叢枝菌根真菌侵染指標(biāo)與植物促生效應(yīng)相關(guān)性分析

李 俠 葉誠誠 張俊伶 李海港 王幼珊

(1.山西大同大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山西 大同 0370090；2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué) 資源與環(huán)境學(xué)院，北京 100193；3.溫州市優(yōu)質(zhì)農(nóng)產(chǎn)品開發(fā)服務(wù)中心，浙江 溫州 325000；4.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 草原與資源環(huán)境學(xué)院/內(nèi)蒙古自治區(qū)土壤質(zhì)量與養(yǎng)分資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/草地資源教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，呼和浩特 010018；5.北京市農(nóng)林科學(xué)院 植物營養(yǎng)與資源研究所，北京 100097)

叢枝菌根的形成對(duì)植物營養(yǎng)元素(尤其是磷和鋅)的吸收具有促進(jìn)或抑制作用[1]。這種相互作用的方向和程度受宿主植物和叢枝菌根真菌(Arbuscular mycorrhizal fungi, AMF)種類的共同影響[2-4]。同一種AMF對(duì)不同宿主植物生長和養(yǎng)分吸收的效應(yīng)不同。例如，Tran等[1]發(fā)現(xiàn)接種異形根孢囊霉Rhizophagusirregularis對(duì)15 種農(nóng)作物(包括谷物、豆類和蔬菜)的效應(yīng)不同，其中菌根對(duì)韭菜生長和礦質(zhì)元素吸收的促進(jìn)作用最大，而對(duì)三葉草卻表現(xiàn)抑制效應(yīng)。不同AMF種類對(duì)同一宿主植物的生長效應(yīng)也有差異。貧瘠土壤接種Funneliformismosseae后，小麥生物量及根系A(chǔ)MF侵染率等指標(biāo)均高于接種R.fasciculatus和易誤巨孢囊霉Gigasporadecipiens[5]。

植物對(duì)AMF的功能響應(yīng)差異可能與AMF的生存策略有關(guān)。根外菌絲在AMF吸收和運(yùn)輸養(yǎng)分中非常重要，叢枝(Arbuscule)則是AMF與宿主植物細(xì)胞進(jìn)行養(yǎng)分交換的場所[6]。關(guān)于不同AMF生長策略的研究表明，AMF的生長具有高度譜系保守性[7-8]。球囊霉科Glomeraceae具有較高的根系侵染率，因此可以減少病原菌，例如：尖孢鐮孢Fusariumoxysporum和腐霉Pythiumsp.對(duì)宿主植物根系的感染；巨孢囊霉科Gigasporaceae具有較高的根外菌絲密度，接種后增加了長葉車前植株地上部的磷含量；無梗囊霉科Acaulosporaceae的AMF根內(nèi)侵染率和根外菌絲密度均較低[7]。因此，AMF生長特性不同導(dǎo)致其功能存在差異。此外，也有研究發(fā)現(xiàn)AMF生長在遺傳水平上具有高度變異，且AMF與宿主植物共生關(guān)系具有不對(duì)稱性，即AMF的生長難以用來預(yù)測宿主植物的生長[3,9]。目前已發(fā)現(xiàn)并報(bào)道的AMF形態(tài)分類大約有300 種。我國的AMF物種資源十分豐富且廣泛分布，發(fā)現(xiàn)并報(bào)道的AMF有147 種[10]，保存在我國“叢枝菌根真菌種質(zhì)資源庫”的叢枝菌根真菌有40 種190 株，然而關(guān)于我國AMF不同菌種間生長特性的研究較少，缺乏對(duì)其功能的深入研究[11]。

