甜玉米小斑病抗性主效QTL挖掘

蔣 鋒 陳 趣 陳青春 張姿麗 孫 偉 王曉明 劉鵬飛*

(1.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院 農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院，廣州 510225 2.湛江市霞山區(qū)農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心，廣東 湛江 524000)

玉米小斑病(Bipolarismaydis)是國(guó)內(nèi)外玉米種植區(qū)普遍的真菌病害之一[1]。在我國(guó)，玉米小斑病主要發(fā)生于氣候溫暖潮濕的夏玉米種植區(qū)，病害爆發(fā)時(shí)輕者減產(chǎn)15%～20%，重災(zāi)區(qū)減產(chǎn)可達(dá)50%以上[2]。種植密度與施肥量的增多，加重了玉米小斑病的發(fā)生[3]。此外，各玉米種植區(qū)缺乏高抗小斑病的品種也是小斑病為害的主要原因之一。目前，化學(xué)防治是降低玉米小斑病危害的主要措施。但是長(zhǎng)期使用化學(xué)殺菌劑會(huì)引起生態(tài)環(huán)境污染、食品安全和耐藥性等問題[4]。合理的種植密度和施肥方案、恰當(dāng)?shù)母髦贫纫部捎行Ы档陀衩仔“卟〉奈：5-6]。但是應(yīng)用玉米抗小斑病種質(zhì)資源，挖掘其抗性基因和QTL，培育抗病品種是玉米小斑病防治最經(jīng)濟(jì)有效的方法。

由于所用的抗性種質(zhì)材料的來源和遺傳背景不同，導(dǎo)致各研究者得出的玉米小斑病抗性遺傳模式及抗病基因的數(shù)量和位置不盡相同。目前，已有多種玉米小斑病抗性模式的研究報(bào)道，F(xiàn)aluyi等[7]、Cai等[8]、Gao等[9]和Zhao等[10]認(rèn)為玉米小斑病抗性遺傳受隱性單基因控制；Smith等[11]首次在尼日利亞玉米自交系中鑒定出玉米小斑病的隱性抗性單基因，并命名為rhm1；隨后,rhm1被轉(zhuǎn)入許多玉米自交系中，成為玉米小斑病的主要抗源。Thompson等[12]和Chang等[13]認(rèn)為受2個(gè)隱性主基因控制。一些研究認(rèn)為，玉米小斑病抗性受數(shù)量性狀基因和QTL控制。Carson等[14]用‘Mo17’בB73’組合的重組自交系，在第1、2、3、4、7和10染色體上定位到來源于Mo17的10個(gè)抗性QTL，可共同解釋45.8% 的表型變異。Balint等[15-18]用不同的重組自交系在不同的環(huán)境下同時(shí)定位小斑病抗性QTL，得出在bin 3.04區(qū)域存在主效抗性QTL，貢獻(xiàn)率均>10%。Zwonitzer等[19]用2個(gè)近等基因系，在bin 3.03、bin 6.01和bin 9.02上均同時(shí)檢測(cè)到主效抗小斑病QTLs。Lennon等[20]和Liu等[21]分別用近等基因系和F2群體在bin 3.04區(qū)域內(nèi)同時(shí)定位到2個(gè)玉米抗小斑病主效QTL。Li等[22]應(yīng)用全基因組關(guān)聯(lián)分析的方法在bin 5.04上定位到1個(gè)玉米抗小斑病主效QTL。上述研究中，小斑病抗性表型數(shù)據(jù)的獲取均采用先目測(cè)估算病斑面積的比例然后進(jìn)行定級(jí)的方法。這一方法簡(jiǎn)單便捷，但主觀影響較大，不同調(diào)查者得出的同一植株的病級(jí)可能不同；同時(shí)得出的病級(jí)為間斷型數(shù)據(jù)，不能顯示同一病級(jí)內(nèi)各單株的抗病性差異。

目前，基于圖像識(shí)別的玉米小斑病抗性QTL定位的研究未見報(bào)道。本研究以2個(gè)小斑病抗性差異顯著的甜玉米自交系‘T8’和‘T33’為親本配制雜交組合，以‘T8’בT33’組合的200個(gè)F2單株作為遺傳作圖群體，構(gòu)建遺傳連鎖圖譜，對(duì)各單株葉片進(jìn)行圖像掃描獲得葉片的總像素值和小斑病病斑的像素值，以病斑像素值占葉片總像素值的百分比作為小斑病抗性指標(biāo)值，旨在對(duì)玉米小斑病抗性進(jìn)行QTL定位，以期為抗小斑病基因的精細(xì)定位、主效基因克隆和抗小斑病甜玉米新品種選育提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

