復(fù)合菌劑固態(tài)發(fā)酵對(duì)棗粉營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)的影響

邢曉南 趙雷云 黃曉瑜 張小強(qiáng) 張 宇 張恩平

(西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，楊凌 712100)

棗中含有豐富的生物活性物質(zhì)，如多糖、酚類化合物、三萜類化合物、維生素C、揮發(fā)油類化合物等[1]。我國(guó)棗資源豐富，年產(chǎn)量在800萬(wàn)t左右，其中有110萬(wàn)t左右殘次棗。殘次棗價(jià)格低廉、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和活性物質(zhì)豐富、易處理加工、適口性好，具有作為能量飼料、抗氧化劑等的潛力，近年來(lái)受到飼料行業(yè)的廣泛青睞。但殘次棗存在不耐貯存、營(yíng)養(yǎng)成分利用較差、雜菌毒素超標(biāo)等問(wèn)題，限制了其在飼糧中的應(yīng)用。微生物發(fā)酵飼料是依靠酵母菌、芽孢桿菌等有益微生物的新陳代謝，將飼料中不利于動(dòng)物消化吸收的一些大分子及抗?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)等降解轉(zhuǎn)化，形成一種富含高活性益生菌和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的生物飼料。它不僅能調(diào)節(jié)動(dòng)物腸道的微生態(tài)平衡，抑制和殺死有害菌，改善消化吸收能力，提高機(jī)體免疫功能，有效促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)，還具有保護(hù)環(huán)境，原料廣泛存在，投入少、產(chǎn)出多等優(yōu)勢(shì)[1-3]。白莉圓[4]研究表明，將植物乳桿菌和發(fā)酵乳桿菌按體積比1∶1混合，接種量為10%，麩皮和紅棗以干物料按質(zhì)量比3∶2混合，含水量為60%，在36.5 ℃下發(fā)酵48 h，發(fā)酵所得醪液中總酸含量為25.9 g/kg，甜酸適口，風(fēng)味協(xié)調(diào)，無(wú)異味。童鑫等[5]利用釀酒酵母和嗜酸乳桿菌對(duì)棗渣進(jìn)行發(fā)酵，確定了最優(yōu)復(fù)合菌劑配比為釀酒酵母∶嗜酸乳酸桿菌=2∶1；最佳接種量為15%；最適培養(yǎng)基為棗渣∶玉米∶麩皮∶硫酸銨∶碳酸鈣∶硫酸鎂∶磷酸二氫鉀=50.0∶20.0∶30.0∶1.0∶0.6∶0.4∶1.5；在發(fā)酵溫度為32 ℃的條件下發(fā)酵84 h，發(fā)酵產(chǎn)物的真蛋白質(zhì)含量比發(fā)酵前提高了5.38%。關(guān)于對(duì)棗粉進(jìn)行微生物發(fā)酵的研究較少，且發(fā)酵產(chǎn)品質(zhì)量參差不齊，品質(zhì)不一，微生物發(fā)酵棗粉技術(shù)落后。因此，優(yōu)化棗粉固態(tài)發(fā)酵工藝、降低毒素含量成為殘次棗飼料化利用迫切需要解決的問(wèn)題。

為了尋求固態(tài)發(fā)酵棗粉的最佳復(fù)合菌劑配比、發(fā)酵條件和發(fā)酵時(shí)間，進(jìn)一步提高棗粉的飼用價(jià)值和黃酮類功能成分含量，本試驗(yàn)將釀酒酵母、植物乳酸桿菌與枯草芽孢桿菌混合作為復(fù)合菌劑對(duì)棗粉進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵，優(yōu)化發(fā)酵條件，以發(fā)酵棗粉的營(yíng)養(yǎng)成分含量、pH和毒素含量作為指標(biāo)，綜合評(píng)價(jià)復(fù)合菌劑固態(tài)發(fā)酵對(duì)棗粉飼用品質(zhì)的影響，為殘次棗的飼料化利用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

發(fā)酵菌種：釀酒酵母2株(S2、S11)、植物乳酸桿菌2株(R7、R9)、枯草芽孢桿菌3株(B26、B37、C61)。以上菌株均分離自玉米秸稈，將各菌種與30%無(wú)菌甘油1∶1混合，于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

