韓麗君,徐彥軍,郝向洪,劉豐茂,劉丹,潘燦平
中國農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院,北京 100193
在國內(nèi)各大農(nóng)林院校中,大部分學(xué)校設(shè)置有植物保護學(xué)科農(nóng)藥學(xué)專業(yè)的本科或?qū)?普n程,農(nóng)藥分析實驗課是其中一門培養(yǎng)學(xué)生實驗技能和靈活應(yīng)用理論知識的重要專業(yè)基礎(chǔ)課程。在這門課程的設(shè)計中,紫外分光光度分析每學(xué)期至少會涉及到1–2個實驗內(nèi)容,在農(nóng)藥分析中占有重要的地位。紫外分光光度法既可應(yīng)用于農(nóng)藥化合物的定性鑒定,與紅外、核磁和質(zhì)譜一起構(gòu)成“四大譜”用于農(nóng)藥有效成分或雜質(zhì)的定性鑒定,同時也可應(yīng)用于農(nóng)藥有效成分或雜質(zhì)成分的定量分析,是農(nóng)藥原藥和制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中經(jīng)常采用的分析方法之一。
然而,在高等院校涉及儀器分析的實驗課程中,常常出現(xiàn)實驗設(shè)計和實驗內(nèi)容較為簡單、與實際應(yīng)用無法結(jié)合的問題,難以達到應(yīng)有的教學(xué)效果。如何將一個實驗課設(shè)計得既讓學(xué)生深化理論知識、又讓學(xué)生體會到實驗內(nèi)容的應(yīng)用特色和實際應(yīng)用價值,是我們需要思考和探索的問題。對于針對農(nóng)藥學(xué)專業(yè)的學(xué)生開設(shè)紫外分光光度分析實驗,實驗內(nèi)容的選擇既取決于高校自身的教學(xué)實驗條件,又與實驗教師的教學(xué)理念密切相關(guān)。在農(nóng)林院校開設(shè)的紫外分光光度法的實驗課程中,不少高校只開設(shè)了一些基礎(chǔ)型實驗,實驗設(shè)計相對簡單,一般實驗內(nèi)容只是采用紫外光譜儀對1–2種常見的農(nóng)藥化合物進行紫外光譜掃描,觀測其紫外光譜圖的形狀和最大吸收波長的位置;在定量分析方面,則較多的是讓學(xué)生學(xué)習(xí)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線,對未知樣品進行定量分析。顯然,這些實驗內(nèi)容與儀器分析或光譜分析實驗課上的基礎(chǔ)實驗內(nèi)容高度重復(fù),僅僅是把待測化合物換成了農(nóng)藥化合物而已,沒有讓學(xué)生體會到農(nóng)藥學(xué)方面的專業(yè)特色和實際應(yīng)用價值。因此,在設(shè)計農(nóng)藥學(xué)專業(yè)方面的學(xué)生實驗時,很有必要在綜合實驗技能的基礎(chǔ)上讓學(xué)生同時學(xué)習(xí)到專業(yè)特色的實驗技能和專業(yè)知識,讓學(xué)生在掌握基礎(chǔ)知識相關(guān)技能的同時,提升實踐應(yīng)用能力。
筆者在多年的農(nóng)藥分析實驗教學(xué)中以提高學(xué)生應(yīng)用能力為核心理念,不斷探索和創(chuàng)新,設(shè)計了一個新的紫外分光光度法應(yīng)用于農(nóng)藥分析的實驗:2,4-滴原藥中2,4-二氯苯酚的含量測定。通過這個實驗,將農(nóng)藥原藥質(zhì)量分析的基本思想、相關(guān)雜質(zhì)的概念及分析思路、結(jié)合紫外分光光度分析,讓學(xué)生了解農(nóng)藥分析的專業(yè)特色與應(yīng)用前景,取得了良好的教學(xué)效果,可供應(yīng)用化學(xué)、農(nóng)藥學(xué)及相關(guān)專業(yè)本科及??粕鷮嶒灲虒W(xué)采用。推薦如下。
(1) 學(xué)習(xí)農(nóng)藥原藥中相關(guān)雜質(zhì)分析的概念和要求;
