牛樟芝多糖對脂多糖應(yīng)激黃羽肉雞生長性能和空腸黏膜完整性的影響

葉金玲 范秋麗 林廈菁 王一冰 張 盛 茍鐘勇 蔣守群

(廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動物科學(xué)研究所，畜禽育種國家重點實驗室，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華南動物營養(yǎng)與飼料重點實驗室，廣東省畜禽育種與營養(yǎng)研究重點實驗室，廣州 510640)

在正常生理條件下，肉雞機(jī)體氧化與抗氧化常處于動態(tài)平衡中，但許多外源或內(nèi)源性刺激均可導(dǎo)致機(jī)體處于氧化應(yīng)激狀態(tài)，這對肉雞的健康養(yǎng)殖造成了嚴(yán)重的影響[1-2]。腸道是動物體內(nèi)最重要的消化器官，也是體內(nèi)第一個遭受到氧化損傷的器官。致病性大腸桿菌可以損傷雞腸道黏膜結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致氧化應(yīng)激，進(jìn)而影響腸道健康[3-4]。脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)，也稱作細(xì)菌內(nèi)毒素，是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁脂質(zhì)雙分子層的外層結(jié)構(gòu)，是構(gòu)建腸道炎癥較好的激活劑[5-6]。眾多研究學(xué)者通過腹腔或靜脈注射LPS引發(fā)肉雞發(fā)生急性炎癥反應(yīng)，并發(fā)現(xiàn)LPS還促進(jìn)了炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生和炎癥關(guān)鍵基因的表達(dá)[7-9]。

多糖主要是從植物、菌類等中提取的一種多聚糖，能夠提高機(jī)體免疫力和抗氧化水平，并具有抗腫瘤和抑菌等多種生物活性，同時具有安全低毒、無耐藥性、無污染和無殘留的特性[10-13]。研究表明，在飼糧中添加黃芪多糖(Astragaluspolysaccharide，APS)和人參多糖均可以通過減輕LPS引起的免疫應(yīng)激，改善腸道屏障功能，進(jìn)而顯著提高斷奶仔豬的平均日增重(ADG)和飼料轉(zhuǎn)化率[12]；在飼糧中添加2 g/kg的枸杞多糖可以增強(qiáng)肉雞消化酶活性、抗氧化能力和免疫力，進(jìn)而提高其生長性能[13]；在飼糧中添加1 000～4 000 mg/kg海藻多糖可促進(jìn)肉雞生長性能的提高，增強(qiáng)其抗氧化性能，并從形態(tài)、抗氧化狀態(tài)和腸道黏膜通透性等方面改善腸道屏障功能[11]。因此，天然活性多糖是目前一種很有前途的可替代抗生素的飼料添加劑。研究證實，食藥用真菌子實體多糖、菌絲體多糖和胞外多糖具有較強(qiáng)的抗氧化活性，且主要通過清除氧自由基、激活細(xì)胞外信號等途徑發(fā)揮抗氧化作用[14]。牛樟芝(Antrodiacinnamomea)為我國臺灣地區(qū)特有的真菌品種，又有牛樟菇、樟芝、紅牛樟芝和血靈芝等諸多別名。多糖是牛樟芝的主要活性成分，且主體結(jié)構(gòu)是葡萄糖，但其活性多糖是D-葡聚糖大分子結(jié)構(gòu)[15]。雖然多糖在肉雞上的研究報道相對較多，但主要集中在APS、枸杞多糖和藻類多糖(algae-derived polysaccharide，ADP)等，牛樟芝多糖(Antrodiacinnamomeapolysaccharide，ACP)的研究報道較少。為此，本試驗擬研究ACP、APS和ADP對快大型黃羽肉雞生長性能和空腸黏膜完整性的影響，以期為ACP應(yīng)用于肉雞生產(chǎn)，改善其腸道健康、促進(jìn)生長和提高養(yǎng)殖效益提供理論依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

LPS(血清型為O55∶B5，貨號L4005)購于Sigma公司；ACP(有效成分為D-葡聚糖，含量為76.3%)由臺灣某股份有限公司提供；APS(富含APS和黃芪甲苷，多糖含量為45%)購自北京某科技股份有限公司；ADP(有效成分為β-1,3-葡聚糖，含量為45%)購自珠海某科技有限公司。