培養(yǎng)基：LB液體培養(yǎng)基、PDA液體培養(yǎng)基、MRS液體培養(yǎng)基均參考高旭紅[6]的方法配制，相應(yīng)的固體培養(yǎng)基在液體培養(yǎng)基成分的基礎(chǔ)上加入1.5%的瓊脂。

發(fā)酵原料：紅棗為陜西某公司提供的黃河灘棗，制成棗粉后使用；麩皮和豆粕均為市售飼料原料。發(fā)酵原料營(yíng)養(yǎng)水平見表1。

發(fā)酵袋：20 cm×30 cm單向出氣閥微生物專用發(fā)酵袋，購(gòu)自溫州冠華包裝材料有限公司。

表1 發(fā)酵原料營(yíng)養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

1.2 試驗(yàn)儀器

AIRTECH超凈工作臺(tái)、ZWALWAY-G154DW型高壓滅菌鍋、THERMO FISHER超純水儀、SUKUNSKY-200B恒溫培養(yǎng)搖床、EPOCH超微量分光光度儀、SARTORIOUS Pb-21型酸度計(jì)、VORTEX-5型渦旋振蕩器、EPPENDORF-5810離心機(jī)、THERMO TECH-320型循環(huán)水浴鍋、KT-R4300全自動(dòng)熱量?jī)x。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 試驗(yàn)1：正交試驗(yàn)優(yōu)化復(fù)合菌劑

復(fù)合菌劑中釀酒酵母、植物乳酸桿菌、枯草芽孢桿菌的配比為試驗(yàn)因素，設(shè)計(jì)3因素3水平正交試驗(yàn)，共9個(gè)組(Mix1～9組)。將解凍的菌液以4%的比例接種到相應(yīng)的液體培養(yǎng)基中，37 ℃、160 r/min恒溫?fù)u床(乳酸菌厭氧、靜置培養(yǎng))培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)結(jié)束后用滅菌的生理鹽水對(duì)各菌種進(jìn)行梯度稀釋；再取3個(gè)適宜梯度涂布于相應(yīng)的固體培養(yǎng)基上，37 ℃恒溫培養(yǎng)48 h，培養(yǎng)結(jié)束后挑取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的單菌落，點(diǎn)接種至相應(yīng)液體培養(yǎng)基，活化3代?；罨蟀幢?中的配比進(jìn)行接種，接種量為3%。各菌液中活菌數(shù)均≥9×109CFU/mL，其中釀酒酵母是由2株釀酒酵母(S2、S11)按1∶1比例混合后添加，植物乳酸桿菌是由2株植物乳酸桿菌(R7、R9)按1∶1比例混合后添加，枯草芽孢桿菌是由3株枯草芽孢桿菌(B26、B37、C61)按1∶1∶1比例混合后添加。棗粉、麩皮與豆粕的比例為7∶3∶1，含水量為30%，攪拌混勻后裝入發(fā)酵袋中，每袋300 g，每個(gè)組設(shè)3個(gè)重復(fù)，手工擠壓排氣后封口，37 ℃條件下發(fā)酵7 d，取樣測(cè)定營(yíng)養(yǎng)成分含量、pH。

表2 復(fù)合菌劑中釀酒酵母、植物乳酸桿菌、枯草芽孢桿菌的配比

1.3.2 試驗(yàn)2：正交試驗(yàn)優(yōu)化發(fā)酵條件

以復(fù)合菌劑(Mix4、Mix5、Mix8)、含水量(20%、30%、40%)、麩皮添加量(20%、30%、40%)為試驗(yàn)因素，設(shè)計(jì)3因素3水平的正交試驗(yàn)，共9個(gè)組(MixA～I(xiàn)組)，各組中含水量、麩皮添加量和復(fù)合菌劑見表3。按照試驗(yàn)設(shè)計(jì)將發(fā)酵菌種與發(fā)酵基質(zhì)混合，加水調(diào)節(jié)含水量，攪拌均勻，裝入發(fā)酵袋中，每袋300 g，密封發(fā)酵，發(fā)酵溫度控制在37 ℃。每個(gè)組設(shè)3個(gè)重復(fù)，0 h開始，每24 h取樣檢測(cè)pH(每個(gè)重復(fù)3個(gè)平行)，連續(xù)測(cè)定8次。取發(fā)酵0和168 h的樣品，進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)的測(cè)定，確定最佳發(fā)酵條件。