傳統(tǒng)研究AMF的方法主要基于顯微觀察菌根侵染率[12]、菌絲密度[13]和孢子數(shù)[14]等。20世紀(jì)90年代以來，分子生物學(xué)技術(shù)被逐漸應(yīng)用到AMF的研究中[15]。利用特異性較強(qiáng)的水解探針(TaqMan)可定量檢測根內(nèi)和土壤中特定的AMF[16-19]。然而，定量PCR與顯微方法測定的結(jié)果不一，二者之間具有一定相關(guān)性[17,20-21]或者不相關(guān)[22-24]。菌根真菌對(duì)宿主植物基因(如營養(yǎng)代謝相關(guān)的基因等)表達(dá)也具有調(diào)控作用[25]。AMF專性誘導(dǎo)型磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因如玉米ZmPht1;6基因在玉米根系顯著上調(diào)[26]，但其與菌根侵染特征的關(guān)系還不清楚。因此，本研究擬以7 種AMF為研究對(duì)象，以玉米和紫花苜蓿作為宿主植物進(jìn)行溫室盆栽試驗(yàn)，測定菌根侵染率、根外菌絲密度、植物地上部生物量、磷/鋅吸收量、植物根系A(chǔ)MF gDNA豐度以及玉米根系ZmPht1;6的相對(duì)表達(dá)量。探究AMF生長特性及其與功能之間的關(guān)系，以期揭示菌根指標(biāo)之間的關(guān)系及其對(duì)功能的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)于2017-04-22—06-04在中國農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院溫室進(jìn)行。供試土壤取自中國農(nóng)業(yè)大學(xué)北京上莊試驗(yàn)站長期定位試驗(yàn)地，為砂壤土。土壤基本理化性質(zhì)如下：有效磷4.18 mg/kg、硝態(tài)氮17.07 mg/kg、銨態(tài)氮2.83 mg/kg、速效鉀82.4 mg/kg、pH 8.19(m(水)∶m(土)=2.5∶1)、有機(jī)碳11.5 g/kg。風(fēng)干土壤過2 mm篩后與河沙混合作為培養(yǎng)基質(zhì)，m(土)∶m(河沙)=2.5∶1。用γ射線(25 KGray)對(duì)土壤基質(zhì)進(jìn)行滅菌。土壤基質(zhì)中供應(yīng)200 mg/kg氮((NH4)2SO4)，20 mg/kg磷(KH2PO4)，200 mg/kg鉀(K2SO4)作為底肥。同時(shí)按照氮供應(yīng)量的1%加入硝化抑制劑(DMPP: 3,4-Dimethylpyrazole phosphate)。

供試玉米(ZeamaysL.)品種為鄭單958，紫花苜蓿(MedicagosativaL.)品種為中牧168。玉米種子在10% H2O2中浸泡 10 min(紫花苜蓿3 min)進(jìn)行表面消毒，用蒸餾水洗滌數(shù)次后，在飽和CaSO4溶液中進(jìn)行種子吸脹7 h(紫花苜蓿3 h)，而后將種子平鋪置于濕潤的濾紙上在黑暗中催芽用于播種。

供試菌種由北京市農(nóng)林科學(xué)院叢枝菌根真菌種質(zhì)資源庫(BGC)提供，選取7 種AMF：摩西斗管囊霉F.mosseae(HK01)、變形球囊霉Glomusversiforme(NM04B)、根內(nèi)根孢囊霉R.intraradices(HEB07D)、幼套近明球囊霉Claroideoglomusetunicatum(XZ03B)、近明球囊霉C.claroideum(XJ06F)、細(xì)凹無梗囊霉Acaulosporascrobiculata(HK02A)、黏屑多樣孢囊霉Diversisporaspurca(SD03A)。每克菌劑的孢子數(shù)約為40～200個(gè)。

為了區(qū)分植物根系和AMF菌絲對(duì)宿主植物生長和功能的影響，本試驗(yàn)采用分室的根箱裝置(圖1)，其中根室A的大?。洪L×寬×高分別為3 cm×8 cm×12 cm，菌絲室B的大?。洪L×寬×高分別為14 cm×8 cm×12 cm，高度在紫花苜蓿裝置中改為6 cm。A與B室之間用30 μm尼龍網(wǎng)隔開，該孔徑的網(wǎng)膜僅允許菌絲進(jìn)入菌絲室。

A為根室，B為菌絲室。A is root compartment. B is hyphal compartment.圖1 試驗(yàn)裝置示意圖Fig.1 Schematic of the experimental pots

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)的2種植物分別設(shè)8個(gè)處理：在根室單獨(dú)接種7種AMF以及不接種對(duì)照CK，每個(gè)處理重復(fù)4次，完全隨機(jī)排列。

玉米根室A和菌絲室B分別加入400和1 840 g滅菌基質(zhì)，紫花苜蓿為250和1 150 g滅菌基質(zhì)。接種處理在根室土壤中間處分別鋪上32 g接種劑(玉米)和20 g(紫花苜蓿)接種劑(8%的接種量)，對(duì)照則接種等質(zhì)量的滅菌接種劑和5 mL其他土壤微生物濾液。濾液由5 g接種劑加50 mL蒸餾水混勻后，用孔徑為20～25 μm、高壓滅菌的雙層濾紙過濾形成。根室A保留一株玉米，紫花苜蓿保留7株。生長44 d后收獲。

