鄰苯二甲醛對(duì)還原型谷胱甘肽的光譜分析
——推薦一個(gè)儀器分析實(shí)驗(yàn)

張鵬，張倩，鐘華，丁彩鳳

青島科技大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院，光電傳感與生命分析教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東省生化分析重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東省生命分析高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266042

儀器分析是化學(xué)學(xué)科的重要分支，主要是借助特殊儀器，以物質(zhì)的理化性質(zhì)為基礎(chǔ)建立起來的分析方法。它具有分析能力強(qiáng)、分析速度快、檢測(cè)靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)[1,2]。作為高等院校化學(xué)及相關(guān)專業(yè)學(xué)生的必修課程，儀器分析實(shí)驗(yàn)通常包含了光譜分析、電化學(xué)分析和色譜分析等幾個(gè)領(lǐng)域。其中光譜分析是常用的快速、靈敏、準(zhǔn)確的現(xiàn)代儀器分析方法之一，它主要是利用物質(zhì)的特征光譜研究其結(jié)構(gòu)或測(cè)定其成分的方法。光譜分析法主要有紫外-可見吸收光譜、熒光光譜、原子發(fā)射光譜、原子吸收光譜、紅外光譜等[3,4]。

還原型谷胱甘肽(GSH)是一種含巰基的三肽，由谷氨酸、半胱氨酸及甘氨酸組成，在體內(nèi)協(xié)助維持機(jī)體的免疫系統(tǒng)，并具有抗氧化性和解毒功能。因此，對(duì)GSH含量的檢測(cè)可為疾病的診斷和健康評(píng)估提供有效的數(shù)據(jù)。目前GSH的檢測(cè)方法主要有還原酶法、量熱法、分光光度法、色譜法、毛細(xì)管電泳法等。與之相比，光譜分析法，尤其是熒光分析法，可在生物體中實(shí)現(xiàn)無創(chuàng)原位成像分析，具有良好的生物應(yīng)用前景。因此，開發(fā)可用于GSH檢測(cè)的光譜分析方法引起了廣泛的關(guān)注[5]。

近幾十年來，有機(jī)分子探針的設(shè)計(jì)與檢測(cè)性能研究獲得了長(zhǎng)足的發(fā)展，尤其是紫外-可見吸收光譜法(比色法)和熒光光譜法[6]，研究者們對(duì)其產(chǎn)生了極大的興趣，遺憾的是在校本科生對(duì)該領(lǐng)域的接觸機(jī)會(huì)不多。有機(jī)分子探針的研究涉及有機(jī)化學(xué)、分析化學(xué)、無機(jī)配位化學(xué)以及物理化學(xué)等方面的專業(yè)基礎(chǔ)知識(shí)，并且通過多種儀器研究探針分子的檢測(cè)性能，探索檢測(cè)機(jī)理。因此，如果可以將分子探針的設(shè)計(jì)和應(yīng)用研究納入本科生的教學(xué)中，不僅可以使學(xué)生掌握分析檢測(cè)新方法，了解分析儀器的工作原理和使用方法，而且可以促進(jìn)學(xué)生對(duì)所學(xué)多學(xué)科知識(shí)的融會(huì)貫通，激發(fā)學(xué)生對(duì)前沿科學(xué)研究的熱情和興趣。

本實(shí)驗(yàn)采用商品化的試劑鄰苯二甲醛(OPA)作為探針分子，避免了探針分子的合成與分離，保障了實(shí)驗(yàn)教學(xué)在有限課時(shí)內(nèi)順利實(shí)施。實(shí)驗(yàn)內(nèi)容包含標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制、紫外-可見吸收/熒光光譜測(cè)試、檢測(cè)限的計(jì)算、結(jié)合比的確定及分析機(jī)理的驗(yàn)證(包括核磁共振氫譜和高分辨質(zhì)譜)等幾部分。本實(shí)驗(yàn)適用于化學(xué)及相關(guān)專業(yè)高年級(jí)本科生的教學(xué)，使學(xué)生體驗(yàn)科學(xué)研究的趣味性與嚴(yán)謹(jǐn)性，培養(yǎng)正確的科學(xué)態(tài)度，為后續(xù)的繼續(xù)深造和就業(yè)打下基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/h3>

(1) 掌握紫外-可見分光光度計(jì)和熒光分光光度計(jì)的基本操作。

(2) 掌握分子探針法對(duì)分析物的測(cè)定方法。

(3) 學(xué)習(xí)動(dòng)態(tài)弱相互作用的光譜分析方法。

(4) 學(xué)習(xí)核磁共振波譜儀和質(zhì)譜儀的使用。

(5) 掌握實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理和實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析能力，培養(yǎng)學(xué)生的創(chuàng)新意識(shí)。

