咖啡短體線蟲(chóng)不同種群對(duì)番茄的寄生性和致病性

李 宇 趙湘媛 宋瑩瑩 孫夢(mèng)茹 夏艷輝 袁虹霞 李洪連 王 珂

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院/小麥玉米作物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，鄭州 450002)

番茄是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)作物，在我國(guó)南北方廣泛種植，市場(chǎng)前景廣闊。我國(guó)是世界上番茄三大主產(chǎn)區(qū)之一, 番茄總產(chǎn)量長(zhǎng)期位居世界之首[1]。番茄作為河南省主要種植的蔬菜種類之一，其種植面積和總產(chǎn)量分別達(dá)到全省蔬菜的5.7%和7%，在河南省蔬菜產(chǎn)業(yè)發(fā)展規(guī)劃(2009—2020)中占據(jù)第一位[2]。但番茄容易受到植物病原物的侵染危害，植物病原線蟲(chóng)就是其中重要的一大類，它們侵染番茄的根部組織，導(dǎo)致根系的壞死腐爛，嚴(yán)重危害作物的健康生長(zhǎng)，進(jìn)而對(duì)作物的安全生產(chǎn)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[3]。

短體線蟲(chóng)(PratylenchusFlipjev, 1936)又稱根腐線蟲(chóng)，是一類寄主廣泛，發(fā)生普遍的遷移性植物內(nèi)寄生線蟲(chóng)，其與根結(jié)線蟲(chóng)(Meloidogyne)和孢囊線蟲(chóng)(Heterodera)是作物上危害最為嚴(yán)重的3種植物病原線蟲(chóng)[4-6]。Janssen等[7]2017年報(bào)道短體線蟲(chóng)屬的有效種為101個(gè)，隨后又有3個(gè)新種被發(fā)現(xiàn)[8-10]，目前短體線蟲(chóng)屬有效種已達(dá)104個(gè)[11]。短體線蟲(chóng)在我國(guó)已報(bào)道的種有20多個(gè)[6]，嚴(yán)重危害玉米[12-13]、小麥[6, 14]、大豆[15-16]、花生[17]、芝麻[18]、山藥[19]、煙草[20]和苧麻[21]等多種糧食作物和經(jīng)濟(jì)作物[22]。據(jù)報(bào)道[22-31]，多種短體線蟲(chóng)可以侵染并寄生在番茄根部，造成番茄根系的變褐、壞死和腐爛，給番茄的安全生產(chǎn)造成重大的損失。黎少梅等[23]根據(jù)線蟲(chóng)的形態(tài)特征從河南省番茄的根際鑒定出4種短體線蟲(chóng)，分別為咖啡短體線蟲(chóng)(P.coffeae)、斯克里布納短體線蟲(chóng)(P.scribneri)、偽短體線蟲(chóng)(P.fallax)和沼澤短體線蟲(chóng)(P.helophilus)。劉維志等[24]在遼寧省的露地番茄根際發(fā)現(xiàn)六裂短體線蟲(chóng)(P.hexincisus)的發(fā)生危害。劉修勇等[22]報(bào)道山東省番茄上有斯克里布納短體線蟲(chóng)寄生。李紅等[25]報(bào)道山西省太谷縣番茄根部有落選短體線蟲(chóng)(P.neglectus)寄生。在加拿大安大略省，短體線蟲(chóng)廣泛分布在各番茄種植區(qū)，穿刺短體線蟲(chóng)(P.penetrans)的侵染能夠顯著降低番茄植株地上部和根部的重量，并對(duì)番茄的產(chǎn)量造成較大的損失[26]。在烏干達(dá)，包括番茄在內(nèi)的多種蔬菜上都有短體線蟲(chóng)發(fā)生危害的報(bào)道[27]。Flis等[28]2018年在佛得角的番茄上首次發(fā)現(xiàn)最短尾短體線蟲(chóng)(P.brachyurus)和德拉特短體線蟲(chóng)(P.delattrei)的發(fā)生危害。上述研究大多集中在對(duì)番茄根際短體線蟲(chóng)的分離鑒定上，短體線蟲(chóng)不同種類及不同種群對(duì)番茄的寄生性和致病性研究未見(jiàn)報(bào)道。2016—2019年，前期研究發(fā)現(xiàn)在黃淮地區(qū)多種大田作物的根系表現(xiàn)出變褐、壞死和腐爛等癥狀，從采集的樣品中分離鑒定出咖啡短體線蟲(chóng)多個(gè)不同種群，通過(guò)接種胡蘿卜愈傷組織進(jìn)行單雌繁殖，得到了純化培養(yǎng)種群。本研究采用溫室盆栽接種和貝爾曼漏斗分離根際線蟲(chóng)的方法, 依據(jù)Goo等[29]提出的線蟲(chóng)寄主植物測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)，測(cè)定咖啡短體線蟲(chóng)5個(gè)不同種群對(duì)番茄的寄生性和致病性，旨在明確采集到的咖啡短體線蟲(chóng)5個(gè)不同種群對(duì)番茄的寄生性和致病性以及不同種群之間的致病力差異，以期為咖啡短體線蟲(chóng)不同種群的遺傳多樣性研究以及番茄根腐線蟲(chóng)病害的危害與防治提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試咖啡短體線蟲(chóng)種群