1.3 樣品采集與分析

收獲時(shí)，將植株地上部剪下清洗后裝入信封，105 ℃殺青30 min，70 ℃烘干，稱重，磨碎。地上部磷和鋅含量用HNO3-H2O2微波消解儀(CEM, Matthew, NC, 美國)消解后，采用電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀(ICP-OES, OPTIMA 3300 DV, Perkins-Elmer, 美國)測定。菌根生長效應(yīng)是通過植株地上部生物量計(jì)算得到[27]。計(jì)算公式如下：

菌根生長效應(yīng)=ln(XAMF/Xnon-AMF)

式中：XAMF為接種AMF后植株地上部生物量，g；Xnon-AMF為不接種AMF的植株地上部平均生物量，g。菌根磷、鋅吸收效應(yīng)計(jì)算方法同菌根生長效應(yīng)。

1.4 菌根侵染率和菌絲密度測定

洗凈根系并用去離子水沖洗，用吸水紙吸干水分，取部分用于測定根系A(chǔ)MF侵染率，首先用10% KOH進(jìn)行透明，之后用1% HCl酸化，再用0.05%曲利苯藍(lán)染色，然后從每個(gè)樣品中隨機(jī)抽取30根，置于載玻片上，置于100倍光鏡下采用交叉法觀察計(jì)算根系的叢枝侵染率(AC)、菌絲侵染率(HC)、泡囊侵染率(VC)和總AMF侵染率[12]。取菌絲室過2 mm篩的土壤5 g，采用濕篩抽濾法測定根外菌絲密度，每個(gè)樣品設(shè)3 個(gè)平行[13]。

1.5 根系A(chǔ)MF gDNA豐度測定

快速取部分上步驟洗凈的細(xì)根用錫箔紙包好裝入液氮中，帶回實(shí)驗(yàn)室在-80 ℃冰箱中保存；并取部分根系鮮樣稱鮮重后在65 ℃下烘干，稱取干重后通過鮮重干重的比例計(jì)算根系的含水量。AMF根系gDNA豐度測定采用實(shí)時(shí)定量PCR法(探針法)測定。結(jié)合實(shí)驗(yàn)室及菌種庫的條件，本試驗(yàn)僅對(duì)F.mosseae,R.intraradices和C.claroideum3 種AMF的gDNA豐度進(jìn)行測定。

定量PCR標(biāo)準(zhǔn)物制備：按照植物基因組DNA提取試劑盒(DN14，北京艾德萊生物科技有限公司)說明書提取植物根系總DNA，并用每種AMF的特異性引物進(jìn)行普通PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為25 μL：2.5 μL 10×PCR Buffer(含Mg2+)，2.0 μL dNTP，各0.3 μL的上下游引物(10 μmol/L)，0.3 μLTaq酶(全式金)，1 μL DNA模板和18.6 μL ddH2O。反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min，40個(gè)循環(huán)94 ℃變性30 s，X ℃退火1 min，72 ℃延伸30 s，72 ℃延伸5 min，引物序列和退火溫度見表1[19]。用PCR產(chǎn)物純化回收試劑盒(DR02，北京艾德萊生物科技有限公司)對(duì)普通PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化。純化后的PCR產(chǎn)物按照pMD19-T Vector (TaKaRa)試劑盒說明書的方法進(jìn)行連接，用感受態(tài)細(xì)胞E.coilJM109(TaKaRa)進(jìn)行轉(zhuǎn)化與克隆，將成功克隆的單菌落置于加有Amp/IPTG/X-Gal的LB液體培養(yǎng)基中過夜振蕩培養(yǎng)。過夜培養(yǎng)后的菌液分別用各自的AMF引物(表1)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，挑選目的條帶明亮樣品送測序并返回質(zhì)粒。用Nano drop測定質(zhì)粒DNA濃度(ng/L)。每μL的拷貝數(shù)濃度(NC)計(jì)算公式如下：

式中：660為DNA的分子量，u/bp；K為 DNA濃度，ng/μL；L為真菌DNA目的片段長度和質(zhì)粒片段長度之和(F.mosseae,R.intraradices,C.claroideum和質(zhì)粒片段長度分別為122、250、177 和2 692 bp)；Na為阿伏伽德羅常數(shù)6.022×1023。