表3 各組的含水量、麩皮添加量和復(fù)合菌劑

1.3.3 試驗(yàn)3：?jiǎn)我蛩卦囼?yàn)確定發(fā)酵最佳時(shí)間

采用單因素設(shè)計(jì)試驗(yàn)，以發(fā)酵時(shí)間(1、2、3、4、5、6、7 d)為唯一變量，含水量、麩皮添加量、復(fù)合菌劑組合按照1.3.2所得最優(yōu)發(fā)酵條件設(shè)定。將發(fā)酵菌種與發(fā)酵基質(zhì)混合，加水調(diào)節(jié)含水量，攪拌均勻，裝入發(fā)酵袋中，每袋300 g，密封發(fā)酵，發(fā)酵溫度控制在37 ℃，每個(gè)發(fā)酵時(shí)間設(shè)3個(gè)重復(fù)，在設(shè)定的發(fā)酵時(shí)間取樣，檢測(cè)發(fā)酵產(chǎn)品的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量、pH和毒素含量的動(dòng)態(tài)變化，以確定最佳發(fā)酵時(shí)間。

1.4 測(cè)定指標(biāo)和測(cè)定方法

發(fā)酵棗粉的感官評(píng)定參考青貯飼料的評(píng)定方法[7]；pH參照王旭明等[8]的方法，稱取5 g發(fā)酵樣品，放入三角瓶中，加入50 mL蒸餾水，用磁力攪拌器攪拌15 min，靜置20 min后用pH計(jì)測(cè)定；還原糖含量采用3,5-二硝基水楊酸(DNS)比色法[9]測(cè)定；黃酮含量采用紫外分光光度法[10]測(cè)定；多酚含量采用Folin-Ciocaileu比色法[11]測(cè)定；干物質(zhì)、水分、粗脂肪、粗蛋白質(zhì)、粗灰分、酸性洗滌纖維、中性洗滌纖維、鈣、磷含量均參考《飼料分析及飼料質(zhì)量檢測(cè)技術(shù)》測(cè)定；總能采用彈式測(cè)熱計(jì)(Bomb Calorimeter)測(cè)定；黃曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮含量采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法測(cè)定。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

數(shù)據(jù)經(jīng)Excel 2010初步處理后，用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)，并采用Duncan氏法進(jìn)行多重比較檢驗(yàn)，試驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，P<0.05為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵棗粉感官評(píng)定

發(fā)酵棗粉含水量為30%及以下時(shí)均為棕褐色，質(zhì)地松軟，有較濃郁醇香味和酸香味，無(wú)結(jié)塊現(xiàn)象，無(wú)黏手現(xiàn)象；含水量高于30%時(shí)呈黑褐色，有明顯結(jié)塊，質(zhì)地較硬，有黏手觸感，醇香味與酸香味不明顯；未發(fā)酵棗粉呈淺褐色，無(wú)醇香味與酸香味。

2.2 復(fù)合菌劑對(duì)發(fā)酵棗粉營(yíng)養(yǎng)成分含量及pH的影響

由表4可知，Mix4、Mix5、Mix8組黃酮、多酚、還原糖含量極顯著高于其他組(P<0.01)，中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維含量極顯著低于其他組(P<0.01)；Mix8組粗蛋白質(zhì)含量顯著高于其他組(P<0.05)；Mix5組粗灰分含量顯著高于其他組(P<0.05)。綜上可知，采用Mix8組的復(fù)合菌劑進(jìn)行固體發(fā)酵對(duì)棗粉中營(yíng)養(yǎng)成分含量的改善效果最佳。

表4 復(fù)合菌劑對(duì)發(fā)酵棗粉營(yíng)養(yǎng)成分含量的影響(風(fēng)干基礎(chǔ))

如圖1所示，發(fā)酵6 d時(shí)，各組發(fā)酵棗粉的pH均達(dá)到最低，且以Mix4、Mix5、Mix8組較低，分別降至4.23、4.19和4.26。