供試咖啡短體線蟲(chóng)種群及來(lái)源見(jiàn)表1，這些種群均采集于黃淮地區(qū)大田作物根系，由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院土傳病害研究室鑒定和保存(25 ℃)。

表1 供試咖啡短體線蟲(chóng)種群信息Table 1 General information on the Pratylenchus coffeae populations used in this study

1.2 供試植物和種植介質(zhì)

供試的番茄種子購(gòu)自河南秋樂(lè)種業(yè)有限公司。將購(gòu)買的種子置于0.75%的次氯酸鈉溶液中消毒30 min, 用無(wú)菌水清洗3次，然后置于25 ℃的培養(yǎng)箱中催芽24 h。催芽后將種子分別播種在盛有1.5 L 滅菌土的盆缽中，種植約30 d后備用。種植介質(zhì)(V(田園土)∶V(基質(zhì))=2∶1)在使用之前經(jīng)121 ℃ 高壓滅菌處理2 h。

1.3 咖啡短體線蟲(chóng)不同種群的培養(yǎng)與分離

按照Reise等[30]的方法制備胡蘿卜愈傷組織。不同種群的咖啡短體線蟲(chóng)經(jīng)0.3%硫酸鏈霉素溶液消毒8 h，無(wú)菌水洗6次后，在超凈工作臺(tái)中被分別接種到胡蘿卜愈傷組織上，標(biāo)記封口后，置于25 ℃的黑暗恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行擴(kuò)繁培養(yǎng)。培養(yǎng)約50 d后，胡蘿卜愈傷組織周圍有大量的咖啡短體線蟲(chóng)聚集，用無(wú)菌水沖洗培養(yǎng)皿上的線蟲(chóng)，然后將收集的線蟲(chóng)置于離心管中, 配成250條/mL的線蟲(chóng)接種懸浮液。

1.4 供試植物接種咖啡短體線蟲(chóng)

挑選生長(zhǎng)狀況基本一致的番茄幼苗(種植約30 d)，分別接種不同種群的咖啡短體線蟲(chóng)，接種量為1 000條/盆。供試咖啡短體線蟲(chóng)5個(gè)種群，每個(gè)種群接種番茄為1個(gè)處理，每個(gè)處理設(shè)置5個(gè)生物學(xué)重復(fù)，設(shè)未接蟲(chóng)的番茄幼苗為對(duì)照組(CK)。所有盆栽試驗(yàn)均在溫室(25 ℃, 12 h光照/12 h黑暗的光周期)中重復(fù)2次[31]。接種線蟲(chóng)的前1天給盆苗澆水以濕潤(rùn)盆中的土壤，線蟲(chóng)懸浮液接種在植物根部1.5 cm 的半徑范圍內(nèi)[32]。為了保證線蟲(chóng)正常侵染，接種2 d內(nèi)不澆水，然后進(jìn)行常規(guī)種植管理[34]。

