明膠-檸檬酸-硬脂酸復(fù)合凝膠的制備及性能

郭華，史澤毅，張海霞，鄧博，王亞雄，靳利娥*

（1.太原理工大學(xué)科學(xué)技術(shù)研究院，山西太原 030024）（2.太原理工大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，山西太原 030024）

明膠（Gelatin，GA）是膠原蛋白的部分水解產(chǎn)物，為一種天然兩性生物高分子[1]，由于其可再生、成本低、生物相容性和可生物降解性等特點(diǎn)廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域[2,3]。明膠除了持水性、成膜性、乳化性、起泡性的特性外，還具有獨(dú)特的凝膠性，是制備凝膠的最佳原料[4,5]，明膠凝膠具有優(yōu)異的生物相容性、細(xì)胞粘附性、可生物降解性等特點(diǎn)。明膠分子鏈柔性差，單一組分制備凝膠時(shí)機(jī)械性能和保水性較差，限制其應(yīng)用[6-8]。明膠分子結(jié)構(gòu)上有大量的羥基、羧基和氨基，有利于與其他物質(zhì)結(jié)合制備復(fù)合凝膠，Guiseppe等[9]利用海藻酸鈉與明膠共混制備的凝膠可提高機(jī)械性能，但制備凝膠降解速率快。Moreira等[10]利用乳酸和醋酸改性明膠，可增加復(fù)合凝膠的水分吸收速率，但力學(xué)性沒(méi)有提升。Tseng等[11]制備了殼聚糖-明膠復(fù)合凝膠，由于使用的交聯(lián)劑是戊二醛，京尼平，使得生物相容性方面出現(xiàn)弊端。硬脂酸（Stearic acid，SA）是一種疏水性極強(qiáng)的飽和脂肪酸，能夠應(yīng)用到復(fù)合材料方面起疏水性的作用[12]，Sobhana等[13]將疏水性硬脂酸和親水性纖維素通過(guò)連接劑層狀雙氫氧化物（LDH），制得一種超疏水性復(fù)合材料。Khalifeh等[14]通過(guò)在高純度鎂上涂覆硬脂酸，發(fā)現(xiàn)疏水涂層可使高純度鎂的腐蝕速率降低1000倍以上，有效提高了耐腐蝕性。硬脂酸疏水性強(qiáng)但存在水溶性差、復(fù)合時(shí)分散不均勻等問(wèn)題，從而限制其應(yīng)用，如果能將二者有效的融合形成復(fù)合凝膠，則可互補(bǔ)雙方缺點(diǎn)，擴(kuò)展其應(yīng)用范圍。

檸檬酸（Citric acid，CA）是一種常用的高分子材料交聯(lián)劑，可提供檸檬酸根和羥基，反應(yīng)活性強(qiáng)、無(wú)毒、容易降解[15,16]，用檸檬酸作交聯(lián)劑制備的復(fù)合凝膠表面均勻光滑、內(nèi)部具有豐富的空隙、無(wú)細(xì)胞毒性、具有良好的藥物緩釋效[17]。本文利用檸檬酸作為交聯(lián)劑，在酸性溶液中，明膠中質(zhì)子化的氨基可與檸檬酸根產(chǎn)生靜電相互作用，羥基可與硬脂酸的羧基形成大分子物質(zhì)，將硬脂酸與明膠有機(jī)結(jié)合，制備得明膠-檸檬酸-硬脂酸（GA-CA-SA）復(fù)合凝膠。以壓縮強(qiáng)度為指標(biāo)采用響應(yīng)曲面法優(yōu)化復(fù)合凝膠制備條件，紅外光譜和電鏡考察其結(jié)構(gòu)，體外細(xì)胞相對(duì)增殖率（Cell relative growth rate，RGR）法研究其生物相容性。以姜黃素（Curcumin，Cur）為模型化合物研究了藥物緩釋性能。本研究為制備高力學(xué)強(qiáng)度、可降解和無(wú)毒性復(fù)合凝膠材料提供了一種新途徑，同時(shí)也為明膠基復(fù)合凝膠在生物醫(yī)用載藥領(lǐng)域的應(yīng)用提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