1.2 試驗動物及設(shè)計

試驗在廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動物科學(xué)研究所試驗場進(jìn)行。選用1 200只健康狀況良好的9日齡快大型嶺南黃羽肉雞(母雛)，逐只稱重，根據(jù)體重一致原則分為8個組(每組6個重復(fù)，每個重復(fù)25只雞)，分別為：空白對照組(基礎(chǔ)飼糧)、LPS應(yīng)激組(基礎(chǔ)飼糧+LPS應(yīng)激)、抗生素組(基礎(chǔ)飼糧+LPS應(yīng)激+20 mg/kg維吉尼亞霉素)、100 mg/kg ACP組(基礎(chǔ)飼糧+LPS應(yīng)激+100 mg/kg ACP)、200 mg/kg ACP組(基礎(chǔ)飼糧+LPS應(yīng)激+200 mg/kg ACP)、400 mg/kg ACP組(基礎(chǔ)飼糧+LPS應(yīng)激+400 mg/kg ACP)、400 mg/kg APS組(基礎(chǔ)飼糧+LPS應(yīng)激+400 mg/kg APS)和200 mg/kg ADP組(基礎(chǔ)飼糧+LPS應(yīng)激+200 mg/kg ADP)。于18和20日齡，空白對照組每只雞腹腔注射0.50 mL的生理鹽水，其他組分別腹腔注射0.50 mL的LPS(500 μg/kg BW)。試驗期21 d。

1.3 飼養(yǎng)管理

試雞平養(yǎng)于封閉式雞舍，地面鋪放木屑，自由采食顆粒料和飲水，各組飼養(yǎng)管理和環(huán)境條件一致，按照常規(guī)操作程序和免疫流程進(jìn)行飼養(yǎng)和免疫。試驗期間人工控制舍內(nèi)光照，每天保持23 h光照，并自然通風(fēng)。每天08:00、14:00和20:00記錄雞舍溫度和相對濕度。

1.4 基礎(chǔ)飼糧

試驗采用玉米-豆粕型基礎(chǔ)飼糧，根據(jù)《中國飼料成分及營養(yǎng)價值表2004年第15版》配制，其組成及營養(yǎng)水平見表1?；A(chǔ)飼糧營養(yǎng)水平參考廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動物科學(xué)研究所新制定的農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY/T 3645—2020《黃羽肉雞營養(yǎng)需要量》科學(xué)配制。各組飼糧營養(yǎng)水平保持一致，抗生素和其他多糖添加劑按照不同添加水平等重量替代統(tǒng)糠。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(飼喂基礎(chǔ))

續(xù)表1項目 Items含量 Content賴氨酸 Lys1.13蛋氨酸 Met0.45蛋氨酸+半胱氨酸 Met+Cys0.87蘇氨酸 Thr0.83色氨酸 Trp0.25異亮氨酸 Ile0.86鈣 Ca1.00非植酸磷 NPP0.45

1.5 指標(biāo)測定與方法

1.5.1 生長性能

試驗過程中，每天觀察雞只健康狀況，一旦出現(xiàn)死雞，立即稱死雞重和剩料量，以消除死雞對試驗結(jié)果的影響。記錄死雞數(shù)量，同時立即查明原因，采取適當(dāng)措施。試驗開始和結(jié)束前1天19:00對試驗雞斷料、供水，次日07:00以重復(fù)為單位稱重，統(tǒng)計耗料量，計算平均日采食量(ADFI)、ADG、料重比(F/G)和存活率。

1.5.2 樣品的采集與指標(biāo)檢測

1.5.2.1 常規(guī)指標(biāo)檢測

于30日齡，每重復(fù)選取接近平均體重的2只雞,翅靜脈采血5 mL于加有肝素鈉的抗凝管，1 200×g離心10 min取上清。屠宰后取出空腸，用預(yù)冷的生理鹽水清洗內(nèi)容物，縱向剖開，刮去內(nèi)層黏膜裝入1.50 mL離心管中，-80 ℃保存。常規(guī)制備空腸組織勻漿液，按照體積比加入9倍體積預(yù)冷的生理鹽水，進(jìn)行組織勻漿后低溫離心(4 ℃、12 000×g，10 min)，取上清。利用二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒(江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司)測定上清中總蛋白含量。利用黃嘌呤氧化酶法測定血漿總超氧化物歧化酶(T-SOD)活性；二硫代二硝基苯甲酸(DT-NB)比色法測定血漿谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性；鐵(Fe)氧化還原法測定血漿總抗氧化能力(T-AOC)；硫代巴比妥酸(TBA)法測定血漿丙二醛(MDA)含量，以上試劑盒購自南京建成生物工程研究所。采用放射免疫法測定上清中腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、干擾素-γ(IFN-γ)、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)和白細(xì)胞介素-10(IL-10)含量，所需試劑盒購自北京北方生物技術(shù)研究所。以上指標(biāo)均在多功能酶標(biāo)儀(Spectra max M-5，Molecular Devices，美國)上讀數(shù)，各指標(biāo)具體檢測方法和結(jié)果計算均按照說明書進(jìn)行。