圖1 復(fù)合菌劑對(duì)發(fā)酵棗粉不同發(fā)酵時(shí)間pH的影響

2.3 發(fā)酵條件對(duì)發(fā)酵棗粉營(yíng)養(yǎng)成分含量及pH的影響

由表5可知，發(fā)酵提高了棗粉的黃酮含量，MixA組黃酮含量最高，極顯著高于其他組和未發(fā)酵組(P<0.01)；MixA組多酚含量最高，極顯著高于MixC、MixE、MixF、MixH組和和未發(fā)酵組(P<0.01)；MixC組還原糖含量最高，極顯著高于MixA、MixD組外的其他組和未發(fā)酵組(P<0.01)；MixA組中性洗滌纖維含量顯著低于其他組和未發(fā)酵組(P<0.05)；MixA組酸性洗滌纖維含量極顯著低于MixH組外的其他組和未發(fā)酵組(P<0.01)；MixD組粗蛋白質(zhì)含量顯著高于MixE、MixF、MixG、MixI組和未發(fā)酵組(P<0.05)；MixC組粗灰分含量顯著高于MixF、MixI組(P<0.05)。

表5 發(fā)酵條件對(duì)發(fā)酵棗粉營(yíng)養(yǎng)成分含量的影響(風(fēng)干基礎(chǔ))

如圖2所示，發(fā)酵6 d時(shí)，各組發(fā)酵棗粉的pH均達(dá)到最低，且以MixA組最低，降至4.13。綜合分析可知，MixA組的發(fā)酵條件對(duì)發(fā)酵棗粉營(yíng)養(yǎng)成分含量及pH的改善效果最優(yōu)。

2.4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵棗粉營(yíng)養(yǎng)成分含量的影響

由表6可知，發(fā)酵棗粉的中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維含量在發(fā)酵7 d時(shí)極顯著低于其他發(fā)酵時(shí)間(P<0.01)；粗蛋白質(zhì)含量在發(fā)酵6 d時(shí)顯著高于其他發(fā)酵時(shí)間(P<0.05)；粗灰分含量在發(fā)酵5 d時(shí)顯著高于其他發(fā)酵時(shí)間(P<0.05)；黃酮含量在發(fā)酵5 d時(shí)極顯著高于發(fā)酵0、4、6 d時(shí)(P<0.01)；多酚含量在發(fā)酵5、6和7 d時(shí)顯著高于發(fā)酵0、4 d時(shí)(P<0.05)；還原糖含量在發(fā)酵7 d時(shí)極顯著高于其他發(fā)酵時(shí)間(P<0.01)，在發(fā)酵5和6 d時(shí)極顯著高于發(fā)酵0、4 d時(shí)(P<0.01)。綜上可知，發(fā)酵時(shí)間為6 d時(shí)對(duì)發(fā)酵棗粉營(yíng)養(yǎng)成分含量提高的效果較好。

圖2 發(fā)酵條件對(duì)發(fā)酵棗粉不同發(fā)酵時(shí)間pH的影響

2.5 發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵棗粉pH及黃曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮含量的影響

如圖3所示，發(fā)酵6 d時(shí)，發(fā)酵棗粉pH達(dá)到最低，為4.11。由表7可知，不同發(fā)酵時(shí)間下發(fā)酵棗粉中黃曲霉毒素B1與玉米赤酶烯酮含量均未超出我國(guó)《飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》(GB 13078—2017)規(guī)定的允許量。

2.6 發(fā)酵前后棗粉營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)對(duì)比

由表8可知，在復(fù)合菌劑(釀酒酵母∶植物乳酸桿菌∶枯草芽孢桿菌=2∶1∶2)接種量為3%，麩皮添加量為20%，接種前發(fā)酵基質(zhì)含水量為20%，發(fā)酵時(shí)間為6 d條件下，原料組干物質(zhì)含量顯著高于空白發(fā)酵組和發(fā)酵組(P<0.05)；發(fā)酵組黃酮、多酚、還原糖和粗脂肪含量極顯著高于原料組與空白發(fā)酵組(P<0.01)，粗蛋白質(zhì)和粗灰分含量顯著高于原料組與空白發(fā)酵組(P<0.05)，中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維含量及pH極顯著低于原料組與空白發(fā)酵組(P<0.01)；發(fā)酵組玉米赤霉烯酮含量顯著低于空白發(fā)酵組和原料組(P<0.05)。