(2) 熟悉采用紫外分光光度法進行雜質(zhì)分析的過程和數(shù)據(jù)處理方法;
(3) 學(xué)習(xí)復(fù)雜樣品分析中衍生化方法在紫外分光光度法中的應(yīng)用。
農(nóng)藥的質(zhì)量分析與安全性評價,除了有效成分定性鑒定和含量分析之外,原藥和制劑產(chǎn)品中的雜質(zhì)也是重要的因素。農(nóng)藥產(chǎn)品中相關(guān)有害雜質(zhì)的判定和分析,不僅直接關(guān)乎農(nóng)藥產(chǎn)品的使用效果,而且對人體健康、環(huán)境安全和農(nóng)產(chǎn)品安全產(chǎn)生重要的影響,因此農(nóng)藥相關(guān)雜質(zhì)管理已成為各國農(nóng)藥登記管理的重要內(nèi)容,相應(yīng)的農(nóng)藥相關(guān)雜質(zhì)分析也成為農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)中不可或缺的部分。
農(nóng)藥原藥中的雜質(zhì)主要是合成過程中產(chǎn)生的副產(chǎn)物、殘留的原材料、儲存過程中的分解產(chǎn)物和原材料帶入的雜質(zhì)。農(nóng)藥制劑中的雜質(zhì)則主要來源于加工使用的原藥和助劑或者加工或貯存過程中產(chǎn)生的雜質(zhì)。當(dāng)雜質(zhì)與其相關(guān)的有效成分相比,對人類和環(huán)境具有明顯毒害、對施用作物產(chǎn)生藥害、引起農(nóng)產(chǎn)品污染、影響農(nóng)藥產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定性或引起其他不良影響時,該雜質(zhì)被稱為“相關(guān)雜質(zhì)”。
農(nóng)藥產(chǎn)品中的雜質(zhì)相關(guān)性的判定是對實際情況進行科學(xué)評價做出的結(jié)果。聯(lián)合國糧農(nóng)組織/世界衛(wèi)生組織(FAO/WHO)共同組織的農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)聯(lián)席會議(JMPS)通常默認采用全球化學(xué)品統(tǒng)一分類和標(biāo)簽制度(GHS)對于混合物的分類標(biāo)準(zhǔn)。例如,對于皮膚和眼睛刺激物設(shè)定標(biāo)準(zhǔn)為10 g·kg?1,對于具致敏性、致突變性、致癌和生殖毒性的化合物設(shè)定標(biāo)準(zhǔn)為1 g·kg?1。作為默認的方法,當(dāng)原藥產(chǎn)品中的雜質(zhì)含量>最大可接受濃度的10%時,即為相關(guān)雜質(zhì)。因此對于皮膚和眼睛刺激物,當(dāng)含量達到1 g·kg?1時即為相關(guān)雜質(zhì),對于具致敏性、致突變性、致癌和生殖毒性的化合物則大于0.1 g·kg?1即為相關(guān)雜質(zhì)[1]。農(nóng)藥產(chǎn)品中的相關(guān)雜質(zhì)分析在農(nóng)藥質(zhì)量控制和分析中非常重要。由于相關(guān)雜質(zhì)的含量一般都較低,因此要求其分析方法不僅具有良好的準(zhǔn)確度和精密度,而且要求有較高的檢測靈敏度。
2,4-滴,通用名稱為2,4-二氯苯氧乙酸,有多種鹽類和酯的加工劑型,如2,4-滴鈉鹽、2,4-滴丁酯等。2,4-滴在低濃度(30 mg·L?1以下)時用作植物生長調(diào)節(jié)劑,在高濃度(500 mg·L?1以上)時則作為除草劑,用于麥、稻、玉米、甘蔗等作物田中防除藜、莧等闊葉雜草及萌芽期禾本科雜草。2,4-滴的常用工業(yè)合成路線是先用苯酚氯化制得2,4-二氯苯酚,然后以2,4-二氯苯酚在氫氧化鈉存在下與氯乙酸縮合生成2,4-滴鈉鹽,再用鹽酸酸化成2,4-滴原藥[2]。