1.5.2.2 空腸組織形態(tài)檢測

每組肉雞取出空腸后選取腸道中段1～2 cm用生理鹽水進(jìn)行沖洗，將沖洗干凈的腸段放入提前準(zhǔn)備好的4%多聚甲醛保存過夜，進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋后，采用蘇木精-伊紅(HE)進(jìn)行染色處理，制成石蠟切片。采用Motic-BA210 Digital數(shù)碼顯微鏡對每組切片進(jìn)行40×視野拍照。拍照時盡量讓組織充滿整個視野，保證每張照片的背景光一致。應(yīng)用Image-Pro Plus 6.0軟件以40×標(biāo)尺為標(biāo)準(zhǔn)，每張切片選取5根最完整的絨毛，分別測量絨毛高度、隱窩深度和腸壁厚度，并計算絨隱比(絨毛高度/隱窩深度)。

1.5.2.3 空腸結(jié)構(gòu)完整性相關(guān)基因表達(dá)檢測

空腸腸段清洗干凈剪成2段放于1.50 mL離心管，-80 ℃保存?？俁NA的提取按照Trizol試劑盒說明書進(jìn)行操作，利用Nano-Drop 2000微量核酸測定儀檢測RNA的總濃度和純度。RNA反轉(zhuǎn)錄嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。實時熒光定量PCR(qRT-PCR)反應(yīng)(Bio-Rad CFX System)為20.0 μL體系：iTaq Universal SYBR Green Supermix(Bio-Rad，美國)10.0 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1.0 μL，cDNA模板2.0 μL(10倍稀釋)，ddH2O 6.0 μL；每個樣品3個重復(fù)孔。從GenBank中獲得所測基因的序列取保守區(qū)域設(shè)計引物，并選用管家基因β-肌動蛋白(β-actin)基因作為內(nèi)參基因。所需引物由上海生工生物有限公司合成，引物序列見表2，并用2-ΔΔCt法計算目的基因的mRNA相對表達(dá)量。

表2 實時熒光定量PCR引物序列

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件中的one-way ANOVA進(jìn)行單因素方差分析，在差異顯著的基礎(chǔ)上進(jìn)行Duncan氏法多重比較，顯著水平為P<0.05。試驗結(jié)果均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示。

2 結(jié) 果

2.1 ACP對LPS應(yīng)激黃羽肉雞生長性能的影響

由表3可知，與空白對照組相比，LPS應(yīng)激組肉雞末重、ADFI和ADG顯著降低(P<0.05)，而飼糧添加不同多糖對肉雞生長性能無顯著影響(P>0.05)。與LPS應(yīng)激組相比，其他組肉雞ADFI均顯著提高(P<0.05)，且飼糧添加200 mg/kg ADP顯著提高肉雞ADG(P<0.05)。與抗生素組相比，飼糧添加不同多糖對肉雞末重、ADFI和ADG均無顯著影響(P>0.05)。此外，飼糧添加不同多糖組之間肉雞生長性能均無顯著差異(P>0.05)。

表3 ACP對LPS應(yīng)激黃羽肉雞生長性能的影響

2.2 ACP對LPS應(yīng)激黃羽肉雞血漿和空腸黏膜抗氧化能力的影響

由表4可知，與空白對照組相比，LPS應(yīng)激組肉雞血漿中T-AOC顯著降低(P<0.05)，血漿和空腸黏膜中MDA含量顯著提高(P<0.05)。與LPS應(yīng)激組相比，飼糧添加200和400 mg/kg ACP顯著提高了肉雞血漿和空腸黏膜中T-SOD、GSH-Px活性和T-AOC(P<0.05)，飼糧添加ACP顯著降低了血漿和空腸黏膜中MDA含量(P<0.05)。與空白對照組或抗生素組相比，飼糧添加200和400 mg/kg ACP和400 mg/kg APS顯著提高了肉雞血漿和空腸黏膜中GSH-Px活性(P<0.05)，但對二者中T-SOD活性、T-AOC和MDA含量沒有顯著影響(P>0.05)。飼糧添加不同多糖各組肉雞血漿和空腸黏膜中T-SOD活性、T-AOC和MDA含量均無顯著差異(P>0.05)。