1.5 咖啡短體線蟲(chóng)不同種群的寄生性和致病性測(cè)定

接種咖啡短體線蟲(chóng)不同種群75 d后，將番茄植株從花盆中整株取出，測(cè)量并記錄株高、地上部鮮重和根鮮重，對(duì)植株根部的侵染癥狀進(jìn)行拍照。根際線蟲(chóng)的分離統(tǒng)計(jì)采用以下方法：洗凈植株的根部，洗液過(guò)100目和500目的組合篩網(wǎng)，收集500目篩上的線蟲(chóng)，統(tǒng)計(jì)根部洗液的蟲(chóng)量(N1)；將植物根際的介質(zhì)混勻后取100 mL，用改良貝爾曼漏斗法分離土中的咖啡短體線蟲(chóng)，分離3次取平均值之后再×15得到土壤中的線蟲(chóng)數(shù)量(N2)；根部線蟲(chóng)的分離主要參考Kaplan等[33]的方法，并加以改進(jìn)，將待分離的植物根系切成2～3 mm左右的小段，放到組培瓶中，加入少量的水浸沒(méi)根系，在25 ℃的培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)1周，讓根系的線蟲(chóng)孵化出來(lái)，然后將根組織連同線蟲(chóng)孵化液一起放到攪拌器中，攪碎根，然后將懸浮液過(guò)100目和500目的組合篩網(wǎng)，統(tǒng)計(jì)植株根部的線蟲(chóng)數(shù)量(N3)。每盆植株的線蟲(chóng)總量N=N1+N2+N3。從篩網(wǎng)和貝曼漏斗中分離的線蟲(chóng)懸浮液均用量筒定容到15 mL，吸取1 mL置于直徑10 cm的培養(yǎng)皿中，在解剖鏡下統(tǒng)計(jì)蟲(chóng)量，重復(fù)3次取平均值，最終算出懸浮液中的蟲(chóng)量。依據(jù)Goo等[29]提出的寄主植物測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)，判斷番茄是否為供試咖啡短體線蟲(chóng)不同種群的寄主植物。該標(biāo)準(zhǔn)認(rèn)為線蟲(chóng)的繁殖率(Rf，根際最終分離的蟲(chóng)量/起始接種蟲(chóng)量)>1為適合寄主植物(Good host)，1≥Rf>0為不良寄主植物(Poor host)，Rf=0為非寄主植物(Non-host)。

1.6 供試植物根組織內(nèi)線蟲(chóng)的染色和檢測(cè)

將供試植物從盆中取出，用水輕輕洗凈根部的泥土，參照Byrd等[34]的方法對(duì)植物根組織中的線蟲(chóng)進(jìn)行染色, 然后置于顯微鏡下進(jìn)行檢測(cè)。

1.7 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 13.0軟件處理數(shù)據(jù)，進(jìn)行方差分析；用DMRT法在P=0.05顯著水平進(jìn)行多重比較，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)誤(SE)。