因此在2,4-滴的合成過程中,少量的2,4-二氯苯酚會殘存在2,4-滴產(chǎn)品中,以農(nóng)藥雜質(zhì)的形式隨農(nóng)藥施用到作物和環(huán)境中。2,4-二氯苯酚的毒性研究表明其對人的皮膚、眼睛及呼吸系統(tǒng)有刺激性,老鼠急性口服LD50為0.58 g·kg?1,對水生生物有毒[3],已被JMPS認定為2,4-滴產(chǎn)品中的必須檢測的相關(guān)雜質(zhì)。我國現(xiàn)行化工行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)(HG/T 3624–2016)規(guī)定[4],2,4-滴原藥中游離酚(以2,4-二氯苯酚計)的含量不得高于0.2%。
從化學(xué)結(jié)構(gòu)來看,2,4-二氯苯酚可采用色譜方法進行檢測分析[5,6],此外,2,4-滴和苯酚類化合物由于都含有苯環(huán)結(jié)構(gòu),在紫外光譜區(qū)都有吸收峰。資料表明,苯氧基化合物從化學(xué)結(jié)構(gòu)上(見圖1右)可看作是苯酚上的H被烷基取代,其紫外光譜吸收峰與苯酚相似,從圖1(左)可以看出,2,4-滴和2,4-二氯苯酚在中性條件下的最大吸收波長十分接近,均為284 nm;但不同之處在于,在堿性介質(zhì)中,2,4-二氯苯酚的最大吸收波長顯著紅移到了308 nm,而苯醚類衍生物2,4-滴的最大吸收波長不變,仍為284 nm。理論上來說,我們可以據(jù)此檢測2,4-滴原藥中存在的少量2,4-二氯苯酚雜質(zhì)。然而實驗表明,由于2,4-二氯苯酚雜質(zhì)的含量很低,直接采用紫外分光光度法檢測2,4-滴原藥中的游離酚含量時,無法達到所要求的檢測靈敏度,且如果體系中有其他化合物在308 nm也有紫外吸收,會對檢測結(jié)果造成干擾。
圖1 2,4-滴及2,4-二氯苯酚的化學(xué)結(jié)構(gòu)(右)及其在中性及堿性介質(zhì)中的紫外吸收光譜圖(左)
因此,本實驗采用了簡便靈敏的苯酚類化合物的4-氨基安替比林光度分析法[7,8],該方法適合于微量酚的測定,其基本原理是[9,10],酚類化合物(2,4-二氯苯酚)在pH 10.0 ± 0.2介質(zhì)中,在鐵氰化鉀的存在下與4-氨基安替比林反應(yīng),生成橙紅色的吲哚酚安替比林染料,其水溶液在520–525 nm波長處有最大吸收,反應(yīng)方程式見圖2。本實驗中,由于農(nóng)藥樣品水溶性較低,需要采用少量的有機溶劑(乙醇或丙酮)溶解后進行顯色反應(yīng)及光度分析,測定吸光度后由校正曲線查出相同吸光度下標(biāo)樣的體積,即可計算2,4-二氯苯酚的含量。
圖2 2,4-二氯苯酚與4-氨基安替比林的反應(yīng)方程式
紫外可見分光光度計(日本島津UV-2600型),漩渦混合器(山東歐萊博科技有限公司);25 mL具塞量筒(或者容量瓶) 8個,移液管(0.1、0.2、0.5、1.0 mL各一支,5 mL、10 mL 各3支),滴管等。
2,4-二氯苯酚標(biāo)準(zhǔn)品:標(biāo)樣純度≥98.0%。乙醇,丙酮,均為分析純,購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司。
氨溶液A:c(NH3) = 0.05 mol·L?1
氨溶液B:吸取90 mL氨溶液A,加入50 mL乙醇,用水稀釋至1 L。
2,4-二氯苯酚標(biāo)準(zhǔn)溶液:將100 mg 2,4-二氯苯酚標(biāo)準(zhǔn)品(精確至0.1 mg)溶于10 mL丙酮中,用水稀釋至1 L。
4-氨基安替比林水溶液:2 g·L?1,使用時用20 g·L?1貯備液配制(貯備液在暗處可存放3個月)。
鐵氰化鉀水溶液:4 g·L?1(用時現(xiàn)配)。
用移液管依次吸取上述2,4-二氯苯酚標(biāo)準(zhǔn)溶液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 mL,分別放入6個25 mL具塞量筒中,用氨溶液B將其補加到10 mL,再依次加入5 mL氨溶液A、5 mL 4-氨基安替比林溶液和5 mL鐵氰化鉀溶液,加完后搖勻,靜置5 min,得到系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。