2.3 ACP對LPS應(yīng)激黃羽肉雞血漿和空腸黏膜炎癥因子的影響

由表5可知，與空白對照組相比，LPS應(yīng)激組肉雞血漿中TNF-α和IFN-γ含量顯著提高(P<0.05)，空腸黏膜中TNF-α、IL-1β和IL-6含量顯著提高(P<0.05)，空腸黏膜中抗炎因子IL-10含量顯著降低(P<0.05)。與LPS應(yīng)激組相比，飼糧添加抗生素、ACP和APS顯著降低了血漿中TNF-α和IFN-γ含量(P<0.05)，飼糧添加ACP和APS顯著降低了空腸黏膜中TNF-α、IL-1β和IL-6含量(P<0.05)，但只有飼糧添加100 mg/kg ACP顯著提高了空腸黏膜中IL-10含量(P<0.05)。與抗生素組相比，只有飼糧添加400 mg/kg ACP顯著降低了空腸黏膜中TNF-α含量(P<0.05)。除空腸黏膜中TNF-α含量外，不同ACP組間血漿和黏膜中炎癥因子含量均無顯著差異(P>0.05)，400mg/kg ACP組、400mg/kg APS組和200 mg/kg ADP組3個組之間血漿和黏膜中炎癥因子含量也沒有顯著差異(P>0.05)。

表4 ACP對LPS應(yīng)激黃羽肉雞血漿和空腸黏膜抗氧化能力的影響

表5 ACP對LPS應(yīng)激黃羽肉雞血漿和空腸黏膜炎癥因子的影響

續(xù)表5項目 Items組別 Groups空白對照Blank controlLPS應(yīng)激LPS stress抗生素Antibiotics100 mg/kg ACP200 mg/kg ACP400 mg/kg ACP400 mg/kg APS200 mg/kg ADP干擾素-γ IFN-γ8.51±0.659.40±0.558.88±1.018.41±1.138.39±0.607.95±1.028.64±0.788.69±0.73白細(xì)胞介素-1β IL-1β2.47±0.21b3.33±0.14a2.28±0.25bc1.83±0.23c2.11±0.13bc1.99±0.11bc2.35±0.12b2.29±0.19bc白細(xì)胞介素-6 IL-62.90±0.18b4.03±0.18a3.43±0.36ab3.00±0.30b3.16±0.26b3.01±0.26b3.26±0.13b3.53±0.28ab白細(xì)胞介素-10 IL-109.48±0.74a7.35±0.35b8.66±0.86ab9.60±1.22a9.18±0.72ab8.92±0.57ab8.98±0.57ab8.45±0.50ab

2.4 ACP對LPS應(yīng)激黃羽肉雞空腸組織形態(tài)的影響

如圖1所示，30日齡時，空白對照組肉雞空腸黏膜結(jié)構(gòu)完整，層次清晰，腸絨毛排列整齊，絨毛間及隱窩之間界限分明。相較于空白對照組，30日齡時，LPS應(yīng)激組肉雞腸壁厚度增加，空腸黏膜結(jié)構(gòu)紊亂、疏松，腸絨毛變短、破損，腸絨毛上皮細(xì)胞壞死、脫落，隱窩深度增加，且出現(xiàn)肥大，提示LPS可能影響位于隱窩部位的腸道干細(xì)胞進(jìn)而影響隱窩部位細(xì)胞增殖分化，最終導(dǎo)致絨毛結(jié)構(gòu)受損。相較于LPS應(yīng)激組和抗生素組，不同ACP組肉雞表現(xiàn)為空腸絨毛高度增加、隱窩深度降低以及使腸壁變薄，并且其腸絨毛更加完整。相較于各ACP組和400 mg/kg APS組，200 mg/kg ADP組肉雞空腸黏膜結(jié)構(gòu)完整性較差。