1.2 實(shí)驗(yàn)原理

含巰基的物質(zhì)和醛類可以發(fā)生親核加成反應(yīng)形成半縮硫醛，如圖1a所示。伯胺類化合物可以和醛脫水反應(yīng)形成亞胺(圖1b)。將此二者有機(jī)結(jié)合起來，即含有兩個(gè)醛基的鄰苯二甲醛可以和既含有巰基又含有氨基的物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)形成巰基取代的噻唑類化合物(圖1c)[7,8]，該結(jié)構(gòu)在350 nm紫外光照射下有藍(lán)色熒光。因此，OPA可以和既含有巰基又含有氨基的還原型谷胱甘肽反應(yīng)生成苯并噻唑類物質(zhì)(圖2)，如果將OPA與GSH的溶液混合，二者反應(yīng)會(huì)出現(xiàn)苯并噻唑特有的光譜，在340 nm附近出現(xiàn)明顯的紫外吸收峰，420 nm處有亮藍(lán)色熒光出現(xiàn)，說明OPA可以用于GSH的光譜檢測(cè)。

圖1 巰基(a)或氨基(b)類化合物與醛類物質(zhì)的反應(yīng)和OPA與巰基和氨基類化合物的反應(yīng)(c)

圖2 探針OPA與GSH的反應(yīng)方程式

1.3 儀器與試劑

1.3.1 儀器

EL104電子分析天平(瑞徽電子，中國(guó))，F(xiàn)E20實(shí)驗(yàn)室用pH計(jì)(米科，中國(guó))，UH5300紫外-可見分光光度計(jì)(Hitachi，日本)，F(xiàn)-4600熒光分光光度計(jì)(Hitachi，日本)，365 nm紫光燈，ICP-MS電耦合等離子體質(zhì)譜儀(PerkinElmer，美國(guó))，500 MHz核磁共振波譜儀(Bruker，瑞士)。

1.3.2 試劑

分析純鄰苯二甲醛(> 99.0%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)，還原型谷胱甘肽(≥ 98.0%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)，二水合磷酸二氫鈉(≥ 99.0%，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，十二水合磷酸氫二鈉(≥ 99.0%，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，光譜純二甲基亞砜(≥ 99.0%，生工生物工程股份有限公司)，去離子水(實(shí)驗(yàn)室自制)。

1.4 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容

1.4.1 溶液配制

準(zhǔn)確稱量0.0134 g鄰苯二甲醛，加入10 mL DMSO溶解，配制成濃度為1 × 10?2mol?L?1的溶液。準(zhǔn)確稱取0.0307 g還原型谷胱甘肽，用10 mL去離子水溶解，配制成濃度為1 × 10?2mol?L?1的溶液。用二水合磷酸二氫鈉和十二水合磷酸氫二鈉配制濃度1 × 10?2mol?L?1，pH為7.2的緩沖液。

1.4.2 光譜測(cè)試

準(zhǔn)確移取25 μL上述鄰苯二甲醛溶液，向其中加入2.0 mL磷酸緩沖鹽溶液(PBS)，再加入一定體積的谷胱甘肽溶液，用PBS緩沖液稀釋至5.0 mL。此時(shí)溶液中鄰苯二甲醛的濃度為5 × 10?4mol?L?1。將此溶液在25 °C下靜置20 min后用1 cm石英池測(cè)其紫外-可見吸收光譜和熒光光譜。熒光光譜測(cè)試時(shí)，設(shè)置儀器激發(fā)和發(fā)射狹縫均為5 nm，激發(fā)波長(zhǎng)為350 nm。

1.4.3 GSH檢測(cè)限的測(cè)定

向含有5 × 10?4mol?L?1OPA的PBS緩沖溶液中加入不同濃度的GSH，使得最終溶液中GSH與OPA的比例為0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1.0。溶液靜置20 min后測(cè)試紫外-可見吸收光譜和熒光光譜，分別以340 nm處吸光度和420 nm處熒光強(qiáng)度對(duì)GSH濃度做校準(zhǔn)曲線，計(jì)算其斜率k。根據(jù)LOD = 3.3s/k計(jì)算OPA對(duì)GSH的檢測(cè)限[9,10]，式中，LOD表示檢測(cè)限，k為校準(zhǔn)曲線的斜率，s為OPA空白樣品的標(biāo)準(zhǔn)偏差(測(cè)試11次)。