另取一個25 mL具塞量筒,加入10 mL氨溶液B,然后按上述步驟依次加入5 mL氨溶液A、5 mL 4-氨基安替比林溶液和5 mL鐵氰化鉀溶液,搖勻后靜置5 min,得到空白溶液。將上述標(biāo)準(zhǔn)溶液以空白溶液作為參比,依次測定其在520 nm下的吸光度。
準(zhǔn)確稱取試樣1.0 g (精確至0.0001 g),置于1000 mL容量瓶中,加入50 mL乙醇使之溶解,然后加入90 mL氨溶液A,用水稀釋至刻度。移取10 mL該溶液放入25 mL具塞量筒中,依次加入5 mL氨溶液A,5 mL 4-氨基安替比林溶液和5 mL鐵氰化鉀溶液,加完后搖勻,靜置5 min,得到待測樣品溶液。然后以空白溶液作為參比,測定該溶液在520 nm下的吸光度。樣品應(yīng)進行兩次平行測定。
注意,為了減小誤差,實驗過程中可根據(jù)儀器的靈敏度,增加或減少標(biāo)樣及樣品的稱樣量,盡量使吸光度值在0.2–0.8之間。
將測得的標(biāo)準(zhǔn)溶液吸光度值對相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)酚溶液的體積作圖,即得校正曲線。由校正曲線查出待測溶液吸光度對應(yīng)于標(biāo)準(zhǔn)酚溶液的體積V(mL) ,以質(zhì)量百分數(shù)表示的游離酚的百分含量(X)按式(1)進行計算:
式(1)中:m標(biāo)為標(biāo)樣的質(zhì)量(g),m樣為試樣的質(zhì)量(g),V標(biāo)為標(biāo)樣的定容體積(mL),V樣為試樣的定容體積(mL);ω為標(biāo)樣的純度;系數(shù)10為試樣溶液的移取體積10 mL。
兩次平行測定結(jié)果之相對相差應(yīng)不大于20%,取其算術(shù)平均值作為測定結(jié)果。按照我國現(xiàn)行化工行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)HG/T 3624–2016的規(guī)定,2,4-滴原藥中游離酚(以2,4-二氯苯酚計)的含量不得高于0.2%,可以此作為樣品合格與否的判定標(biāo)準(zhǔn)。
學(xué)生需要提前預(yù)習(xí)實驗內(nèi)容,實驗過程中要求學(xué)生記錄實驗現(xiàn)象及實驗數(shù)據(jù),實驗完畢后要求學(xué)生分析實驗數(shù)據(jù),對實驗原理及相應(yīng)的實驗過程進行討論,寫出實驗心得,整理完成實驗報告。
本實驗中使用的丙酮、乙醇為易燃試劑,農(nóng)藥原藥及雜質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品屬于有毒試劑,因此學(xué)生在試樣配制過程中需要全程穿實驗服、佩戴護目鏡和防護手套,在遠離熱源和火源的通風(fēng)櫥中操作。
本實驗基本參照了我國化工行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)HG/T 3624–2016的實驗方法,第一步即為系列標(biāo)準(zhǔn)溶液、空白溶液及樣品溶液的配制,所配制的溶液會呈現(xiàn)不同的顏色,學(xué)生需要觀察和記錄實驗過程的顏色變化,圖3為學(xué)生配制的溶液照片。
圖3 實驗過程中配制的顯色溶液及標(biāo)準(zhǔn)溶液