由表6可知，與空白對照組相比，LPS應(yīng)激組肉雞空腸絨毛高度顯著降低(P<0.05)，隱窩深度顯著增加(P<0.05)，絨隱比顯著降低(P<0.05)，腸壁厚度顯著增加(P<0.05)；各ACP組和400 mg/kg APS組空腸絨毛高度、隱窩深度和絨隱比均沒有顯著差異(P>0.05)。與LPS應(yīng)激組相比，各ACP組和400 mg/kg APS組空腸絨毛高度顯著增加(P<0.05)，隱窩深度顯著降低(P<0.05)，絨隱比顯著提高(P<0.05)，腸壁厚度也顯著降低(P<0.05)；200 mg/kg ADP組空腸絨毛高度沒有顯著變化(P>0.05)，隱窩深度顯著降低(P<0.05)，絨隱比顯著增加(P<0.05)，腸壁厚度也顯著降低(P<0.05)。與抗生素組相比，各ACP組和APS組的空腸絨毛高度沒有顯著變化(P>0.05)，隱窩深度顯著降低(P<0.05)，絨隱比顯著提高(P<0.05)，腸壁厚度也顯著降低(P<0.05)。與200 mg/kg ADP組相比，100 mg/kg ACP組空腸絨毛高度沒有顯著變化(P>0.05)，隱窩深度顯著降低(P<0.05)，絨隱比顯著提高(P<0.05)，腸壁厚度也顯著增加(P<0.05)。各ACP組和400 mg/kg APS組間空腸絨毛高度、隱窩深度和絨隱比均無顯著差異(P>0.05)。

2.5 ACP對LPS應(yīng)激黃羽肉雞空腸炎癥反應(yīng)和屏障功能相關(guān)基因mRNA相對表達(dá)量的影響

如圖2所示，與空白對照組相比，LPS應(yīng)激組肉雞空腸Toll樣受體4(TLR4)、核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)、TNF-α和IL-1β的mRNA相對表達(dá)量顯著提高(P<0.05)。與LPS應(yīng)激組和抗生素組相比，各ACP組和400 mg/kg APS組空腸TLR4、NF-κB和IL-1β的mRNA相對表達(dá)量顯著降低(P<0.05)，但空腸TNF-α的mRNA相對表達(dá)量無顯著差異(P>0.05)。與抗生素組相比，200 mg/kg ADP組空腸TLR4、TNF-α和IL-1β的mRNA相對表達(dá)量無顯著差異(P>0.05)，但空腸NF-κB的mRNA相對表達(dá)量顯著降低(P<0.05)。與空白對照組相比，各ACP組和400 mg/kg APS組空腸TLR4、NF-κB、TNF-α和IL-1β的mRNA相對表達(dá)量均無顯著差異(P>0.05)；各ACP組和400 mg/kg APS組間空腸TLR4、NF-κB、TNF-α和IL-1β的mRNA相對表達(dá)量無顯著差異(P>0.05)。

圖1 ACP對LPS應(yīng)激黃羽肉雞空腸組織形態(tài)的影響

表6 ACP對LPS應(yīng)激黃羽肉雞空腸組織形態(tài)的影響

如圖3所示，與空白對照組相比，LPS應(yīng)激組肉雞空腸黏蛋白2(MUC2)、封閉蛋白-1(claudin-1)、閉鎖小帶蛋白-1(ZO-1)和閉鎖蛋白(occludin)mRNA相對表達(dá)量顯著降低(P<0.05)。與LPS應(yīng)激組相比，各ACP組空腸MUC2、claudin-1、ZO-1和occludin mRNA相對表達(dá)量顯著提高(P<0.05)，400 mg/kg APS組空腸MUC2、claudin-1和occludin mRNA相對表達(dá)量顯著提高(P<0.05)，200 mg/kg ADP組空腸claudin-1 mRNA相對表達(dá)量顯著提高(P<0.05)。與抗生素組相比，飼糧添加200和400 mg/kg ACP顯著提高空腸MUC2、claudin-1和occludin mRNA相對表達(dá)量(P<0.05)。與空白對照組相比，ACP組和400 mg/kg APS組空腸MUC2、ZO-1和occludin mRNA相對表達(dá)量無顯著差異(P>0.05)，200 mg/kg ADP組空腸claudin-1、ZO-1和occludin mRNA相對表達(dá)量無顯著差異(P>0.05)。各ACP組和400 mg/kg APS組間空腸以上基因的mRNA相對表達(dá)量均無顯著差異(P>0.05)。

A：空白對照；B：LPS應(yīng)激；C：抗生素；D：100 mg/kg ACP；E：200 mg/kg ACP；F：400 mg/kg ACP；G：400 mg/kg APS；H：200 mg/kg ADP。數(shù)據(jù)柱標(biāo)注不同字母表示差異顯著(P<0.05)。圖3同。

