的主要差異[5-8]。有多種方法可以測定單粒種子物理特性之間的差異，其中X-射線成像分析技術(shù)是比較成功的方法之一，可用于非破壞性評價種子內(nèi)部或外部特征。將經(jīng)過結(jié)構(gòu)特征分析的種子再進行發(fā)芽試驗，可以建立兩者之間的對應關(guān)系，從而有可能形成適宜的精選方法，用于提高種子質(zhì)量[9-10]。

引發(fā)處理是一種能有效提高種子萌發(fā)特性的技術(shù)，已被證明具有提高種子萌發(fā)速度和出苗一致性、克服種子萌發(fā)障礙和提高種子活力等多方面的效果，并且對多種蔬菜種子有效[11-14]。引發(fā)處理的實施可以采取不同的方法，不同種子適宜的方法和實施條件可能不同，需要確認有效的方法才能保證處理效果[15-16]。

本研究通過軟X射線成像法研究了西葫蘆種子結(jié)構(gòu)與發(fā)芽特性的關(guān)系，建立了一種依據(jù)X射線成像結(jié)果對西葫蘆種子進行精選和分類的方法；通過研究比重選和引發(fā)處理對西葫蘆種子萌發(fā)特性及成苗效果的影響，建立了一套提高西葫蘆種子質(zhì)量的綜合處理技術(shù)，以期為種子企業(yè)在種子質(zhì)量提升方面提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試西葫蘆種子品種為‘青葫1號’，由青海大學農(nóng)林科學院提供。

1.2 試驗方法

1.2.1軟X-射線成像分析

用軟X-射線儀(SOFTEX，ISTV-25-1，日本)對每粒種子進行2次成像(由于種子偏大，機器不能一次全覆蓋)，分別觀察胚根尖和子葉邊緣的形態(tài)，通過拼接圖觀察種子總結(jié)構(gòu)形態(tài)(拼圖只進行了亮度和對比度調(diào)節(jié)，未做其它修飾)。用ZET-1軟件逐粒測量子葉最寬處邊緣至種皮邊緣的直線距離(兩邊距離測量距離大的一邊)，用字母D表示，作為種子平面飽滿度指標。按照測定順序進行單粒種子編號，測定后的種子用于紙間發(fā)芽試驗。

1.2.2種子比重選

用種子精選機(KM，KIYA SEISAKUSHO，日本)進行比重選，風量選擇9。根據(jù)種子比重差異分為2個部分，比重大的部分標記為大種子，比重小的部分標記為小種子。

1.2.3種子引發(fā)

在容器中加入種子重量20%的1%硝酸鉀溶液，混合均勻后放置在20 ℃下，每天攪拌1～2次，每次攪拌30 s，分別在處理5、6和7 d后取出，室溫晾干，分別標記為T5、T6和T7。

1.2.4種子發(fā)芽

本研究共采用3種方法進行種子發(fā)芽試驗，分別為紙間發(fā)芽、沙床發(fā)芽和穴盤育苗。紙間發(fā)芽方法用于觀察經(jīng)過軟X-射線成像后的帶有序號標記的單粒種子發(fā)芽情況，研究種子結(jié)構(gòu)與萌發(fā)特性的關(guān)系；沙床發(fā)芽方法用于實驗室內(nèi)標準發(fā)芽結(jié)果檢測；穴盤育苗方法是為了使種子發(fā)芽及幼苗生長狀況與實際生產(chǎn)更加接近，在更符合實際生產(chǎn)條件的情況下統(tǒng)計各項生長指標，提升數(shù)據(jù)說服力。發(fā)芽試驗中用作對照(CK)的種子都是未經(jīng)任何處理的干種子。3種發(fā)芽方法詳述如下：

紙間發(fā)芽：采用30.5 cm×46 cm的發(fā)芽紙(Anchor，美國)，每張紙加水32 mL，試驗設置CK、大種子和小種子3個處理，每處理20個重復，每個重復10粒種子，并在紙上將種子編號。將種子置于光照培養(yǎng)箱內(nèi)，25 ℃恒溫，8 h光照條件發(fā)芽，第8天根據(jù)發(fā)芽情況分別統(tǒng)計記錄每個處理正常種子、畸形種子和死種子數(shù)量。