明膠（CP）、硬脂酸（AR）、檸檬酸（AR）、乙二醇（AR）、小鼠巨噬細(xì)胞（RAW）無(wú)血清培養(yǎng)基（DMEM basic(1X)，賽默飛世爾(蘇州)儀器有限公司；細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8（CCK-8），北京科碩生物技術(shù)有限公司；姜黃素，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；Tween 80，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；pH=7.4的緩沖溶液：取7.36 g三聚磷酸鈉溶于200 mL去離子水中，配得磷酸緩沖鹽溶液（PBS），取0.38 mL Tween 80溶液加入PBS中，超聲震蕩溶解。

WDW-05型電子萬(wàn)能試驗(yàn)機(jī)，揚(yáng)州市博堯試驗(yàn)機(jī)械有限公司；Nicolet 6700型紅外光譜儀，深圳市瑞盛科技有限公司；S-4800型掃描電子顯微鏡，日本Hitachi公司；HF100型三氣培養(yǎng)箱，上海力申科學(xué)儀器有限公司；Multiskan Ascent型MK3酶標(biāo)儀，上海沛歐分析儀器有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 GA-CA-SA復(fù)合凝膠的制備

稱(chēng)取2 g明膠，在一定溫度的恒溫水浴中溶于10 mL去離子水；然后稱(chēng)取一定量硬脂酸，加1 mL乙二醇加熱溶解，與明膠溶液共混，再加入一定量檸檬酸，持續(xù)攪拌2 h。混合均勻，倒入柱狀模具中靜置12 h，然后置于冰箱（4 ℃）中放置24 h，-50 ℃真空冷凍干燥48 h，制得GA-CA-SA復(fù)合凝膠，GA-CA-SA復(fù)合凝膠表面均勻光滑，復(fù)合凝膠制備流程及實(shí)物圖如圖1所示。將2 g明膠溶于10 mL去離子水按上述方法制備得對(duì)照組明膠（Gelatin，GA）凝膠。

圖1 GA-CA-SA復(fù)合凝膠的制備流程Fig.1 Schematic of the GA-CA-SA composite gel preparation

1.2.2 單因素試驗(yàn)

以GA-CA-SA復(fù)合凝膠的壓縮強(qiáng)度為考察指標(biāo)，研究硬脂酸濃度、反應(yīng)溫度、不同交聯(lián)劑質(zhì)量對(duì)GA-CA-SA復(fù)合凝膠壓縮強(qiáng)度的影響。

1.2.3 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，根據(jù)響應(yīng)面Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，明膠濃度為0.2 g/mL，以硬脂酸SA濃度（X1）、檸檬酸濃度（X2）、反應(yīng)溫度（X3）3個(gè)因素為變量，以GA-CA-SA復(fù)合凝膠的壓縮強(qiáng)度（Y）為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)三因素三水平實(shí)驗(yàn)，因素與水平的取值見(jiàn)表1。

表1 Box-Behnken試驗(yàn)因素與水平Table 1 Box-Behnken factors and levels

1.2.4 GA-CA-SA復(fù)合凝膠壓縮強(qiáng)度測(cè)試

將直徑10 mm，高10 mm的柱狀凝膠試樣置于電子萬(wàn)能試驗(yàn)機(jī)上，恒定位移速率2 mm/min，測(cè)定復(fù)合凝膠的壓縮強(qiáng)度。當(dāng)壓縮應(yīng)力達(dá)到屈服點(diǎn)時(shí)，復(fù)合凝膠內(nèi)部發(fā)生斷裂，測(cè)試完成。壓縮強(qiáng)度按照公式（1）計(jì)算

式中：

L——壓縮強(qiáng)度，Pa；

F——壓縮應(yīng)力，N；

S——試樣的截面積，m2。

1.2.5 GA-CA-SA復(fù)合凝膠的結(jié)構(gòu)表征

掃描電子顯微鏡（SEM）觀察：將冷凍干燥后的GA凝膠與GA-CA-SA復(fù)合凝膠粉末真空表面噴金，在電鏡電壓為30 kV下觀察凝膠粉末表面形貌微觀結(jié)構(gòu)。