親本材料‘T8’(母本)和‘T33’(父本)由廣東省鮮食玉米遺傳育種工程技術(shù)研究中心提供。根據(jù)劉紀(jì)麟[1]的七級(jí)分級(jí)法，經(jīng)多年田間試驗(yàn)鑒定，‘T8’的平均病級(jí)為3.62±0.44，‘T33’的平均病級(jí)為1.33±0.32，應(yīng)用假設(shè)檢驗(yàn)檢測(cè)兩親本小斑病抗性差異(P<0.01)。

1.2 田間試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)材料種植在仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院番禺實(shí)踐基地。以抗病自交系‘T33’為父本，感病自交系‘T8’為母本配制雜交組合。F1嚴(yán)格套袋自交收獲F2代種子；種植F2，于4葉期剪取各單株嫩葉提取基因組DNA，于拔節(jié)期和喇叭口期分2次接種O小種小斑病菌。鮮穗采收期收集各單株全部葉片，進(jìn)行葉片圖像掃描，確定各單株病情水平。

1.3 抗病表型數(shù)據(jù)獲取

于鮮穗采收期摘取各F2單株所有葉片，用微型掃描儀獲取葉片圖像，用Photoshop CS5圖像處理軟件進(jìn)行小斑病病斑識(shí)別和病斑面積分割(圖1)。

以每一F2單株的整株葉片的病斑面積比、穗三葉病斑面積比和穗位葉病斑面積比3個(gè)指標(biāo)作為各個(gè)單株小斑病抗性表型值。

比例尺為1 cm。The scale bar is 1 cm.圖1 Photoshop CS5軟件進(jìn)行玉米葉片小斑病病斑識(shí)別前(a)和識(shí)別后(b)圖像Fig.1 Images of corn leaf infected by southern leaf blight before (a) and after (b) identification by Photoshop CS5 software

全株葉片的病斑面積比=全株葉片上的病斑像素之和/全株葉片的像素之和×100%；

穗三葉病斑面積比=穗三葉上的病斑像素之和/穗三葉的像素之和×100%；

穗位葉病斑面積比=穗位葉上的病斑像素/穗位葉的像素×100%。

1.4 DNA分子標(biāo)記分析

采用 CTAB 法[23]提取兩親本和各F2單株 DNA。根據(jù)趙茂俊等[24]、Wang等[25]、于永濤等[26]、劉宗華等[27]和李永祥等[28]的玉米連鎖遺傳圖譜設(shè)計(jì)引物，結(jié)合玉米基因組數(shù)據(jù)庫www.maizegdb.org，選用分布于玉米10 個(gè)連鎖群上的 800 對(duì) SSR引物對(duì)兩親本和200個(gè)F2單株進(jìn)行標(biāo)記基因型分析。

SSR 引物由北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成。參照張軍等[29]的方法進(jìn)行PCR 反應(yīng)體系、聚丙烯酰胺凝膠電泳和硝酸銀染色。

1.5 連鎖群構(gòu)建及QTL定位

采用JoinMap 3.0軟件對(duì)200個(gè)F2單株的多態(tài)標(biāo)記基因型進(jìn)行連鎖關(guān)系分析，構(gòu)建分子標(biāo)記連鎖遺傳圖譜[30]。采用WinQTLCart 2.5軟件，復(fù)合區(qū)間作圖法檢測(cè)小斑病抗性QTL。LOD(likelihood of odd)閾值由1 000次隨機(jī)抽樣產(chǎn)生。

按照“q+性狀+染色體號(hào)+QTL數(shù)目”命名QTL。性狀以英文縮寫表示，如病斑面積比相關(guān)QTL以LBC(Leaf blight coefficient)表示。性狀縮寫后“1”、“2”和“3”分別表示全株、穗三葉、穗位葉。同一條染色體上的各QTL以數(shù)字表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗性性狀統(tǒng)計(jì)

對(duì)兩親本進(jìn)行小斑病抗性鑒定，得出‘T8’全株、穗三葉和穗位葉的病斑面積比分別為(48.51±2.01)%、(59.52±2.11)%和(75.69±3.42)%，‘T33’全株、穗三葉和穗位葉的病斑面積比分別為(22.31±1.52)%、(26.69±2.03)%和(34.37±2.29)%，經(jīng)假設(shè)檢驗(yàn)分析表明，兩親本在病斑面積比上差異極顯著(P<0.01)。