沙床發(fā)芽：在發(fā)芽盒中進行，每盒加1 kg沙和140 g水，混勻后取出280 g濕沙覆蓋在種子表面。比重選試驗設置CK、大種子和小種子3個處理，第4天統(tǒng)計發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)，第8天統(tǒng)計發(fā)芽率；種子引發(fā)試驗設置CK、T5、T6和T7 4個處理，第4天統(tǒng)計發(fā)芽勢，第8天統(tǒng)計發(fā)芽率，記錄畸形苗數(shù)量，同時逐粒測量子葉長度和子葉寬度，每100株測1次干重。以上試驗均設置8個重復，每個重復50粒種子。25 ℃恒溫，8 h光照條件下發(fā)芽，子葉出土2/3以上計為發(fā)芽。

穴盤育苗：將經(jīng)過比重選并引發(fā)7 d的種子(T7大種子)和CK種子進行穴盤育苗試驗。采用72孔穴盤，每孔播種1粒，3次重復，基質(zhì)采用草炭∶蛭石∶珍珠巖(體積比2∶1∶1)混合，播種后置于玻璃日光溫室統(tǒng)一管理，白天溫度不高于30 ℃，晚上溫度不低于20 ℃。分別于第16、25和32天隨機選取6株測定幼苗生長指標和壯苗指數(shù)。

1.3 測定指標

發(fā)芽勢(率)=供試種子的發(fā)芽數(shù)/供試種子數(shù)×100%

(1)

式中：發(fā)芽勢在第4天統(tǒng)計，%；發(fā)芽率在第8天統(tǒng)計，%。

發(fā)芽指數(shù)(GI)=ΣGt/Dt

(2)

式中：Gt為在第t日的發(fā)芽數(shù)，粒；Dt為發(fā)芽天數(shù)，d。

壯苗指數(shù)=(莖粗/株高+根干重/地上部干重)×全株干重

(3)

式中：莖粗為莖基部最粗部分的直徑，cm；株高為莖基部至生長點的高度，cm；干重為100 ℃殺青0.5 h，然后80 ℃烘干1 h后的重量，g。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計及分析

數(shù)據(jù)差異顯著性分析采用SPSS 17.0統(tǒng)計分析軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 軟X-射線法對不同類別種子的鑒定

2.1.1不同類別種子內(nèi)部形態(tài)的觀察

取比重選后的大種子、小種子和對照種子各200粒，逐粒編號標記并采集軟X-射線成像圖，然后將上述600粒種子按照順序進行紙間發(fā)芽試驗，根據(jù)發(fā)芽結(jié)果把600粒種子分為3個類型：正常種子、畸形種子和死種子(GB/T 3543.4—1995)。分析3類種子對應成像圖的結(jié)構(gòu)特點。

正常種子結(jié)構(gòu)(圖1(a))的特點為：胚結(jié)構(gòu)正常，種子飽滿，子葉邊緣清晰(說明子葉有一定厚度)。600粒種子中利用發(fā)芽試驗法鑒定出399粒正常種子，利用軟X-射線成像法鑒定，符合上述特征的有392粒，有7粒不符合，識別率為98.2%(表1)。

發(fā)芽試驗法鑒定出畸形種子共22粒，軟X-射線成像法鑒定出6粒存在明顯的結(jié)構(gòu)異常，如(圖1(g)～(h))胚根偏薄，識別率為27.3%。多數(shù)種子結(jié)構(gòu)與正常種子相似，不能區(qū)分。

死種子的結(jié)構(gòu)具有以下1種或幾種特點：胚結(jié)構(gòu)不規(guī)則，明顯畸形(圖1(b)～(c))；胚根部位畸形(圖1(e)～(f))；子葉基本沒有發(fā)育或厚度顯著不夠(圖1(d))。對比分析發(fā)芽試驗法鑒定出的全部179粒死種子，利用軟X-射線成像法鑒定，符合上述特征的有118粒，識別率為65.9%。

(a)正常種子；(b)～(f)死種子；(g)～(h)畸形種子。紅色箭頭表示種子平面飽滿度。(a) Normal seeds; (b)-(f) Dead seeds； (g)-(h) Abnormal seeds. Red arrows represent seed plane fullness.圖1 西葫蘆種子軟X-射線成像圖Fig.1 The soft X-ray image of zucchini seeds

全部測定的600粒種子，按照上面描述的結(jié)構(gòu)特點，以發(fā)芽試驗法鑒定結(jié)果為參考，軟X-射線成像法能夠進行正確分類的3類種子合計516粒，正確識別率為86.0%(表1)。

表1 發(fā)芽試驗法與軟X-射線成像法對3類種子判定結(jié)果比較Table 1 Comparison of germination test and soft X-ray imaging method for the detection of the three types of seeds