用ddH2O對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行一系列稀釋，使獲得拷貝數(shù)范圍為102～109，用作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

定量PCR：采用TaqMan探針法進(jìn)行根系A(chǔ)MF gDNA豐度的絕對(duì)定量。將上述步驟提取的植物樣品DNA稀釋10倍作為模板，系列濃度稀釋后的質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后用每種AMF的特異性引物以及探針進(jìn)行PCR定量，具體引物、探針序列及退火溫度見表1[19]。探針兩端修飾物分別為5′(FAM);3′(BHQ-1)，純化方法為PAGE(生工生物(上海)工程有限公司)。反應(yīng)體系為25 μL: 2.5 μL 10×PCR Buffer(含Mg2+)，2.0 μL dNTP，各0.3 μL的上下游引物(10 μmol/L)，0.15 μL的水解探針(10 μmol/L)，0.3 μL Taq酶(全式金)和1 μL DNA模板，并加入18.45 μL ddH2O補(bǔ)足至25 μL。反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min，40 個(gè)循環(huán)94 ℃變性30 s，X ℃退火1 min，72 ℃延伸30 s，并在每次循環(huán)結(jié)束后收集熒光信號(hào)。每個(gè)樣品反應(yīng)設(shè)置3 個(gè)平行，所有反應(yīng)均在qTOWER 2.2儀器上完成，反應(yīng)結(jié)束后輸入標(biāo)準(zhǔn)曲線的拷貝數(shù)濃度，通過qPCRsoft 3.0.29.0版本軟件計(jì)算出未知樣品的拷貝數(shù)濃度。將未知樣品的拷貝數(shù)換算成濃度(ng/μL)，根系A(chǔ)MF gDNA豐度的計(jì)算公式如下[19]：

表1 定量PCR的AMF引物、探針序列及退火溫度Table 1 Sequences of primers, hydrolysis probes and optimal annealing temperature used for the quantitative real-time PCR quantification of LSU gene copies of different AMF species

根系A(chǔ)MF gDNA豐度=

式中：根系A(chǔ)MF gDNA豐度，ng/mg；根系A(chǔ)MF gDNA濃度，ng/μL；根系干重，mg，EV為洗脫體積，μL。

1.6 ZmPht1;6相對(duì)表達(dá)量測定

采用實(shí)時(shí)定量PCR法測定，取用部分保存于-80 ℃ 冰箱的玉米根系，采用Trizol試劑(RNAiso Plus, Takara)進(jìn)行植物總RNA提取，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser)的說明進(jìn)行RNA反轉(zhuǎn)錄，使用 SYBR Premix EXTaqTM(Tli RNaseH Plus, Takara)試劑盒進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系為25 μL，反應(yīng)體系如下：12.5 μL SYBR Green PCR mix，各0.5 μmol/L正向和反向引物，1 μL 稀釋10倍的cDNA模板以及10.5 μL ddH2O。反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性2 min，40 個(gè)循環(huán)95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸20 s。溶解曲線數(shù)據(jù)收集在反應(yīng)結(jié)束后溫度從55 ℃升到95 ℃時(shí)，每L高0.5 ℃收集1 次熒光信號(hào)。每個(gè)樣品設(shè)3 個(gè)平行。PCR 反應(yīng)中使用α-Tubulin4為內(nèi)參基因，內(nèi)參基因及目標(biāo)基因引物序列引用參考文獻(xiàn)[28]。用2-ΔΔCt法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量，計(jì)算公式如下[29]：

ΔCt=ΔCt對(duì)照-ΔCt內(nèi)參
2-ΔΔCt=2-(ΔCt試驗(yàn)-ΔCt平均)

式中：ΔCt對(duì)照為不接種對(duì)照處理目的基因的Ct值；ΔCt內(nèi)參為內(nèi)參基因的Ct值；ΔCt試驗(yàn)為接種處理的Ct值；ΔCt平均為ΔCt值的平均值。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析