1.4.4 OPA與GSH結(jié)合比的測(cè)定

OPA與GSH之間以兩重動(dòng)態(tài)可逆共價(jià)鍵結(jié)合，因此，可采用等摩爾連續(xù)變化(Job’s plot)法測(cè)定二者結(jié)合比[11]。具體實(shí)驗(yàn)方法是保持溶液中OPA與GSH的濃度之和為1 × 10?3mol?L?1，逐漸改變二者比例，配制如表1所示的11組溶液，分別測(cè)試其紫外-可見吸收光譜，用420 nm吸光度對(duì)X(X=[GSH]/([OPA] + [GSH]))值作圖，得到Job’s plot曲線，擬合曲線獲得拐點(diǎn)可知二者的結(jié)合比。

表1 Job’s Plot (OPA與GSH)濃度配量表

1.4.5 GSH檢測(cè)機(jī)理的驗(yàn)證

(1) 核磁共振氫譜(1H NMR)。分別測(cè)試OPA以及OPA與GSH反應(yīng)生成物的核磁共振氫譜，通過對(duì)比分析證實(shí)二者的反應(yīng)機(jī)理。

(2) 高分辨質(zhì)譜(HR-MS)。測(cè)試OPA與GSH反應(yīng)液的高分辨質(zhì)譜，分析質(zhì)譜數(shù)據(jù)，驗(yàn)證反應(yīng)機(jī)理。核磁共振氫譜和高分辨質(zhì)譜測(cè)試樣品由學(xué)生準(zhǔn)備，相關(guān)教師負(fù)責(zé)測(cè)試。

2 結(jié)果與討論

2.1 紫外-可見吸收光譜和熒光光譜測(cè)試

如圖3a所示，OPA在PBS緩沖液中的最大吸收峰在260 nm附近，300 nm處的吸收峰為n–π*躍遷產(chǎn)生的吸收帶，溶液呈無色，GSH在所測(cè)試范圍內(nèi)沒有吸收峰，將二者混合后于340 nm處出現(xiàn)很強(qiáng)的吸收峰，溶液顏色隨之變?yōu)榈S色。對(duì)應(yīng)的熒光光譜顯示(圖3b)，OPA與GSH完全沒有熒光發(fā)射，而二者混合液在420 nm處出現(xiàn)明顯的熒光信號(hào)，在365 nm紫光燈下顯示亮藍(lán)色熒光。這些光譜數(shù)據(jù)表明OPA可以用于GSH的紫外/熒光雙通道檢測(cè)。

圖3 在PBS緩沖溶液中OPA、GSH以及OPA + GSH的紫外-可見吸收光譜(a)和熒光光譜(b)

2.2 檢測(cè)限測(cè)定結(jié)果

如圖4(a)所示，向含有5 × 10?4mol?L?1OPA的PBS緩沖溶液中加入不同濃度的GSH，隨著GSH濃度的增大，溶液在340 nm處的吸光度不斷增加，吸光度與GSH和OPA濃度比呈線性(y= 2.56x? 0.0077，線性相關(guān)系數(shù)為0.9938)，擬合結(jié)果如圖4(b)所示，依此計(jì)算OPA對(duì)GSH的檢測(cè)限是1.6 × 10?7mol?L?1。

圖4 (a) OPA與不同濃度的GSH作用后的紫外-可見吸收光譜；(b) 340 nm吸光度的線性擬合

對(duì)應(yīng)的熒光光譜如圖5所示，隨著GSH濃度的增大溶液在420 nm處的熒光發(fā)射峰不斷增強(qiáng)，420 nm熒光強(qiáng)度與GSH和OPA濃度比也呈良好的線性(y= 5706.42x? 100.62，線性相關(guān)系數(shù)為0.9914)，由熒光強(qiáng)度計(jì)算OPA對(duì)GSH的檢測(cè)限是8.4 × 10?8mol?L?1。

圖5 (a) OPA與不同濃度的GSH作用后的熒光光譜；(b) 420 nm熒光強(qiáng)度的線性擬合

2.3 OPA與GSH結(jié)合比

采用等摩爾連續(xù)變化(Job’s Plot)法探討OPA與GSH結(jié)合比，通過測(cè)試配制的11組溶液紫外-可見吸收光譜，以340 nm吸光度對(duì)X值作圖，得到Job’s plot曲線如圖6所示，可見X值為0.5處是兩側(cè)曲線擬合線的交點(diǎn)，說明OPA與GSH之間的結(jié)合比為1 : 1。