由表1可知，F(xiàn)2單株的全株、穗三葉和穗位葉病斑面積比的變異系數(shù)較大，且顯著大于兩親本的變異系數(shù)，表明有顯著的遺傳方差，適合作QTL定位分析。

表1 F2單株表型性狀統(tǒng)計(jì)Table 1 Statistics of phenotypic traits of F2 individuals

2.2 遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建

從800對(duì)SSR引物中篩選出253對(duì)在‘T8’和‘T33’之間有多態(tài)性的引物。對(duì)多態(tài)標(biāo)記在各F2單株上的基因型進(jìn)行卡方測(cè)驗(yàn)，獲得231個(gè)未偏分離的分子標(biāo)記。用Joinmap 3.0軟件分析，獲得214個(gè)SSR位點(diǎn)的連鎖遺傳圖譜，圖譜全長(zhǎng)1 270.2 cM，平均間距5.9 cM(圖2)。

2.3 小斑病抗性QTL定位分析

2.3.1全株病斑面積比相關(guān)QTL定位

由表2和圖2 可知，共檢測(cè)到4個(gè)病斑面積比相關(guān)QTLs，其中，qLBC1-chr3-1和qLBC1-chr3-2,位于第3染色體phi453121～umc1746和umc1746～bnlg1523，LOD值分別為6.33和6.06，加性效應(yīng)為5.71和5.62，顯性效應(yīng)為-2.41和-2.11，貢獻(xiàn)率為11.17%和11.32%。qLBC1-chr5-1位于第5染色體bnlg603～mmc0081，LOD值為5.28，加性和顯性效應(yīng)分別為4.90和-1.81，貢獻(xiàn)率為10.23%。qLBC1-chr6-1位于第6染色體bnlg2097～umc1133，LOD值為5.61，加性效應(yīng)和顯性效應(yīng)分別為4.83和-1.55，貢獻(xiàn)率為8.95%。

和 分別代表1-LOD置信區(qū)間和2-LOD置信區(qū)間。 and indicate 1-LOD and 2-LOD QTL likelihood intervals, respectively.圖2 連鎖遺傳圖譜及抗小斑病相關(guān)QTL定位Fig.2 Genetic linkage map and QTL mapping for southern leaf blight resistance

2.3.2穗三葉病斑面積比相關(guān)QTL定位

由表2和圖2可知，共檢測(cè)到3個(gè)穗三葉病斑面積比相關(guān)QTL。在第3染色體上檢測(cè)到2個(gè)QTL(qLBC2-chr3-1和qLBC2-chr3-2)，分別位于標(biāo)記umc1746～bnlg1523和umc1399～umc1307，LOD為12.00和3.29，加性效應(yīng)值為7.58和5.52，顯性效應(yīng)為-1.66和-1.84，分別可解釋19.60%和5.08%的表型變異。在第5染色體上檢測(cè)到1個(gè)QTL(qLBC2-chr5-1)，LOD為8.32，加性效應(yīng)和顯性效應(yīng)分別為7.91和-2.73，可解釋14.98%的表型變異。

表2 復(fù)合區(qū)間作圖檢測(cè)到的小斑病抗性相關(guān)QTLTable 2 QTL for southern leaf blight with the method of CIM

2.3.3穗位葉病斑面積比相關(guān)QTL定位

由表2和圖2可知，共檢測(cè)到4個(gè)穗位葉病斑面積比相關(guān)QTL。qLBC3-chr3-1和qLBC3-chr3-2分別位于第3染色體umc1746～bnlg1523和umc1339～umc1307，LOD為11.02和4.40，加性效應(yīng)為9.22和10.24，顯性效應(yīng)為-10.87和-12.51，對(duì)表型的貢獻(xiàn)率分別為19.67%和9.49%。在第5染色體bnlg603～mmc0081檢測(cè)到1個(gè)QTL(qLBC3-chr5-1)，LOD為5.29，加性效應(yīng)和顯性效應(yīng)分別為8.43和-5.72，貢獻(xiàn)率為11.29%。在第9號(hào)染色體上檢測(cè)到1個(gè)QTL(qLBC3-chr9-1)，LOD為2.97，加性效應(yīng)為-7.39，顯性效應(yīng)為2.89，貢獻(xiàn)率為5.18%。