所有數(shù)據(jù)采用Shapiro-Wilk檢測正態(tài)性、Levene’s檢測方差齊性。其中菌根侵染率、根系A(chǔ)MF gDNA豐度以及ZmPht1;6相對(duì)表達(dá)量的數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行l(wèi)g(x)轉(zhuǎn)化使其符合正態(tài)分布和方差齊性。采用單因素方差分析(One-way ANOVA)檢驗(yàn)不同接種處理對(duì)根外菌絲密度、菌根侵染率、菌根生長效應(yīng)、菌根磷、鋅吸收效應(yīng)、根系A(chǔ)MF gDNA豐度(紫花苜蓿)、ZmPht1;6相對(duì)表達(dá)量等指標(biāo)的影響，方差分析顯著后，采用Duncan’s多重比較檢驗(yàn)各菌種處理間差異的顯著性，采用單樣本t檢驗(yàn)(One samplet-test)比較菌根生長效應(yīng)、菌根磷、鋅吸收效應(yīng)與零的差異。采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)(Independent samplet-test)比較玉米根系A(chǔ)MF gDNA豐度在2種菌種間的差異。相關(guān)分析采用Pearson法，回歸分析采用逐步回歸法。所有統(tǒng)計(jì)均用IBM SPSS Statistics 25.0分析，采用Sigmaplot 12.5軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 玉米和紫花苜蓿根系A(chǔ)MF侵染率

接種F.mosseae、R.intraradices、G.versiforme以及C.etunicatum，對(duì)植株根系均有良好的侵染；而接種C.claroideum(僅玉米根系)、A.scrobiculata和D.spurca的玉米和紫花苜蓿根系幾乎無叢枝和泡囊的侵染。接種F.mosseae和R.intraradices的玉米和紫花苜蓿的根系A(chǔ)MF總侵染率顯著高于其他處理；接種G.versiforme、C.etunicatum次之，顯著高于接種C.claroideum、A.scrobiculata和D.spurca；根系菌絲侵染率、叢枝侵染率和泡囊侵染率在不同接種處理間的表現(xiàn)與根系總侵染率基本一致(表2)。

表2 玉米和紫花苜蓿根系A(chǔ)MF侵染率Table 2 AMF colonization rate in maize and alfalfa roots inoculated with different AMF species %

2.2 玉米和紫花苜蓿根外菌絲密度

測定菌絲室的根外菌絲密度發(fā)現(xiàn)(圖2)：接種F.mosseae玉米根外菌絲密度最高，顯著高于其他處理，接種R.intraradices次之，顯著高于G.versiforme；接種C.etunicatum與接種R.intraradices、G.versiforme無顯著差異；接種C.claroideum、A.scrobiculata、D.spurca玉米根外菌絲密度最低，顯著低于其他接種處理，且三者間差異不顯著(圖2(a))。接種F.mosseae、R.intraradices紫花苜蓿根外菌絲密度最高，顯著高于其他接種處理，接種G.versiforme次之，顯著高于接種D.spurca、A.scrobiculata，接種C.etunicatum、C.claroideum與接種G.versiforme、D.spurca、A.scrobiculata間差異不顯著(圖2(b))。

Fm， Funneliformis mosseae； Gv， Glomus versiforme； Rin， Rhizophagus intraradices； Ce， Claroideoglomus etunicatum； Cc， Claroideoglomus claroideum； Asc， Acaulospora scrobiculata； Dsp， Diversispora spurca。不同接種處理間差異采用Duncan’s多重比較進(jìn)行分析，不同小寫字母表示不同接種處理間存在顯著差異(P<0.05)。下同。Significant differences among different inoculation treatments were tested by Duncan’s significant difference test (P<0.05). The same below.圖2 不同AMF接種處理下玉米(a)和紫花苜蓿(b)的根外菌絲密度Fig.2 Hyphal length density in the rhizosphere of maize (a) and alfalfa (b) plants inoculated with different AMF species

2.3 玉米和紫花苜蓿菌根生長效應(yīng)

通過計(jì)算不同接種處理玉米和紫花苜蓿地上部的菌根生長效應(yīng)后發(fā)現(xiàn)(圖3)：接種F.mosseae、G.versiforme、R.intraradices、C.etunicatum均顯著促進(jìn)玉米和苜蓿地上部生長，且菌根生長效應(yīng)顯著高于其他接種處理；接種C.claroideum、A.scrobiculata顯著抑制玉米地上部生長；接種C.claroideum卻顯著促進(jìn)苜蓿地上部的生長；接種A.scrobiculata(僅苜蓿)、D.spurca對(duì)玉米和苜蓿地上部生長無顯著影響；接種A.scrobiculata、D.spurca玉米菌根生長效應(yīng)顯著高于接種C.claroideum，而苜蓿菌根生長效應(yīng)卻表現(xiàn)出相反趨勢。