圖6 OPA與GSH反應(yīng)的Job’s plot曲線

2.4 GSH檢測(cè)機(jī)理的驗(yàn)證

2.4.1 核磁共振氫譜

分別測(cè)試OPA以及OPA與GSH反應(yīng)生成物的核磁共振氫譜，通過對(duì)比證實(shí)二者的反應(yīng)機(jī)理。鄰苯二甲醛在水溶液中存在時(shí)會(huì)有單水合物和二水合物(C6H4(CHO)(CH(OH)2)和C6H4(CH(OH))2O)存在(圖7)[12]，因此其核磁共振氫譜出現(xiàn)兩套峰(圖8)，10.3處是醛基氫的信號(hào)，7.82和7.92處的兩組峰為OPA苯環(huán)質(zhì)子信號(hào)，6.15、6.36和7.30是OPA二水合物的信號(hào)峰；GSH在低場(chǎng)沒有信號(hào)。將而這混合后可發(fā)現(xiàn)10.3、7.82和7.92的信號(hào)明顯降低，7.3–7.4間的信號(hào)增強(qiáng)，說明OPA與GSH作用形成苯并噻唑環(huán)。

圖7 鄰苯二甲醛與其單水合物、二水合物的結(jié)構(gòu)式

圖8 OPA與GSH反應(yīng)前后的核磁共振氫譜

2.4.2 高分辨質(zhì)譜

向含有5 × 10?4mol?L?1OPA的PBS緩沖液中加入等物質(zhì)的量的GSH，反應(yīng)完成后的溶液測(cè)試高分辨質(zhì)譜，采用ESI離子源，負(fù)離子模式。由圖9可以看出，ESI-MS數(shù)據(jù)顯示OPA與GSH作用后出現(xiàn)404.0923 (m/z)的負(fù)離子信號(hào)峰，測(cè)試結(jié)果與預(yù)期產(chǎn)物的理論計(jì)算值一致(C18H18N3O6S?的理論計(jì)算值：404.0922)，進(jìn)一步證實(shí)了OPA與GSH的反應(yīng)機(jī)理。

圖9 OPA與GSH反應(yīng)后的高分辨質(zhì)譜

3 實(shí)驗(yàn)的實(shí)施與反饋

我們?cè)诒緦W(xué)院化學(xué)專業(yè)本科三年級(jí)的學(xué)生中已經(jīng)開展了三輪本實(shí)驗(yàn)的教學(xué)，教學(xué)效果良好，學(xué)生反饋積極。具體的實(shí)驗(yàn)教學(xué)以小組為單位施行，2–3人一組，實(shí)驗(yàn)設(shè)定4個(gè)學(xué)時(shí)。3次實(shí)驗(yàn)教學(xué)均順利完成，學(xué)生基本能夠在規(guī)定時(shí)間內(nèi)完成實(shí)驗(yàn)，并能夠準(zhǔn)確分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)、撰寫實(shí)驗(yàn)報(bào)告。學(xué)生普遍反映該實(shí)驗(yàn)不僅學(xué)習(xí)了多種分析儀器的使用以及數(shù)據(jù)分析方法，并且整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程充滿了趣味性，讓他們充分體驗(yàn)到了探索性研究的樂趣。

4 拓展思考

(1) OPA的水合作用對(duì)GSH的檢測(cè)有什么影響？

(2) 哪些因素會(huì)影響OPA對(duì)GSH檢測(cè)的準(zhǔn)確性？

(3) 如果溶液中含有半胱氨酸時(shí)會(huì)對(duì)GSH的檢測(cè)造成什么樣的影響？

5 結(jié)語(yǔ)

介紹了一個(gè)適合化學(xué)及相關(guān)專業(yè)本科生教學(xué)的儀器分析創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)用市售試劑OPA作為底物，通過光譜分析法檢測(cè)GSH，綜合了分析化學(xué)、有機(jī)化學(xué)、物理化學(xué)等學(xué)科的基礎(chǔ)知識(shí)和實(shí)驗(yàn)操作技能，促進(jìn)學(xué)生對(duì)不同學(xué)科知識(shí)的融會(huì)貫通，提升了學(xué)生的實(shí)驗(yàn)操作技能及數(shù)據(jù)分析處理能力，調(diào)動(dòng)了學(xué)生的科研興趣。本實(shí)驗(yàn)與前沿科學(xué)研究密切接軌，以實(shí)驗(yàn)課堂教學(xué)的方式向本科生介紹前沿科研，加速學(xué)生對(duì)科研的融入，充分激發(fā)其科研熱情，為學(xué)生畢業(yè)后的繼續(xù)深造和就業(yè)奠定基礎(chǔ)。