2.1.2種子平面飽滿度與種子發(fā)芽特性的關(guān)系

除了上述平面形態(tài)的差異，一些死種子和畸形種子還表現(xiàn)出在子葉厚度和寬度上的不足。由于所用機器的限制，不能準確分析子葉厚度。對3類種子平面飽滿度D值進行測定，結(jié)果表明正常種子平均D值為1.09 mm，畸形種子平均D值為1.16 mm，比正常種子高6.4%，死種子平均D值為1.28 mm，比正常種子高17.4%。以上結(jié)果表明，高質(zhì)量種子即正常種子飽滿度較高，平均D值最小，低于畸形種子和死種子平均D值，自由空間最小(表2)。因此，平面飽滿度D值可以作為評價種子質(zhì)量高低的指標。死種子和畸形種子平均D值較高，說明其在生長過程飽滿度不足，可以采用比重選等方法將其分離。

表2 不同類型種子平面飽滿度比較Table 2 The comparation of the seed plane plumpness inside among three types of seeds

2.2 比重選對西葫蘆種子質(zhì)量的影響

用沙床發(fā)芽方法測定比重選后得到了大、小種子和CK的發(fā)芽特性。結(jié)果表明，比重選后得到的大種子的發(fā)芽勢、發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)均比CK高(表3)。而應該棄去的小種子發(fā)芽勢、發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)明顯低于CK和大種子，種子質(zhì)量差。以上結(jié)果表明可以通過比重選將活力低和質(zhì)量差的種子分開，使種子質(zhì)量得到提升。

表3 比重選對西葫蘆種子發(fā)芽的影響Table 3 The effects of specific gravity selection on the Zucchini seed germination

2.3 種子引發(fā)對種子發(fā)芽及種苗質(zhì)量的影響

3種不同條件的引發(fā)處理均能促進種子萌發(fā)，促進幼苗生長。表4為置床8 d后的統(tǒng)計結(jié)果，沙床發(fā)芽試驗結(jié)果表明，與對照相比，不同引發(fā)處理能夠提高發(fā)芽勢和發(fā)芽率，其中發(fā)芽勢差異顯著，對幼苗生長影響明顯，子葉長度、寬度和干重均顯著提高。

表4 不同引發(fā)處理對西葫蘆種子發(fā)芽及幼苗生長的影響Table 4 The effects of different seed priming treatments on the seed germination and seedling growth

其中以T7處理結(jié)果最好，發(fā)芽勢較對照提高14.00%，發(fā)芽率提高6.50%，子葉長度增加9.09%，子葉寬度增加16.27%，植株干重增加7.71%，畸形苗數(shù)量顯著下降，壯苗效果明顯。

2.4 比重選與T7引發(fā)處理對西葫蘆種子穴盤育苗的影響

為了檢驗比重選和引發(fā)處理在實際生產(chǎn)應用中的效果，將比重選后的大種子進行T7引發(fā)處理(T7引發(fā)處理效果最好，處理后的種子標記為T7大種子)。將CK和T7大種子進行穴盤育苗試驗。結(jié)果顯示，與CK相比，T7大種子在出苗(表5)和幼苗生長(表6)上的優(yōu)勢明顯。處理后的種子出苗快，10 d出苗率46.67%，比對照提高1倍，15 d出苗率達到90.56%，較對照提高26.12%(表5)。

表5 T7大種子處理對西葫蘆穴盤出苗的影響Table 5 The effects of specific gravity selection and T7 priming on the zucchini plug seedling emergence %

T7大種子不僅出苗率高，在幼苗生長特性上也能體現(xiàn)處理效果。T7大種子種苗粗壯，表現(xiàn)在前期莖粗和后期株高優(yōu)于對照(表6)。16 d幼苗株高是對照的83.72%，莖粗比對照高8.68%，25 d幼苗株高已經(jīng)達到對照97.97%，但莖粗比對照高13.06%。隨著幼苗葉片增多，光合作用增強，幼苗營養(yǎng)生長加快，32 d的幼苗株高比對照高32.41%，莖粗則與對照無明顯差異。比重選加引發(fā)處理還提高了西葫蘆幼苗的鮮重、干重和壯苗指數(shù)(表6)，T7大種子種苗地上部和地下部鮮重分別較對照提高13.50%～38.97%和6.54%～43.75%，地上部和地下部干重分別較對照提高0.65%～28.05%和2.80%～36.58%。通過以上試驗表明，經(jīng)過比重選加T7引發(fā)處理后的種子出苗快，而且幼苗表現(xiàn)為前期粗壯后期生長強勢的特點，能夠達到提高種子質(zhì)量和壯苗的效果。