2 結(jié)果與分析

2.1 咖啡短體線蟲(chóng)的寄生性

咖啡短體線蟲(chóng)5個(gè)種群接種番茄75 d后，分別從番茄的根部和根際土壤中分離到大量的咖啡短體線蟲(chóng)，所有處理線蟲(chóng)的繁殖率均>1，HN-K1接種處理組番茄根際的線蟲(chóng)繁殖率最高，為8.8，顯著高于(P<0.05) XC-278-1、AH-015A2和SY-1處理組線蟲(chóng)的繁殖率，AH-015A2處理組線蟲(chóng)的繁殖率最低(表2)。依據(jù)Goo等[29]的寄主測(cè)定標(biāo)準(zhǔn), 確定番茄是供試咖啡短體線蟲(chóng)5個(gè)種群的適合寄主植物。發(fā)病的番茄根系染色后，在顯微鏡下可以觀察到根內(nèi)含有大量的咖啡短體線蟲(chóng)和卵，表明該線蟲(chóng)可以在供試的番茄根系內(nèi)生長(zhǎng)發(fā)育并完成生活史。由于咖啡短體線蟲(chóng)的侵染為害，番茄的根細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)褐色的組織病變(圖1)。

表2 咖啡短體線蟲(chóng)5個(gè)不同種群接種番茄75 d后的蟲(chóng)量Table 2 Means of nematode reproduction of 5 populations of P.coffeae measured from tomato 75 days after inoculation

(a)健康根系(無(wú)咖啡短體線蟲(chóng))；(b)被侵染的病根組織內(nèi)可見(jiàn)大量的咖啡短體線蟲(chóng)；(c)病根組織內(nèi)的線蟲(chóng)和卵；(d)侵入病根細(xì)胞的咖啡短體線蟲(chóng)。(a) Healthy tomato roots without P.coffeae; (b) A large number of P.coffeae in the infected tomato roots; (c) Nematodes and eggs in the infected tomato pathological roots; (d) P.coffeae in tomato pathological root cells.圖1 咖啡短體線蟲(chóng)侵染番茄根組織的染色圖Fig.1 Photomicrograph of tomato pathological roots infected by Pratylenchus coffeae

2.2 咖啡短體線蟲(chóng)不同種群的致病性

與未接種線蟲(chóng)的對(duì)照組植株相比，接種咖啡短體線蟲(chóng)75 d后的番茄植株表現(xiàn)為地上部生長(zhǎng)緩慢、植株矮小和葉片黃化等癥狀(圖2)。由于咖啡短體線蟲(chóng)的侵染危害，不同處理的番茄根系均明顯減少，重量減輕，出現(xiàn)壞死腐爛癥狀(圖3(a))。在咖啡短體線蟲(chóng)侵染初期，番茄根系出現(xiàn)淺褐色或棕褐色的侵染病斑(圖3(b))；隨著病情的不斷加重，番茄根系的病斑不斷擴(kuò)大，出現(xiàn)整條根系壞死腐爛的現(xiàn)象，最終導(dǎo)致整個(gè)根系出現(xiàn)大面積的壞死腐爛(圖3(c)～(d))。

CK：健康番茄；1～5：分別為咖啡短體線蟲(chóng)XC-278-1、AH-015A2、SY-1、XC-344-1和HN-K1種群接種的番茄植株CK: Healthy plant; 1-5: Tomato plants with poor growth after inoculated with XC-278-1， AH-015A2， SY-1， XC-344-1 and HN-K1 populations of P.coffeae, respectively.圖2 接種咖啡短體線蟲(chóng)不同種群75 d后番茄的地上部生長(zhǎng)情況Fig.2 Symptoms of tomato inoculated with five populations of P.coffeae for 75 days

(a)CK:健康番茄根系；1～5:分別為咖啡短體線蟲(chóng)XC-278-1、AH-015A2、SY-1、XC-344-1和HN-K1種群接種75 d后番茄植株根系；(b)接種20 d后番茄根部小的、淺褐色或棕褐色的初期侵染病斑；(c)接種40 d后番茄根系上擴(kuò)大的侵染病斑；(d)接種75 d后被咖啡短體線蟲(chóng)嚴(yán)重侵染的番茄根系(a) CK: Healthy tomato roots; 1-5: Tomato plants with poor growth after inoculated with XC-278-1, AH-015A2, SY-1, XC-344-1 and HN-K1 populations of P.coffeae for 75 days, respectively; (b) Small, light brown or brown infection spots on tomato roots after 20 days of inoculation； (c) Expanding infection spots on tomato roots after 40 days of inoculation; (d) Typical symptoms of the entire tomato roots become brown or black brown rot seriously infected by P.coffeae for 75 days圖3 咖啡短體線蟲(chóng)侵染危害番茄的根部癥狀Fig.3 Symptoms of tomato roots infected by P.coffeae