紅外表征：將制備的GA凝膠與GA-CA-SA復(fù)合凝膠研磨成粉末，40 ℃下真空干燥24 h，用KBr壓片，在500～4000 cm-1范圍內(nèi)測(cè)定樣品的紅外吸收光譜。

1.2.6 GA-CA-SA復(fù)合凝膠細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

按照GB/T 16886.5-2003[18]將GA-CA-SA復(fù)合凝膠粉末用無(wú)血清培養(yǎng)基于37 ℃、無(wú)菌條件下浸提24 h，取浸提液利用無(wú)血清培養(yǎng)基分別配制濃度為1 mg/mL、2 mg/mL、3 mg/mL、4 mg/mL的GA-CA-SA復(fù)合凝膠浸提液，備用。以1 mL無(wú)血清培養(yǎng)基為空白對(duì)照。

細(xì)胞相對(duì)增殖率（Rrelative growth rate，RGR）測(cè)定：將生長(zhǎng)良好的RAW細(xì)胞以100 μL/孔接種于96孔板，于37 ℃、飽和濕度、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。分5組，每組兩列，每列含6孔，分別加入20 μL GA-CA-SA復(fù)合凝膠浸提液（1 mg/mL、2 mg/mL、3 mg/mL、4 mg/mL）和空白對(duì)照液。繼續(xù)培養(yǎng)24 h，48 h，各選取一列孔，每孔加入100 μL CCK-8試劑，震蕩均勻，用酶標(biāo)儀于λ450nm測(cè)定各孔吸光度值，計(jì)算平均值。RGR按照公式（2）計(jì)算：

式中：

Ai——測(cè)試樣吸光度值；

A0——空白樣吸光度值；

S——相對(duì)偏差。

RGR越大，細(xì)胞活性越強(qiáng)，說(shuō)明制備的復(fù)合凝膠毒性越小，生物相容性越好。RGR≥100%為0級(jí)，75%～99%為1級(jí)，50%～74%為2級(jí)，25%～49%為3級(jí)，1%～24%為4級(jí)，0為5級(jí)。

1.2.7 GA-CA-SA復(fù)合凝膠的藥物緩釋實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)以水溶性較差、腸道難以吸收的姜黃素為模型藥物進(jìn)行考察GA-CA-SA復(fù)合凝膠對(duì)姜黃素的緩釋性能。

載姜黃素凝膠制備：在1.2實(shí)驗(yàn)中制備優(yōu)化后的GA-CA-SA復(fù)合凝膠時(shí)，明膠溶解后加入3 mg姜黃素磁力攪拌40 min至姜黃素溶解，然后再加硬脂酸及檸檬酸，制得明膠-檸檬酸硬脂酸-姜黃素復(fù)合凝膠（GA-CA-SA-Cur）。明膠溶解后只加入姜黃素，制得明膠-姜黃素凝膠（GA-Cur）為對(duì)照。

按照文獻(xiàn)[19]繪制姜黃素的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)得線(xiàn)性回歸方程（3）。姜黃素的濃度（Ci）按照回歸方程計(jì)算

體外緩釋姜黃素實(shí)驗(yàn)：稱(chēng)取1 g的GA-Cur凝膠和GA-CA-SA-Cur復(fù)合凝膠密封于經(jīng)沸水煮過(guò)的透析袋中，置于錐形瓶中，加入50 mL的緩沖液。在37 ℃的恒溫振蕩器中，以100 r/min的速率震蕩，每隔一定時(shí)間取3 mL緩沖液（同時(shí)用3 mL緩沖液補(bǔ)充進(jìn)錐形瓶）在425 nm測(cè)定吸光度值，按照公式（3），計(jì)算姜黃素濃度，然后代入公式（4）、（5）、（6）計(jì)算凝膠累積釋放姜黃素率（Qi），繪制時(shí)間-累積釋放率曲線(xiàn)，考察緩釋姜黃素性能。