圖3 ACP對LPS應(yīng)激黃羽肉雞空腸屏障功能相關(guān)基因mRNA相對表達(dá)量的影響

3 討 論

3.1 ACP對LPS應(yīng)激黃羽肉雞生長性能的影響

研究認(rèn)為，多糖如枸杞多糖[13]、APS[16]和牛膝多糖[17]能改善肉雞生長性能；也有研究發(fā)現(xiàn)，蘑菇多糖和螺旋藻多糖的應(yīng)用效果不明顯[9,18]。此外，研究表明，金針菇菇腳多糖(1 000 mg/kg)能顯著提高愛拔益加(AA)肉雞28～42日齡的ADG，顯著降低F/G，且在試驗?zāi)┢?43～49日齡)不添加的情況下仍發(fā)揮降低F/G的作用[19]。Shang等[20]研究發(fā)現(xiàn)，在AA肉雞飼糧中添加小刺猴頭菌多糖后，ADG和ADFI隨著添加水平的提高均呈線性和二次曲線提高，但各組間(0、1、3和5 g/kg)F/G無顯著差異。在科寶(Cobb)肉雞飼糧中添加螺旋藻可以增強(qiáng)熱應(yīng)激肉雞的體液免疫反應(yīng)，提高其抗氧化能力，但對其生長性能無顯著影響[21]。但是，在羅斯(Ross)308肉雞飼糧中添加螺旋藻后，8～21日齡、22～35日齡和1～35日齡的總增重、F/G和歐洲生產(chǎn)效率指數(shù)也都隨其添加水平的提高呈線性提高[22]。以上結(jié)果表明，多糖對肉雞生長性能的影響可能受動物品種、生長階段和環(huán)境的影響。本試驗結(jié)果表明，肉雞注射LPS對F/G沒有顯著影響，這與馬邯生等[23]和吳亞男等[24]的研究結(jié)果一致。其原因可能是LPS通過應(yīng)激抑制了動物采食中樞的局部興奮性，導(dǎo)致了采食量的降低，但采食量降低的同時也加快了機(jī)體分解代謝，導(dǎo)致ADG降低，致使F/G沒有發(fā)生顯著性變化。本研究中，與空白對照組相比，飼糧添加不同水平ACP對肉雞ADG、ADFI和F/G均無顯著影響，但卻一定程度上緩解了LPS對肉雞生長的抑制作用。這表明，ACP可以有效改善LPS應(yīng)激狀態(tài)下肉雞的生長性能，但卻沒有劑量依賴性，且從添加水平上對比其作用效果優(yōu)于APS和ADP；而與抗生素相比差異不顯著，說明ACP與抗生素對肉雞生長性能的作用效果基本一致。

3.2 ACP對LPS應(yīng)激黃羽肉雞血漿和空腸黏膜抗氧化能力的影響

T-SOD、GSH-Px、T-AOC和MDA是評價機(jī)體抗氧化能力的重要指標(biāo)[11-13]。研究發(fā)現(xiàn)，在嶺南黃羽肉雞53、56和59日齡時腹腔注射LPS(500 μg/kg BW)后，顯著降低了血清中超氧化物歧化酶(SOD)和GSH-Px活性，并且具有提高血清中MDA含量的趨勢[25]。本試驗研究也發(fā)現(xiàn)，LPS應(yīng)激顯著降低了30日齡肉雞血漿中T-AOC，顯著提高了血漿中MDA含量，這與前人研究結(jié)果基本一致。其結(jié)果差異性可能與肉雞注射LPS的次數(shù)和日齡有關(guān)，本試驗中在肉仔雞在18和20日齡時分別注射LPS，機(jī)體發(fā)育沒有53、56和59日齡時完善，所以試驗期間肉雞經(jīng)受了明顯的氧化應(yīng)激，導(dǎo)致血漿中脂質(zhì)過氧化的終產(chǎn)物MDA含量發(fā)生了顯著變化，具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