供試的咖啡短體線蟲(chóng)5個(gè)不同種群均能明顯的侵染和為害番茄，導(dǎo)致番茄植株的株高、地上部鮮重和根鮮重等生長(zhǎng)參數(shù)均顯著低于(P<0.05)CK，但不同種群接種對(duì)番茄植株生長(zhǎng)量的影響各不相同(表3)?？Х榷腆w線蟲(chóng)HN-K1和XC-344-1種群接種后導(dǎo)致番茄的株高均顯著低于(P<0.05)其他3個(gè)種群接種的番茄植株；HN-K1種群處理組番茄的地上部鮮重為16.8 g，是所有處理中最低的；咖啡短體線蟲(chóng)HN-K1、XC-344-1和SY-1種群處理組番茄的根鮮重均顯著低于(P<0.05)其他2個(gè)種群處理的番茄植株。對(duì)番茄生長(zhǎng)量影響最小的是AH-015A2 種群，接種該種群的番茄株高、地上部鮮重和根鮮重分別是47.6 cm、22.9 g和10.3 g，高于或者顯著高于其他處理的番茄植株。因此，供試的咖啡短體線蟲(chóng)5個(gè)不同種群對(duì)番茄均具有明顯的致病性，但在致病力上存在差異。對(duì)番茄致病力最強(qiáng)的是來(lái)自河南平頂山玉米的HN-K1種群，其次是XC-344-1和SY-1種群；對(duì)番茄致病力最弱的是來(lái)自安徽宿州小麥的AH-015A2種群。

表3 咖啡短體線蟲(chóng)5個(gè)不同種群接種75 d后對(duì)番茄生長(zhǎng)量的影響Table 3 Means of plant growth of 5 populations of P.coffeae measured from tomato 75 days after inoculation

3 討 論

短體線蟲(chóng)是番茄的重要病原物之一，國(guó)內(nèi)外均有短體線蟲(chóng)寄生危害番茄的報(bào)道[22-28]。本研究證實(shí)了供試咖啡短體線蟲(chóng)5個(gè)不同種群對(duì)番茄均具有較強(qiáng)的致病性，寄主或地理來(lái)源不同的咖啡短體線蟲(chóng)種群之間的致病力存在明顯的差異。關(guān)于寄主或地理來(lái)源不同的咖啡短體線蟲(chóng)種群在致病力上存在差異的研究并未見(jiàn)報(bào)道，然而不同種群致病力的差異在香蕉穿孔線蟲(chóng)等其它植物寄生線蟲(chóng)上已有報(bào)道[35]。本研究證實(shí)供試寄主或地理來(lái)源不同咖啡短體線蟲(chóng)不同種群的致病力存在差異，來(lái)自河南玉米的HN-K1種群的致病力最強(qiáng), 來(lái)自安徽小麥的AH-015A2種群的致病力最弱。本研究中咖啡短體線蟲(chóng)不同種群在致病力上存在的差異與上述香蕉穿孔線蟲(chóng)不同種群致病力差異的研究結(jié)果一致。