表6 T7大種子處理對西葫蘆幼苗生長的影響Table 6 The effects of specific gravity selection and T7 priming treatment on the zucchini seedling growth

3 討論與結(jié)論

軟X-射線成像技術(shù)已被用于多種種子的生理質(zhì)量檢測，例如篩除辣椒死種子和劣種子[17]、檢測玉米種子內(nèi)部傷害[9]和預測番茄種子引發(fā)程度[10]等，該技術(shù)可以用于種子質(zhì)量控制[18]。本研究結(jié)果表明，對于西葫蘆種子，正常、畸形和死種子在形態(tài)結(jié)構(gòu)上存在明顯差異，此方法可用于西葫蘆種子精選。此外，從西葫蘆種子成像圖片還可看出，畸形和死種子在形態(tài)上的異?？赡苁窃诜N子生產(chǎn)過程中發(fā)育不良造成，而不是采收加工過程的傷害或者貯存過程的老化引起。同時本研究還發(fā)現(xiàn)，種子發(fā)芽特性與種子平面飽滿度密切相關(guān)，即種子內(nèi)部自由空間越大，形成畸形或死種子的可能性越大，種子質(zhì)量也越差。通過比重選得到的小種子，其內(nèi)部自由空間大，種子質(zhì)量差，而大種子各項生理指標得到顯著改善，種子質(zhì)量高，也證明了種子平面飽和度與種子質(zhì)量的關(guān)系。

比重選和種子引發(fā)技術(shù)都能夠提高種子生理質(zhì)量。比重選主要通過機械篩選，將破碎種子及質(zhì)量差的種子篩除；而引發(fā)主要是通過提高種子生理質(zhì)量，主要表現(xiàn)在加速種子萌發(fā)，提高整齊度和抗逆性，其主要機理是誘導細胞膜修復，促進RNA和蛋白質(zhì)合成，增強能量代謝，促進細胞分裂[19]。前期沙床發(fā)芽試驗證明，比重選和引發(fā)處理均能提高西葫蘆種子質(zhì)量。比重選能夠?qū)①|(zhì)量差的種子篩除，明顯提高種子發(fā)芽率，大種子較對照發(fā)芽率由82.75%提高到90.25%，而小種子發(fā)芽率僅為23.25%，其中死種子的占比高達73.50%，以上結(jié)果說明適宜條件的比重選可以去除大部分死種子從而提升種子質(zhì)量。引發(fā)處理從種子萌發(fā)速度和整齊度方面提高了種子質(zhì)量，T7處理種子發(fā)芽勢由75.25%提高到89.25%。同時進行比重選和引發(fā)處理(T7大種子)對種子質(zhì)量提升效果明顯，子葉長、寬度和植株生物量等多個生長指標得到明顯提高，壯苗效果顯著。經(jīng)過比重選和引發(fā)處理的種子在穴盤育苗階段展現(xiàn)了比實驗室發(fā)芽試驗更好的處理效果，不僅提升出苗率，而且株高、莖粗、植株干重和壯苗指數(shù)等多個生長指標比對照種子得到明顯提高，比重選結(jié)合種子引發(fā)技術(shù)能夠顯著提高種子質(zhì)量，達到壯苗效果。

綜上，本研究利用軟X-射線成像技術(shù)檢測了西葫蘆種子質(zhì)量，發(fā)芽試驗結(jié)果和軟X-射線成像圖一一對應研究結(jié)果表明，西葫蘆種子結(jié)構(gòu)和發(fā)芽特性密切相關(guān)，種胚結(jié)構(gòu)完整，種子內(nèi)部自由空間小，飽滿度高，種子質(zhì)量則越高，軟X-射線成像技術(shù)對正常種子的綜合識別率達到86.0%。通過比重選和引發(fā)處理可有效改善西葫蘆種子萌發(fā)特性，提升種苗質(zhì)量，促進種苗生長。隨著技術(shù)的發(fā)展進步，有望實現(xiàn)軟X-射線成像技術(shù)、比重選和種子引發(fā)等多個技術(shù)的有機結(jié)合，形成一套產(chǎn)業(yè)化應用技術(shù)，篩選高質(zhì)量種子，從種子源頭上為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)保駕護航，具有廣闊的市場應用前景。