式中：

Wr——第i次取樣時(shí)累積釋放姜黃素量，μg；

Ci——第i次取樣時(shí)測(cè)得的姜黃素濃度，μg/mL；

a——姜黃素的質(zhì)量，μg；

b——凝膠總質(zhì)量，μg；

m——姜黃素加入的總量，μg；

Wr0——凝膠中姜黃素的實(shí)際含量，μg；

Qi——第i次取樣時(shí)釋放姜黃素的百分率。

1.2.8 數(shù)據(jù)處理

利用Minitab 17進(jìn)行回歸擬合分析，p<0.01為回歸方程擬合度好。

2 結(jié)果與討論

2.1 響應(yīng)曲面法實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 SA質(zhì)量對(duì)復(fù)合凝膠壓縮強(qiáng)度的影響

在檸檬酸濃度0.015 g/mL，溫度70 ℃的條件下研究硬脂酸濃度（0.004、0.008、0.012、0.016、0.020 g/mL）對(duì)GA-CA-SA復(fù)合凝膠壓縮強(qiáng)度的影響，結(jié)果如圖2所示。

圖2 SA質(zhì)量對(duì)GA-CA-SA復(fù)合凝膠壓縮強(qiáng)度的影響Fig.2 Effect of SA mass on the compression strength of GA-CA-SA composite gel

從圖2可以看出，隨著硬脂酸質(zhì)量的增加，GA-CA-SA復(fù)合凝膠的壓縮強(qiáng)度均呈先增加后減小趨勢(shì)。GA-CA-SA復(fù)合凝膠在SA濃度為0.016 g/mL時(shí)，壓縮強(qiáng)度達(dá)到最大值101.442 kPa。明膠中含有大量的蛋白質(zhì)分子，溶液酸度（pH=4.7）小于明膠的等電點(diǎn)（pI=4.9），明膠中羧基解離受到抑制，氨基質(zhì)子化，此時(shí)明膠為聚陽(yáng)離子分子。在GA-CA-SA復(fù)合凝膠中，檸檬酸根是一種帶3個(gè)羧基的陰離子，檸檬酸根與質(zhì)子化的氨基產(chǎn)生靜電相互作用，羥基與硬脂酸羧基端相互作用。交聯(lián)劑將親水性的明膠和疏水性的硬脂酸進(jìn)行了有機(jī)結(jié)合，硬脂酸有效、均勻的摻入復(fù)合凝膠中，在應(yīng)力作用下，促進(jìn)了明膠大分子鏈的移動(dòng)，增加了分子間網(wǎng)絡(luò)阻力，增加了分子間作用力，降低了明膠的親水性，使得復(fù)合凝膠壓縮強(qiáng)度增強(qiáng)。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，SA添加量較少時(shí)，對(duì)復(fù)合凝膠的力學(xué)強(qiáng)度有所增加但未得到充足的發(fā)揮，當(dāng)SA濃度達(dá)到0.020 g/mL時(shí)，由于其溶解度低，會(huì)在復(fù)合凝膠溶液中發(fā)生凝結(jié)現(xiàn)象，難以均勻分散形成勻相狀態(tài)，可能會(huì)破壞了凝膠內(nèi)部分子結(jié)構(gòu)，抑制力學(xué)性能的增強(qiáng)。因此，硬脂酸的適宜濃度范圍為0.008～0.016 g/mL。

2.1.2 反應(yīng)溫度對(duì)復(fù)合凝膠壓縮強(qiáng)度的影響

在硬脂酸濃度0.012 g/mL，檸檬酸濃度0.015 g/mL的條件下，比較不同溫度（60、65、70、75、80 ℃）對(duì)GA-CA-SA復(fù)合凝膠壓縮強(qiáng)度的影響，結(jié)果如圖3所示。由圖可知，隨著溫度的增加，GA-CA-SA復(fù)合凝膠的壓縮強(qiáng)度均呈先增加后減小趨勢(shì)。在70 ℃時(shí)，各復(fù)合凝膠的壓縮強(qiáng)度均達(dá)到最大值，分別為97.49 kPa。分析原因?yàn)椋簻囟鹊母叩蜎Q定分子間作用力的強(qiáng)弱，明膠的溶解溫度為60 ℃以上，溫度較低時(shí)，明膠難以充分溶解，硬脂酸難以均勻的分散到凝膠溶液中。溫度較高時(shí)，可能會(huì)破壞明膠中蛋白質(zhì)部分二級(jí)鍵的存在，對(duì)復(fù)合凝膠內(nèi)部結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響，使得復(fù)合凝膠內(nèi)部結(jié)構(gòu)被破壞，導(dǎo)致凝膠力學(xué)強(qiáng)度下降。因此，制備GA-CA-SA復(fù)合凝膠溫度的適宜變化范圍為60～80 ℃。