不同寄主和地理來(lái)源的咖啡短體線蟲(chóng)在致病力上存在差異，即有不同種群自身內(nèi)在因素導(dǎo)致的差異，也有人為和環(huán)境等外在因素導(dǎo)致的差異。不同線蟲(chóng)群體自身內(nèi)在因素能夠引起其致病力的差異，例如禾谷孢囊線蟲(chóng)(H.avenae)種內(nèi)由于對(duì)鑒別寄主中抗病基因表現(xiàn)差異，分為不同的致病型且不同致病型之間的致病力存在差異[36]。大豆孢囊線蟲(chóng)(H.glycines)利用抗病品種將不同的且主要的基因群體進(jìn)行區(qū)分，獲得差異種群類型，劃分生理小種。不同生理小種對(duì)寄主抗病基因的表達(dá)差異能夠?qū)е律硇》N之間的致病力存在一定的差異[37]。人為因素則主要是接種方法和線蟲(chóng)的分離方法。Reddy等[38]的研究表明接種溫度高于30 ℃或低于15 ℃均不利于香蕉穿孔線蟲(chóng)對(duì)供試植物的侵染。Khan等[39]的研究表明環(huán)境溫度對(duì)香蕉穿孔線蟲(chóng)的分離結(jié)果影響很大，25 ℃是分離香蕉穿孔線蟲(chóng)的最佳溫度，同等條件下25 ℃分離的線蟲(chóng)是30 ℃分離線蟲(chóng)量的6倍；當(dāng)分離溫度在30 ℃以上時(shí)，會(huì)嚴(yán)重影響到根系內(nèi)線蟲(chóng)的分離和孵化，最終影響到試驗(yàn)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，導(dǎo)致較大的誤差。因此，本研究在咖啡短體線蟲(chóng)的接種、侵染和分離等過(guò)程均在25 ℃的溫室進(jìn)行，以保證試驗(yàn)結(jié)果的可靠性。在自然環(huán)境中有很多因素能影響線蟲(chóng)對(duì)植物的致病性，比如溫度和濕度。同一種群位于不同的環(huán)境中，其對(duì)植物的致病性可能會(huì)存在一定的差異[38]。

在植物寄生線蟲(chóng)的寄生性和致病性研究中，貝爾曼漏斗法是分離土壤中線蟲(chóng)的最常用方法之一，但如何保證最大程度地分離完土壤中的線蟲(chóng)以及分離所需要的時(shí)間并未明確[40]。本研究使用貝爾曼漏斗法對(duì)番茄根系及土壤中線蟲(chóng)的分離結(jié)果發(fā)現(xiàn)：在25 ℃下，經(jīng)過(guò)60 h的上架分離，從HN-K1種群接種的番茄土壤中分離出4 417條咖啡短體線蟲(chóng)，下架后的土壤在漏斗中室溫涼干2 d，翻土進(jìn)行2次上架，60 h后從土壤中再次分離出1 951條咖啡短體線蟲(chóng)，達(dá)到首次分離蟲(chóng)量的一半左右，采用同樣方法進(jìn)行第3次上架分離得到的短體線蟲(chóng)只有23條，這說(shuō)明在利用貝爾曼漏斗法分離線蟲(chóng)時(shí)2次翻土上架對(duì)分離結(jié)果的重要性，2次分離基本能分離完樣品中的線蟲(chóng)。因此在植物病原線蟲(chóng)寄生和致病性測(cè)試過(guò)程中要考慮這些因素，保證試驗(yàn)結(jié)果真實(shí)反映供試線蟲(chóng)種群的寄生性和致病力。

4 結(jié) 論

采自黃淮地區(qū)大田作物根際的咖啡短體線蟲(chóng)5個(gè)不同種群均能侵染供試番茄根系，并且在番茄根際的Rf>1，番茄是供試咖啡短體線蟲(chóng)5個(gè)不同種群的適合寄主植物。供試咖啡短體線蟲(chóng)5個(gè)不同種群對(duì)番茄均具有較強(qiáng)的致病性，但寄主或地理來(lái)源不同的咖啡短體線蟲(chóng)不同種群之間的致病力存在差異，來(lái)自河南玉米的HN-K1種群的致病力最強(qiáng), 來(lái)自安徽小麥的AH-015A2種群的致病力最弱。