本實驗室所配備的紫外-可見分光光度計為島津UV-2600型,為了減小誤差,實驗過程中根據(jù)儀器的靈敏度,將標(biāo)樣及樣品的稱樣量分別提高到了200 mg和2.0 g,盡量使吸光度值介于0.2–0.8之間。本實驗采用配套的UV Probe數(shù)據(jù)采集軟件進行分光光度分析,所測得的代表性數(shù)據(jù)列于表1,繪制的校正曲線見圖4。由數(shù)據(jù)可知,吸光度值對應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)酚溶液的體積所得到的校正曲線線性回歸方程為y= 1.1152x? 0.0144,線性決定系數(shù)R2 = 0.9997,說明本方法在標(biāo)準(zhǔn)酚溶液體積為0.1–1.0 mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。按照式(1)計算,得到對應(yīng)的2,4-滴原藥中游離酚的百分含量范圍為0.1%–1.0%。由于實驗室購得的2,4-滴原藥樣品來源和批次不同,每批學(xué)生得到的實驗結(jié)果可能會不同,要求學(xué)生在平行測定的相對誤差小于20%的前提下根據(jù)實驗結(jié)果給出合理判定即可。
圖4 吸光度值對應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)酚溶液的體積所得到的校正曲線
表1 標(biāo)準(zhǔn)曲線數(shù)據(jù)表
在三年的教學(xué)實踐中,學(xué)生普遍認為該實驗在熟悉紫外分光光度法基本操作的基礎(chǔ)上拓展了很多內(nèi)容,使他們在以下幾個方面有很大收獲:(1) 該實驗深化了在課堂教學(xué)中學(xué)到的農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)及相關(guān)雜質(zhì)的內(nèi)容,使課堂內(nèi)容得到了具體應(yīng)用;(2) 學(xué)生首次接觸到了“常量分析中的微量分析”所要考慮的要素,即在主成分含量很高的情況下分析雜質(zhì)成分時應(yīng)該如何對分析方法進行合理設(shè)計;(3) 首次學(xué)到了在衍生化顯色過程中平行操作的基本思想和數(shù)據(jù)處理方法;(4) 首次學(xué)習(xí)了如何運用農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)對產(chǎn)品指標(biāo)進行判定,深刻意識到了所學(xué)知識的具體應(yīng)用價值。
本實驗的設(shè)計思想是:將農(nóng)藥的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、農(nóng)藥相關(guān)雜質(zhì)的概念和要求、農(nóng)藥相關(guān)雜質(zhì)的定量分析實驗設(shè)計、實驗過程、數(shù)據(jù)分析、撰寫報告等過程綜合起來,讓學(xué)生對本實驗的目的、應(yīng)用價值、實驗的設(shè)計思路及整個實驗過程有全面總體的認識,培養(yǎng)學(xué)生對一個實驗的來龍去脈進行全方位的思考,提高其獨立思考問題和解決問題的能力。在教學(xué)實踐中要使這些教學(xué)思想得以深化,使學(xué)生在實驗課上“不僅動手操作,還要動腦思考”,達到既定的教學(xué)目標(biāo),指導(dǎo)教師應(yīng)該起到一個“引導(dǎo)和指導(dǎo)”相結(jié)合的作用,具體有以下一些建議:
(1) 當(dāng)我們遇到一個待測化合物需要測定的時候,首先通過提出問題的方式引導(dǎo)學(xué)生開動腦筋,思考和討論這個化合物一般可以采用哪些方法進行測定?例如在本實驗中可以首先提出問題,即從2,4-二氯苯酚的化學(xué)結(jié)構(gòu)來思考,是否可以采用色譜法進行測定?答案是肯定的,因為它具有一定的揮發(fā)性且在高溫下穩(wěn)定,可以考慮采用氣相色譜法分析;同時它帶有芳香基團,具有紫外吸收,因此也可以考慮采用帶有紫外檢測器的液相色譜進行檢測。然后引導(dǎo)學(xué)生分析本實驗較為復(fù)雜的具體情況,即待測樣品中母體化合物2,4-滴的含量很高(一般在95%以上),而游離酚在樣品中的含量很低(限量要求不超過0.2%),因而上述兩種色譜法均存在檢測靈敏度達不到標(biāo)準(zhǔn)要求和容易受到高濃度主成分或其他化合物干擾的問題。在這些思考的基礎(chǔ)上,指導(dǎo)教師再對本實驗所采用的4-氨基安替比林顯色法進行具體講解,使學(xué)生不僅學(xué)習(xí)了具體的實驗內(nèi)容,而且對實驗的基本設(shè)計思路和應(yīng)用價值有了深刻的認識。