*表示菌根效應(yīng)大小與零的顯著性差異(*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001)。下同。* indicates that the effect is significantly different from zero (* P<0.05, ** P<0.01, *** P<0.001). The same below.圖3 不同AMF接種處理下玉米(a)和紫花苜蓿(b)的菌根生長效應(yīng)Fig.3 Mycorrhizal growth response of maize plants (a) and alfalfa plants (b) inoculated with different AMF species

2.4 不同接種處理下玉米和紫花苜蓿菌根磷和鋅吸收效應(yīng)

通過計(jì)算不同接種處理玉米和紫花苜蓿地上部的菌根磷/鋅吸收效應(yīng)后發(fā)現(xiàn)(圖4)：接種F.mosseae、G.versiforme、R.intraradices、C.etunicatum均顯著促進(jìn)玉米和紫花苜蓿地上部磷、鋅的吸收，且菌根磷、鋅吸收效應(yīng)顯著高于其他接種處理(圖4)；接種C.claroideum、A.scrobiculata(僅菌根磷吸收效應(yīng))顯著抑制玉米地上部磷、鋅的吸收；接種A.scrobiculata(僅菌根鋅吸收效應(yīng))和D.spurca對(duì)玉米地上部磷、鋅吸收均無顯著影響。接種A.scrobiculata、D.spurca玉米菌根磷(圖4(a))、鋅(圖4(c))吸收效應(yīng)顯著高于接種C.claroideum；除C.claroideum顯著促進(jìn)紫花苜蓿地上部磷吸收和A.scrobiculata顯著抑制紫花苜蓿地上部鋅吸收外，接種C.claroideum、A.scrobiculata和D.spurca對(duì)紫花苜蓿地上部磷、鋅吸收無顯著影響；紫花苜蓿菌根磷(圖4(b))、鋅(圖4(d))吸收效應(yīng)表現(xiàn)為接種C.claroideum>接種D.spurca>接種A.scrobiculata。

圖4 不同AMF接種處理下玉米菌根磷(a)、鋅(c)吸收效應(yīng)與紫花苜蓿菌根磷(b)、鋅(d)吸收效應(yīng)Fig.4 Mycorrhizal phosphorus (a) and zinc (c) uptake response of maize shoot and mycorrhizal phosphorus (b) and zinc (d) uptake response of alfalfa shoot inoculated with different AMF species

2.5 玉米和紫花苜蓿根系A(chǔ)MF gDNA豐度及其與根系總侵染率的相關(guān)分析

接種F.mosseae玉米根系A(chǔ)MF gDNA豐度顯著高于接種R.intraradices，而接種C.claroideum玉米根系中未檢測到C.claroideumgDNA(圖5(a))；接種F.mosseae紫花苜蓿根系A(chǔ)MF gDNA豐度顯著高于接種R.intraradices，后者又顯著高于接種C.claroideum(圖5(b))。

紫花苜蓿根系A(chǔ)MF gDNA豐度的lg值與根系總侵染率(圖5(d))呈極顯著相關(guān)(r=0.83，P<0.001)。而玉米根系兩者不顯著(圖5(c))。

圖5 不同AMF接種處理玉米根系A(chǔ)MF gDNA豐度(a)及其與根系總侵染率的相關(guān)性(c)，紫花苜蓿根系A(chǔ)MF gDNA豐度(b)及其與根系總侵染率的相關(guān)性(d)Fig.5 Abundance of mycorrhizal gDNA inoculated with different AMF species (a) and its correlation analysis with total colonization rate (c) in maize root, and Abundance of mycorrhizal gDNA inoculated with different AMF species (b) and its correlation analysis with total colonization rate (d) in alfalfa roots

2.6 玉米根系ZmPht1;6相對(duì)表達(dá)量及其與菌根磷吸收效應(yīng)的相關(guān)分析

不同AMF菌種顯著影響玉米根系ZmPht1;6基因的相對(duì)表達(dá)量。接種F.mosseae玉米根系ZmPht1;6的相對(duì)表達(dá)量遠(yuǎn)高于其他接種處理，接種G.versiforme和C.etunicatum次之，顯著高于接種R.intraradices和D.spurca，后兩者玉米根系ZmPht1;6的相對(duì)表達(dá)量又顯著高于接種A.scrobiculata和C.claroideum(圖6(a))