圖3 溫度對(duì)GA-CA-SA復(fù)合凝膠壓縮強(qiáng)度的影響Fig.3 Effect of temperatures on the compression strength of GA-CA-SA composite gel

2.1.3 CA質(zhì)量對(duì)GA-CA-SA復(fù)合凝膠壓縮強(qiáng)度的影響

在硬脂酸濃度0.012 g/mL，溫度70 ℃條件下，比較檸檬酸濃度（0.005、0.010、0.015、0.020、0.025 g/mL）對(duì)GA-CA-SA復(fù)合凝膠壓縮強(qiáng)度的影響。

不同CA質(zhì)量對(duì)GA-CA-SA復(fù)合凝膠壓縮強(qiáng)度的影響如圖4所示?？梢钥闯?，隨著檸檬酸質(zhì)量的增加，復(fù)合凝膠的壓縮強(qiáng)度先增加后趨于平緩。分析原因?yàn)椋涸黾咏宦?lián)劑用量增大了復(fù)合凝膠的交聯(lián)密度，使凝膠內(nèi)部結(jié)構(gòu)更加致密，抑制明膠大分子鏈移動(dòng)，水分子不易滲透到凝膠內(nèi)部達(dá)到平衡，吸水性降低，故壓縮強(qiáng)度逐漸增加。檸檬酸用量超過(guò)1.49 wt%時(shí)，壓縮強(qiáng)度變化甚微。這可能是由于凝膠體系達(dá)到了靜電平衡狀態(tài)，分子間作用充分，交聯(lián)趨于平衡狀態(tài)。

圖4 CA質(zhì)量對(duì)GA-CA-SA復(fù)合凝膠壓縮強(qiáng)度的影響Fig.4 Effect of CA mass on the compression strength of GA-CA-SA composite gel

2.2 響應(yīng)曲面法實(shí)驗(yàn)結(jié)果

利用Box-Behnken[20]試驗(yàn)設(shè)計(jì)15個(gè)試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表2。其中12個(gè)析因點(diǎn)，3個(gè)零點(diǎn)。

表2 實(shí)驗(yàn)方案與結(jié)果Table 2 The experimental scheme and results

利用Minitab 17進(jìn)行回歸擬合分析，得到壓縮強(qiáng)度的回歸方程為：

Y=98.26+3.676X1+2.427X2-1.060X3-11.97X12-13.9 2X22-9.20X32+0.62X1X2+1.62X1X3+0.08X2X3。對(duì)模型方程進(jìn)行回歸分析如表3，方差分析如表4。

由表3可知；各因素對(duì)復(fù)合凝膠壓縮強(qiáng)度的影響依次為：硬脂酸質(zhì)量>檸檬酸質(zhì)量>溫度。其中，X12、X22、X32影響極顯著（p<0.01)。表4可知：F=25.60>F0.05(9,3)=8.81，p=0.001<0.01，表明該模型極顯著，模型的決定系數(shù)R2為97.88%，表明說(shuō)明回歸方程擬合度好，可對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行理論預(yù)測(cè)。

表3 回歸方程偏回歸系數(shù)的檢驗(yàn)Table 3 Test of partial regression coefficients of regression equation

表4 回歸方程各項(xiàng)的方差分析Table 4 Analysis of variance of regression equations

兩因素交互作用對(duì)復(fù)合凝膠壓縮強(qiáng)度的影響響應(yīng)曲面圖如圖5所示。由圖5可以看出每?jī)蓚€(gè)因素的交互作用對(duì)復(fù)合凝膠壓縮強(qiáng)度的影響先升高后降低，響應(yīng)值呈拋物線(xiàn)趨勢(shì)，回歸方程有極大值，可以預(yù)測(cè)最佳反應(yīng)條件。利用Minitab軟件優(yōu)化得到最佳工藝條件如圖6所示。