(2) 一個好的實驗設(shè)計不一定要照本宣科、完全遵照傳統(tǒng),而是應(yīng)該開動腦筋,使方法簡便易行。例如,傳統(tǒng)的紫外分光光度分析實驗中,標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作都是以吸光度值對標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度制作標(biāo)準(zhǔn)工作曲線,而本實驗中,巧妙地運用了標(biāo)準(zhǔn)溶液與待測溶液的平行操作,直接以吸光度值對配制工作溶液時加入的標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積作圖,然后以對應(yīng)的體積計算質(zhì)量百分數(shù)。這種簡化使該方法在實際應(yīng)用中簡便易行,減少了由計算過程導(dǎo)致的錯誤發(fā)生,非常適用于工廠的大批量產(chǎn)品質(zhì)量檢測。這種數(shù)據(jù)處理方式新穎獨特,但也是學(xué)生們?nèi)菀桩a(chǎn)生疑問的地方,指導(dǎo)教師需要幫助學(xué)生在理解平行操作的基礎(chǔ)上進行推導(dǎo)和掌握。
(3) 教學(xué)實踐表明,指導(dǎo)教師對實驗過程的點評和對實驗效果的積極評價也會提高學(xué)生的學(xué)習(xí)能動性。建議本實驗的教學(xué)評價方法為:學(xué)生積極回答問題和參與討論,占10%;樣品前處理,占20%,這一點主要通過觀察學(xué)生天平的使用及配制的溶液體積是否與25 mL刻度線吻合來評價;儀器使用及樣品測定操作是否規(guī)范,占20%;數(shù)據(jù)分析,占30%,這一點主要通過標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸系數(shù)是否大于0.99及測定結(jié)果的相對誤差是否合理來評判;實驗報告撰寫是否認真及結(jié)果討論是否合理,占20%。指導(dǎo)教師可根據(jù)學(xué)生在以上各方面的具體表現(xiàn),有的放矢,通過講解、討論和具體指導(dǎo)等方式,進一步提高實驗課的教學(xué)質(zhì)量和教學(xué)效果。
本文推薦的教學(xué)實驗適合于本??妻r(nóng)林院校的化學(xué)、應(yīng)用化學(xué)、植物保護及農(nóng)藥學(xué)等專業(yè)方向為大學(xué)三年級學(xué)生學(xué)習(xí)使用,要求學(xué)生具有一定的分析化學(xué)、光度分析、農(nóng)藥學(xué)或農(nóng)藥分析方面的基礎(chǔ)知識。建議學(xué)生2人一組,推薦教學(xué)時數(shù)為6學(xué)時(每學(xué)時50分鐘),其中1學(xué)時用于實驗原理及內(nèi)容講解,3學(xué)時用于溶液配制和紫外測定,1學(xué)時用于數(shù)據(jù)處理和實驗討論,最后1學(xué)時用于教師點評和答疑。本實驗有助于啟發(fā)學(xué)生在從事農(nóng)藥分析及其他相關(guān)專業(yè)工作時,把學(xué)到的實驗設(shè)計思路、實驗方法加以應(yīng)用。實驗所涉及到的背景知識較為全面,實驗方法簡便可靠,所設(shè)計的實驗內(nèi)容可供化學(xué)、植保、農(nóng)藥學(xué)、食品、環(huán)境等相關(guān)專業(yè)學(xué)生實驗教學(xué)選用。