玉米根系ZmPht1;6基因的相對(duì)表達(dá)量的lg值與地上部菌根磷吸收(圖6(b))呈極顯著相關(guān)(r=0.88，P<0.001)。

圖6 不同接種處理玉米根系ZmPht1;6基因的相對(duì)表達(dá)量(a)及其與菌根磷吸收效應(yīng)的相關(guān)性(b)Fig.6 Relative expression of ZmPht1;6 inoculated with different AMF species in maize roots (a) and its correlation analysis with mycorrhizal P uptake response (b)

2.7 AMF生長與功能的相關(guān)分析和多元回歸分析

將植株根系A(chǔ)MF總侵染率和根外菌絲密度分別與菌根生長效應(yīng)和磷、鋅吸收效應(yīng)進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析，結(jié)果顯示玉米和紫花苜蓿根系A(chǔ)MF總侵染率及根外菌絲密度均與其菌根生長效應(yīng)和磷、鋅吸收效應(yīng)具有較高的正相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)達(dá)0.58～0.90(表3)。

表3 AMF生長與植株菌根生長效應(yīng)和磷、鋅吸收效應(yīng)的相關(guān)性分析Table 3 Correlation analysis between AMF growth indices with mycorrhizal growth,>phosphorus and zinc uptake response of host plants

用根系菌絲侵染率、叢枝侵染率、泡囊侵染率、總侵染率及根外菌絲密度作為自變量，菌根生長效應(yīng)和磷、鋅吸收效應(yīng)分別作為因變量進(jìn)行逐步回歸分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對(duì)玉米而言，僅根系A(chǔ)MF總侵染率進(jìn)入回歸方程，回歸方程分別為：菌根生長效應(yīng)=總侵染率×0.012-0.066；菌根磷吸收效應(yīng)=總侵染率×0.017+0.009；菌根鋅吸收效應(yīng)=總侵染率×0.016-0.007。在此模型中根系A(chǔ)MF總侵染率分別解釋了79.0%的玉米菌根生長效應(yīng)變異、77.6% 的菌根磷吸收效應(yīng)變異以及74.1%的菌根鋅吸收效應(yīng)變異。對(duì)紫花苜蓿而言，僅根系A(chǔ)MF菌絲侵染率均進(jìn)入回歸方程，回歸方程分別為：菌根生長效應(yīng)=菌絲侵染率×0.03+0.413；菌根磷吸收效應(yīng)=菌絲侵染率×0.038+0.651；菌根鋅吸收效應(yīng)=總侵染率×0.033+0.102。在此模型中根系A(chǔ)MF菌絲侵染率分別解釋了76.5%的菌根生長效應(yīng)變異、72.6%的菌根磷吸收效應(yīng)變異以及74.0%的菌根鋅吸收效應(yīng)變異。

3 討 論

AMF生長具有高度譜系保守性，并表現(xiàn)出一定程度的菌株特異性[8-9]。本試驗(yàn)也得出了相似結(jié)果，球囊霉科表現(xiàn)出高度譜系保守性：接種F.mosseae、R.intraradices和G.versiforme的侵染率均較高；近明球囊霉科則表現(xiàn)出一定的菌株特異性：接種C.etunicatum的侵染率較高，但接種C.claroideum的侵染率較低，在玉米根系中幾乎無侵染(表2，圖2)。由于菌種庫菌種的限制，本試驗(yàn)同一科僅比較了球囊霉科和近明球囊霉科科內(nèi)菌種間的差異，對(duì)于其他科AMF的研究還需進(jìn)一步探索。

AMF對(duì)植物的生長和營養(yǎng)吸收表現(xiàn)出正效應(yīng)[30-31]、負(fù)效應(yīng)[31-32]或無效應(yīng)[1]。Meta分析發(fā)現(xiàn)AMF促進(jìn)了谷物的產(chǎn)量[33]和鋅含量[34]，且其對(duì)植物磷的貢獻(xiàn)最高可達(dá)到90%[35]。本研究中發(fā)現(xiàn)接種F.mosseae、R.intraradices、G.versiforme、C.etunicatum對(duì)玉米和紫花苜蓿生長和磷、鋅吸收均表現(xiàn)為正的促進(jìn)效應(yīng)，A.scrobiculata、D.spurca對(duì)玉米和紫花苜蓿生長和磷、鋅吸收表現(xiàn)為無顯著影響或抑制作用，C.claroideum對(duì)紫花苜蓿生長和磷吸收為促進(jìn)效應(yīng)，而對(duì)玉米生長和磷、鋅吸收卻表現(xiàn)出抑制效應(yīng)(圖3，圖4)。Wagg等[36]的研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，接種C.claroideum提高了紅車軸草地上部生物量，卻抑制了多花黑麥草的生長，這可能是與植物根系形態(tài)特征有關(guān)[37]。本研究中植株的菌根生長效應(yīng)、磷鋅吸收效應(yīng)與菌根侵染率及根外菌絲密度均表現(xiàn)出顯著的正相關(guān)關(guān)系(表3)，且回歸分析發(fā)現(xiàn)菌絲侵染率或總侵染率能解釋植株菌根生長和磷、鋅吸收效應(yīng)的72.6%～79.0%變異，表明AMF在根系的侵染指標(biāo)(菌絲侵染率和總侵染率)是影響宿主植物地上部生物量和磷、鋅吸收量的主要因子。