圖5 兩因素交互作用對(duì)壓縮強(qiáng)度的響應(yīng)曲面圖Fig.5 Response surface plots for operating parameters on compression

圖6 優(yōu)化的最佳工藝條件Fig.6 Optimized technological condition

由圖6可知，GA-CA-SA復(fù)合凝膠最佳的制備條件為：硬脂酸濃度、檸檬酸濃度、溫度分別為0.013 g/mL、0.015 g/mL、69 ℃時(shí)，壓縮強(qiáng)度的預(yù)測(cè)值為98.68 kPa。在該條件下進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，測(cè)得的GA-CA-SA復(fù)合凝膠壓縮強(qiáng)度平均值為99.05 kPa，與理論預(yù)測(cè)值相對(duì)誤差為0.38%，預(yù)測(cè)值可靠，擬合的方程有效，在此條件下測(cè)得的橫向應(yīng)變?chǔ)舩為4.85 mm，縱向應(yīng)變?chǔ)舮為13.12 mm，對(duì)應(yīng)的泊松比μ=εy/εx=2.71。在最佳條件下所測(cè)得GA凝膠壓縮強(qiáng)度為45.55 kPa，與之相比，GA-CA-SA復(fù)合凝膠壓縮強(qiáng)度提高了117%。這與Michael Di Guiseppe等人[21]制備的海藻酸-明膠水凝膠在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10 wt%時(shí)測(cè)定的彈性模量相比強(qiáng)度43 kPa相比，壓縮強(qiáng)度得到了極大的提高，可用于軟骨組織材料的應(yīng)用。

2.3 復(fù)合凝膠的結(jié)構(gòu)分析

2.3.1 GA-SA微觀結(jié)構(gòu)分析

GA凝膠和GA-CA-SA復(fù)合凝膠的掃描電鏡如圖7a、b所示。由圖7a可知，GA凝膠放大1000倍呈不規(guī)則的團(tuán)簇狀結(jié)構(gòu)，表面粗糙，放大5000倍表面致密，無(wú)明顯孔隙。圖7b GA-SA復(fù)合凝膠放大1000倍可以看出具有規(guī)則的疏松空隙結(jié)構(gòu)，放大5000倍空隙更加明顯，這可能是由于加入交聯(lián)劑檸檬酸后，硬脂酸被均勻、有效地?fù)饺霃?fù)合凝膠內(nèi)部，在應(yīng)力作用下，明膠大分子鏈被解聚，更多的水分子被引入凝膠內(nèi)部，經(jīng)過(guò)冷凍干燥時(shí)，固態(tài)水在低真空度下升華，該溫度下明膠與硬脂酸分子為凍結(jié)狀態(tài)，從而形成疏松的空隙結(jié)構(gòu)。該疏松的空隙結(jié)構(gòu)可為藥物運(yùn)輸以及細(xì)胞的黏附、增殖和分化提供優(yōu)良的環(huán)境。

圖7 GA凝膠與GA-CA-SA復(fù)合凝膠的掃描電鏡圖像Fig.7 SEM images of GA gel and GA-CA-SA composite gel

2.3.2 紅外光譜分析

GA凝膠和GA-CA-SA復(fù)合凝膠的紅外光譜如圖8所示，其中，3381 cm-1和2922 cm-1處分別是O-H鍵和N-H鍵伸縮振動(dòng)吸收峰，GA-CA-SA復(fù)合凝膠中這兩處吸收峰比GA凝膠吸收峰明顯增強(qiáng)，這可能是由于檸檬酸根與明膠中質(zhì)子化的氨基產(chǎn)生靜電作用以及活性基團(tuán)之間氫鍵作用的結(jié)果。881 cm-1處是C-C鍵伸縮振動(dòng)的吸收峰，GA-CA-SA復(fù)合凝膠同樣在該處伸縮振動(dòng)增強(qiáng)，進(jìn)一步證明在檸檬酸作用下硬脂酸與明膠發(fā)生交聯(lián)后，硬脂酸中長(zhǎng)鏈烷烴導(dǎo)致的結(jié)果。