研究發(fā)現(xiàn)，飼糧添加海藻多糖可顯著提高肉雞血清中T-AOC以及SOD和GSH-Px活性，降低血清中MDA含量，從而提高肉雞的抗氧化能力，且效果優(yōu)于抗生素[26]。萬順康等[18]研究發(fā)現(xiàn)，飼糧添加螺旋藻多糖能顯著提高AA肉雞血清中T-SOD和GSH-Px活性，通過抑制其體內(nèi)羥自由基、超氧陰離子自由基的產(chǎn)生，從而顯著降低血清中MDA含量。此外，螺旋藻還可以通過提高Cobb肉雞血清SOD和GSH-Px活性，降低血清MDA含量，進(jìn)而增強(qiáng)熱應(yīng)激刺激下機(jī)體的抗氧化能力[21]。研究發(fā)現(xiàn)，APS對氫化可的松誘導(dǎo)產(chǎn)生的氧化應(yīng)激具有一定的干預(yù)作用，能夠提高AA肉雞血清中T-SOD和GSH-Px活性，降低血清中MDA含量[27]。本試驗結(jié)果與上述報道基本一致，與LPS相比，多糖顯著提高了肉雞血漿中T-SOD、GSH-Px活性以及T-AOC，并顯著降低了血漿中MDA含量，其中100 mg/kg ACP與400 mg/kg APS之間相比無顯著差異，并且ACP、APS和ADP的作用效果要優(yōu)于抗生素。

研究發(fā)現(xiàn)，多糖還可以提高肉雞[11]和鼠[28]的腸道抗氧化能力。本試驗結(jié)果也表明，與LPS相比，ACP顯著提高了空腸黏膜中T-SOD、GSH-Px活性以及T-AOC，并顯著降低了空腸黏膜中MDA含量。值得注意的是，ACP和APS各組間相比對肉雞空腸黏膜抗氧化能力無顯著差異。這提示ACP緩解了LPS對腸道的氧化損傷但沒有劑量依賴性，且其效果優(yōu)于抗生素和ADP。

總而言之，ACP可能是通過增強(qiáng)機(jī)體抗氧化酶的活性，減少LPS對腸道的氧化損傷，進(jìn)而改善LPS氧化應(yīng)激狀態(tài)下肉雞的生長性能且效果優(yōu)于抗生素、APS和ADP。

3.3 ACP對LPS應(yīng)激黃羽肉雞空腸組織形態(tài)的影響

腸道結(jié)構(gòu)的完整性是保證其正常生理功能的前提條件，如果破壞不但會影響腸道功能的發(fā)揮，還會影響肉雞的健康和生長性能，甚至影響食品安全和人類健康[4,11,29]。研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)激反應(yīng)(飲用氫化可的松水或肌肉注射環(huán)磷酰胺)可造成肉雞小腸黏膜氧化損傷，降低腸絨毛高度、絨隱比和絨毛表面積[30-31]。與應(yīng)激組(飲用氫化可的松水)相比，飼糧添加APS顯著提高肉雞小腸絨毛高度和寬度、黏膜厚度、絨隱比和絨毛表面積，且以0.40%的低劑量添加組效果突出，表明其對氧化應(yīng)激有一定的抑制作用[30]；飼糧添加APS也可顯著提高環(huán)磷酰胺應(yīng)激肉雞空腸絨毛高度、絨隱比以及腸道上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞和杯狀細(xì)胞數(shù)量[31]。此外，肉雞飼喂APS和黃芪總皂苷后，還可減少大腸桿菌引起的腸組織損傷和炎癥反應(yīng)，改善腸道免疫力，增強(qiáng)抗感染能力[3]。本試驗結(jié)果顯示，30日齡時，LPS應(yīng)激組肉雞腸黏膜結(jié)構(gòu)損傷嚴(yán)重，與上述報道基本一致。同時，也提示LPS可能影響位于隱窩部位的腸道干細(xì)胞進(jìn)而影響隱窩部位細(xì)胞增殖分化，最終導(dǎo)致絨毛結(jié)構(gòu)受損。此外，本試驗中，ACP和APS表現(xiàn)為提高空腸絨毛高度、降低隱窩深度以及使腸壁厚度變薄，而ADP組和抗生素組空腸黏膜結(jié)構(gòu)完整性相對較差。由此可見，不同活性多糖對LPS誘導(dǎo)的肉雞空腸損傷均具有保護(hù)作用，且初步推斷ACP和APS能夠增強(qiáng)腸道功能，其中，100 mg/kg ACP對腸黏膜修復(fù)作用最佳。