本試驗(yàn)中紫花苜蓿根系A(chǔ)MF gDNA豐度與根系總侵染率的趨勢具有較高的相關(guān)性(圖5(d))，該結(jié)果與已有研究結(jié)果類似[17, 20-21]。玉米根系F.mosseae的gDNA豐度顯著高于接種R.intraradices(圖5(a))，但在紫花苜蓿中則呈相反的趨勢(圖5(b))。然而，顯微觀察法測定的侵染率結(jié)果顯示，玉米和紫花苜蓿根系2 種AMF的總侵染率并未出現(xiàn)顯著差異(表2)。產(chǎn)生這些差異的原因可能是基于DNA的定量PCR測定方法比傳統(tǒng)顯微觀察法更靈敏。已有研究報(bào)道Funneliformismosseae、Rhizophagusintraradices、Claroideoglomusclaroideum、Gigasporamargarita、Scutellosporapellucida等5 種AMF的定量PCR方法測定gDNA豐度。結(jié)合當(dāng)時(shí)實(shí)驗(yàn)室及菌種庫的條件，本試驗(yàn)僅對(duì)其中3 種菌種的gDNA進(jìn)行測定，對(duì)于其他AMF菌種的測定還需進(jìn)一步探索。

不同AMF誘導(dǎo)蒺藜苜蓿和番茄等植物中磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)能力不同[38-39]。本試驗(yàn)中接種F.mosseae玉米根系ZmPht1;6的相對(duì)表達(dá)量遠(yuǎn)高于其他接種處理(圖6(a))，但接種F.mosseae玉米地上部菌根磷吸收效應(yīng)顯著低于接種G.versiforme，且與接種R.intraradices差異不顯著(圖4(a))?？赡茉蚴荈.mosseae菌絲吸收磷的效率較低[40]。已有研究結(jié)果表明受AMF誘導(dǎo)的磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白ZmPht1;6表達(dá)能力與玉米地上部磷吸收量具有極顯著的正相關(guān)關(guān)系[41]，然而近期研究卻發(fā)現(xiàn)ZmPht1;6表達(dá)能力與磷吸收相關(guān)性不確定[42]。本試驗(yàn)中接種球囊霉科AMF玉米根系ZmPht1;6基因的相對(duì)表達(dá)量與菌根磷吸收效應(yīng)差異趨勢并不完全一致，但不同AMF對(duì)玉米地上部菌根磷吸收效應(yīng)和ZmPht1;6基因相對(duì)表達(dá)量的影響趨勢基本一致，相關(guān)系數(shù)達(dá)0.88(圖6(b))。因此，在一定程度上，ZmPht1;6的相對(duì)表達(dá)能力可反映AMF的吸磷能力[43]。

4 結(jié) 論

AMF的生長特性(總侵染率和根外菌絲密度)與其功能(宿主植物地上部生物量、養(yǎng)分(磷和鋅)菌根吸收效應(yīng))之間均具有較高的正相關(guān)性；多元回歸分析表明根系A(chǔ)MF侵染率能夠較好地解釋植株地上部生長和菌根磷、鋅吸收效應(yīng)的差異；實(shí)時(shí)定量PCR能很好地反映紫花苜蓿根系A(chǔ)MF侵染；玉米根系ZmPht1;6的相對(duì)表達(dá)量在一定程度上可以反映AMF的吸磷能力。由于本試驗(yàn)采用的AMF種類有限，測定的功能也僅限于植物生長和養(yǎng)分吸收兩方面，今后仍需要進(jìn)行大范圍菌種和多功能的驗(yàn)證，為開發(fā)AMF資源提供科學(xué)依據(jù)。