圖8 GA凝膠和GA-CA-SA復(fù)合凝膠的紅外光譜圖Fig.8 Infrared spectrum of GA gel and GA-CA-SA composite

明膠的紅外吸收光譜主要由一系列酰胺模型的吸收區(qū)組成[22]。其中在1600～1700 cm-1為amide I，為進(jìn)一步探討形成GA-CA-SA復(fù)合凝膠后二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化，對(duì)GA凝膠和GA-CA-SA復(fù)合凝膠紅外圖譜中酰胺I帶范圍內(nèi)的振動(dòng)峰進(jìn)行去卷積和曲線(xiàn)擬合處理，結(jié)果如圖9a、9b所示。按Byler和Susi酰胺I帶蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)指認(rèn)方法[23]（1600～1630 cm-1，β折疊；1630～1650 cm-1，無(wú)規(guī)則卷曲；1645～1665 cm-1，α螺旋；1665～1685 cm-1，β轉(zhuǎn)角）進(jìn)行子峰峰位歸屬，計(jì)算各子峰面積在總面積中的百分含量得二級(jí)結(jié)構(gòu)的含量如表5。

圖9 GA凝膠和GA-CA-SA復(fù)合凝膠的酰胺I帶紅外擬合曲線(xiàn)Fig.9 Infrared fitting curve of amide I about GA gel and GA-CA-SA composite gel

由表5可以看出，形成GA-CA-SA復(fù)合凝膠后，二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯變化，其中β轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)增加最多，可達(dá)27.12%，α螺旋增加了3.97%。β折疊和無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)相應(yīng)減少，分別為2.02%、21.72%。

表5 GA凝膠和GA-CA-SA復(fù)合凝膠二級(jí)結(jié)構(gòu)相對(duì)百分含量Table 5 The relative percentage of secondary structure of GA gel and GA-CA-SA composite gel (%)

分析其原因可能是由于明膠凝膠的形成主要作用力為鏈內(nèi)氫鍵和鏈間氫鍵[24,25]。其中，Gly-Pro-、Pro-（或HPro）、-Gly-Pro-Pro結(jié)構(gòu)被認(rèn)為是凝膠形成的鍵接點(diǎn)，穩(wěn)定了明膠的螺旋結(jié)構(gòu)[26]。當(dāng)加入硬脂酸和檸檬酸后，由于反應(yīng)體系中的pH小于明膠的等電點(diǎn)，明膠中氨基質(zhì)子化，帶正電荷，檬酸羧基端與明膠中質(zhì)子化的氨基以靜電作用相互結(jié)合，檸檬酸的羥基端與硬脂酸羧基端進(jìn)行作用，改變了明膠的二級(jí)結(jié)構(gòu)及鏈內(nèi)氫鍵和鏈間氫鍵，導(dǎo)致β折疊和無(wú)規(guī)則卷曲減少，β轉(zhuǎn)角和α螺旋增加。這樣在形成凝膠時(shí)，由于檸檬酸的交聯(lián)作用，使得親水性的明膠排列在外面，疏水性的硬脂酸包裹在里邊。具有較為規(guī)則的排列方式，并形成了孔隙，進(jìn)一步印證了SEM的微觀結(jié)構(gòu)。檸檬酸交聯(lián)明膠與硬脂酸可能的作用機(jī)理圖10所示。

圖10 GA-CA-SA形成機(jī)理Fig.10 The formation mechanism of GA-CA-SA composite gel

2.4 細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)

按照1.6進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，計(jì)算不同濃度GA-CA-SA復(fù)合凝膠的細(xì)胞相對(duì)增值率結(jié)果如圖11所示。