3.4 ACP對LPS應(yīng)激黃羽肉雞炎癥反應(yīng)和腸道屏障功能的影響

研究發(fā)現(xiàn)，LPS可以結(jié)合細(xì)胞表面的TLR4，進(jìn)而活化NF-κB信號通路，介導(dǎo)促炎因子如IL-1β、IL-6和TNF-α等參與炎癥反應(yīng)進(jìn)程[32-33]。大腸桿菌感染肉雞后，空腸中促炎性細(xì)胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α和NF-κBmRNA的表達(dá)量顯著上調(diào)[34]。在炎癥反應(yīng)導(dǎo)致細(xì)胞因子增加后，APS可以減少炎癥反應(yīng)因子，保護(hù)細(xì)胞或身體[35-36]。研究發(fā)現(xiàn)，APS還能提高環(huán)磷酰胺應(yīng)激肉雞空腸中抗炎因子白細(xì)胞介素-2(IL-2)和IL-10的表達(dá)[31]。體外研究發(fā)現(xiàn)(Caco2細(xì)胞模型)，添加APS可以有效緩解LPS感染的Caco2細(xì)胞的炎癥反應(yīng)，顯著下調(diào)TNF-α、IL-1β和白細(xì)胞介素-8(IL-8)的表達(dá)[37]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，APS通過抑制LPS誘導(dǎo)的NF-κB的激活，抑制TNF-α和IL-1β的表達(dá)[38]。另有研究也表明，APS對大腸桿菌的毒力減弱，其修復(fù)機(jī)制可能是通過TLR4/NF-κB信號通路介導(dǎo)的[39]。本試驗結(jié)果與以上研究結(jié)果基本一致，LPS顯著提高了血漿和空腸黏膜中炎癥因子的表達(dá)，引發(fā)了肉雞的炎癥反應(yīng)，成功建立了應(yīng)激模型；ACP、APS和ADP顯著降低了LPS誘導(dǎo)的血漿和空腸黏膜中炎癥因子的表達(dá)；只有100 mg/kg ACP顯著降低了血漿中炎癥因子TNF-α的含量，并顯著提高了空腸黏膜中抗炎因子IL-10的含量。由此可見，不同多糖有效緩解了LPS誘導(dǎo)的肉雞血漿和空腸黏膜損傷，但只有100 mg/kg ACP同時發(fā)揮了抑制炎癥因子和促進(jìn)抗炎因子的雙重作用，有效修復(fù)了LPS誘導(dǎo)的炎癥損傷。其作用機(jī)制可能與APS類似，即通過抑制LPS誘導(dǎo)的TLR4/NF-κB表達(dá)，進(jìn)而抑制炎癥因子的表達(dá)，最終發(fā)揮修復(fù)炎癥損傷的功能。

此外，LPS不但會提高炎癥因子的表達(dá)，而且還會影響腸道屏障功能[40]。由于腸道健康很大程度上也取決于腸道黏膜屏障是否完整，TLR4表達(dá)增加通常也與腸道屏障的衰竭有關(guān)[41-42]。緊密連接蛋白是腸黏膜屏障的重要部分，它們主要由MUC2、ZO-1、occludin和claudin-1[33,43]。MUC2是腸黏膜表面黏液的主要成分，可修復(fù)有害因素引起的腸黏膜膜損傷[44]。MUC2、ZO-1、occludin和claudin-1的mRNA相對表達(dá)量的下調(diào)會對腸道結(jié)構(gòu)和屏障功能造成損害。因此，本試驗進(jìn)一步研究了腸道屏障功能關(guān)鍵基因MUC2、ZO-1、occludin和claudin-1的表達(dá)，結(jié)果顯示ACP和APS顯著提高了LPS應(yīng)激狀態(tài)的空腸屏障功能關(guān)鍵基因mRNA相對表達(dá)量，其作用效果優(yōu)于抗生素和ADP。

4 結(jié) 論

綜上所述，在快大型嶺南黃羽肉雞基礎(chǔ)飼糧中添加ACP，可有效緩解LPS誘導(dǎo)的生長抑制、氧化損傷和腸道結(jié)構(gòu)損傷，且效果優(yōu)于抗生素；其作用機(jī)制可能與APS類似，即通過抑制LPS誘導(dǎo)的TLR4/NF-κB表達(dá)，進(jìn)而抑制炎癥反應(yīng)的發(fā)生，提高機(jī)體抗氧化能力并增強(qiáng)腸道黏膜屏障功能，充分發(fā)揮修復(fù)炎癥損傷的功能；由于ACP不存在添加劑量依賴性，建議添加100 mg/kg。