3 討 論

3.1 小斑病抗病數(shù)據(jù)量化

玉米小斑病抗病數(shù)據(jù)量化指標(biāo)經(jīng)歷了從病級(jí)到單位葉面積病斑數(shù)目再到病斑面積比例的發(fā)展過程。劉紀(jì)麟[1]最早提出玉米單株小斑病七級(jí)分級(jí)法，進(jìn)而由單株病級(jí)算得各玉米群體的病情指數(shù)，這一方法被后來的研究者廣泛運(yùn)用。蔣鋒等[31]采用單位葉面積病斑數(shù)目作為抗性指標(biāo)對(duì)小斑病抗病性進(jìn)行了遺傳模型分析。隨著數(shù)據(jù)算法的發(fā)展進(jìn)步，近年來研究者采用圖像自動(dòng)分類處理技術(shù)獲得病菌為害葉片的量化數(shù)據(jù)[32]。本試驗(yàn)采用Photoshop CS5圖像處理軟件對(duì)病葉進(jìn)行病斑識(shí)別和面積分割，以病斑像素值占葉片總像素值的比例作為抗性指標(biāo)進(jìn)行QTL定位，抗性指標(biāo)值為連續(xù)性數(shù)據(jù)，減少了主觀判斷影響，降低了試驗(yàn)誤差，增強(qiáng)了試驗(yàn)結(jié)果的可靠性。

3.2 小斑病抗性主效QTL挖掘

Carson等[14]用‘Mo17’בB73’組合的重組自交系，在第1、2、3、4、7和10染色體定位到來源于‘Mo17’的10個(gè)抗性QTL，可共同解釋45.8%的表型變異。Balint等[15-18]用不同的重組自交系在不同的環(huán)境下同時(shí)定位小斑病抗性QTL，得出在bin 3.04區(qū)域存在主效抗性QTL，貢獻(xiàn)率均>10.00%。Zwonitzer等[19]用2個(gè)近等基因系，在bin 3.03、bin 6.01和bin 9.02上均同時(shí)檢測(cè)到抗小斑病主效QTL。由于各研究者所用的親本材料和作圖群體不同，加之使用的分子標(biāo)記也不同，很難找到共同的分子標(biāo)記，難以進(jìn)行QTL定位結(jié)果的比較，不能確定已發(fā)表的QTL之間的關(guān)系。

為提高QTL檢索的可靠性和穩(wěn)定性，本試驗(yàn)分別以全株、穗三葉和穗位葉的病斑面積比作為各F2單株小斑病抗性表型值。Tanksley[33]指出，貢獻(xiàn)率>10.00%的QTL可視為主效QTL。本研究結(jié)果表明，3個(gè)抗性指標(biāo)所檢索到的抗性QTL染色體定位不盡相同，但存在2個(gè)穩(wěn)定的主效QTL區(qū)間。在第3染色體的umc1746～bnlg1523，同時(shí)檢測(cè)到3個(gè)抗性指標(biāo)的QTL，LOD在6.06～12.00，貢獻(xiàn)率為11.32%～19.67%，表明在此標(biāo)記區(qū)間內(nèi)存在穩(wěn)定的甜玉米小斑病抗性主效QTL。在第5染色體的bnlg603～mmc0081，也檢測(cè)到3個(gè)抗性指標(biāo)的QTL，LOD在5.28～8.39，貢獻(xiàn)率為10.23%～14.98%，表明在第5染色體bnlg603～mmc0081也存在穩(wěn)定的甜玉米小斑病抗性主效QTL。另外，穗三葉和穗位葉病斑面積比2個(gè)指標(biāo)在第3染色體umc1399～umc1307同時(shí)檢測(cè)到抗性QTLs(圖1和圖2)。后期應(yīng)通過進(jìn)一步精細(xì)定位驗(yàn)證主效抗性QTL，找到可供育種利用的分子標(biāo)記，力圖實(shí)現(xiàn)玉米小斑病抗性QTL的分子標(biāo)記輔助選擇。

4 結(jié) 論

本研究以甜玉米雜交組合‘T8’בT33’的F2群體為遺傳作圖群體，應(yīng)用復(fù)合區(qū)間作圖法，在第3染色體umc1746～bnlg1523和第5染色體bnlg603～mmc0081同時(shí)檢測(cè)到3個(gè)甜玉米小斑病抗性指標(biāo)(全株、穗三葉和穗位葉的病斑面積比)相關(guān)的主效QTL，各主效QTL的貢獻(xiàn)率均>10.00%。