由圖11可以看出：濃度為1 mg/mL、2 mg/mL、3 mg/mL、4 mg/mL的GA-CA-SA復(fù)合凝膠浸提液中細(xì)胞生長(zhǎng)24 h后RAR值分別為102.82%、106.53%、104.41%和116.28%，再繼續(xù)浸泡48 h后測(cè)得的RGR為122.01%、129.22%、127.73%和132.29%，兩個(gè)時(shí)間段內(nèi)測(cè)得的RAW細(xì)胞的RAR值均大于100%，細(xì)胞毒性為0級(jí)，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，RGR增加。因此，GA-CA-SA復(fù)合凝膠無(wú)毒，具有良好的生物相容性，可應(yīng)用于藥物緩釋和組織工程。

圖11 不同濃度GA-CA-SA復(fù)合凝膠中細(xì)胞相對(duì)增值率Fig.11 The relative growth rate of cells at different concentrations of GA-CA-SA composite gel

2.5 GA-SA復(fù)合凝膠的姜黃素緩釋分析

按照1.7進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，GA-Cur凝膠和GA-CA-SA-Cur復(fù)合凝膠緩釋姜黃素的時(shí)間-累積釋放率曲線(xiàn)如圖12所示。圖12可以看出，GA-Cur凝膠和GA-CA-SA-Cur凝膠中的姜黃素均在初始階段發(fā)生突釋?zhuān)S后平緩釋放。但在48 h之內(nèi)，GA-CA-SA-Cur凝膠的姜黃素釋放率明顯低于GA-Cur凝膠，48 h后都逐漸趨于平緩，120 h后GA-Cur凝膠和GA-CA-SA-Cur凝膠累計(jì)釋藥率分別達(dá)到92.32%和98.60%，說(shuō)明與GA-Cur凝膠相比，GA-CA-SA-Cur凝膠累計(jì)釋藥率略有所提高。對(duì)比姜黃素在兩種凝膠中的釋放行為，姜黃素在GA-CA-SA-Cur復(fù)合凝膠中初始釋放速率較慢，最終釋藥率高?？赡茉跈幟仕峤宦?lián)后，復(fù)合凝膠中的明膠發(fā)生靜電作用的親水基團(tuán)減少，使復(fù)合凝膠的溶脹度下降，從而釋放姜黃素速率減緩，隨著時(shí)間的增加累積釋藥率達(dá)到最大而趨于平緩，這是因?yàn)殡S著時(shí)間的增加，擴(kuò)散使緩沖液濃度增加從而抑制了姜黃素的釋放作用；同時(shí)復(fù)合凝膠結(jié)構(gòu)更加致密，使得姜黃素釋放速率減慢，起到緩釋作用。

圖12 GA-Cur凝膠和GA-CA-SA-Cur復(fù)合凝膠緩釋姜黃素的累積釋放曲線(xiàn)Fig.12 Cumulative release curve of curcumin in GA-Cur gel and GA-CA-SA-Cur gel

3 結(jié)論

以明膠為原料，檸檬酸為交聯(lián)劑，利用疏水性物質(zhì)硬脂酸對(duì)其進(jìn)行改性，制備了GA-CA-SA復(fù)合凝膠。通過(guò)響應(yīng)曲面法優(yōu)化其最佳制備條件為：硬脂酸濃度為0.013 g/mL，檸檬酸濃度為0.015 g/mL，溫度為69 ℃。此時(shí)壓縮強(qiáng)度較明膠凝膠提高了117%。紅外光譜分析表明，由于檸檬酸的交聯(lián)作用，改變了明膠的二級(jí)結(jié)構(gòu)，β折疊和無(wú)規(guī)則卷曲減少，α螺旋和β轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)增多。在形成GA-CA-SA復(fù)合凝膠時(shí)，親水性的明膠排列在外面，疏水性的硬脂酸包裹在里邊，并形成了具有孔隙的結(jié)構(gòu)規(guī)則均勻的結(jié)構(gòu)。另外細(xì)胞毒性及姜黃素緩釋分析表明制備的GA-CA-SA復(fù)合凝膠內(nèi)部呈疏松空隙結(jié)構(gòu)，無(wú)細(xì)胞毒性，對(duì)姜黃素具有較好的緩慢釋放的效果，可以用作生物醫(yī)藥載體。