表6 發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵棗粉營(yíng)養(yǎng)成分含量的影響(風(fēng)干基礎(chǔ))

3 討 論

3.1 復(fù)合菌劑優(yōu)化

復(fù)合菌發(fā)酵不僅能夠提高飼料消化率，而且由于益生菌大量繁殖，使發(fā)酵飼料兼有益生菌添加劑的特點(diǎn)[12]。利用微生物之間協(xié)同的關(guān)系，把幾種微生物有機(jī)結(jié)合在一起時(shí)，一般能產(chǎn)生優(yōu)于單菌發(fā)酵的效果[13]。適宜的復(fù)合菌劑配比和接種量對(duì)保證發(fā)酵效果具有重要意義[14]。李佳騰[15]研究表明，枯草芽孢桿菌、黑曲霉、乳酸片球菌、釀酒酵母按體積比為3.0∶1.5∶1.0∶1.0的比例進(jìn)行混合，作為發(fā)酵復(fù)合菌劑，接種量為6.5%，可以顯著提高杏鮑菇菌糠的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和感官品質(zhì)。張立明等[16]選用麥麩、米糠、棗渣等為原料進(jìn)行微生物固態(tài)發(fā)酵，結(jié)果表明，復(fù)合菌劑最佳配比為釀酒酵母BC：釀酒酵母XR4：枯草芽孢桿菌A15=2∶2∶1，接種量為8%，在此條件下，綜合指標(biāo)最優(yōu)。童鑫等[5]利用釀酒酵母和嗜酸乳桿菌對(duì)棗渣進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵，最終確定菌劑復(fù)合菌最佳配比為釀酒酵母∶嗜酸乳酸桿菌=2∶1；最佳接種量為15%。本試驗(yàn)中，復(fù)合菌劑對(duì)發(fā)酵棗粉營(yíng)養(yǎng)成分含量有極顯著影響，Mix4、Mix5、Mix8組復(fù)合菌劑配比對(duì)發(fā)酵棗粉營(yíng)養(yǎng)成分含量的改善效果較其他組更好，且這3個(gè)組發(fā)酵棗粉的pH低于其他組，即釀酒酵母∶植物乳酸桿菌∶枯草芽孢桿菌為3∶3∶4、3∶4∶2或2∶1∶2，復(fù)合菌劑接種量為3%時(shí)棗粉的發(fā)酵效果較好。

3.2 發(fā)酵條件優(yōu)化

含水量會(huì)對(duì)發(fā)酵過(guò)程和飼料發(fā)酵品質(zhì)產(chǎn)生重要影響，微生物的前期生長(zhǎng)，纖維素酶的分泌、傳遞及作用均需要一定量的水參與[15]。含水量過(guò)高會(huì)導(dǎo)致發(fā)酵原料黏性增加，料間空隙減少，換氣量減少，生長(zhǎng)代謝產(chǎn)生的廢氣影響菌株的正常生長(zhǎng)，從而引起發(fā)酵停滯。研究表明，隨著含水量的增加，固態(tài)發(fā)酵棉籽粕脫除棉酚的效果先升高后降低[17]。郭寶珠等[18]研究發(fā)現(xiàn)，在一定范圍內(nèi)隨著料水比的降低，發(fā)酵亞麻籽中生氰糖苷含量先保持不變后上升，最適料水比為1.0∶0.6。棗粉中豐富的單糖及多糖類物質(zhì)在提供了必需的碳源及能量的同時(shí)容易致使棗粉在發(fā)酵過(guò)程中發(fā)霉變質(zhì)，進(jìn)而降低棗粉的發(fā)酵品質(zhì)。麩皮質(zhì)地蓬松多空，可吸附棗粉的部分單糖和多糖，防止棗粉結(jié)塊粘連，有助于復(fù)合菌劑充分接觸空氣，促進(jìn)前期好氧菌的增殖。在以麥麩、米糠和棗渣等為原料進(jìn)行的微生物固態(tài)發(fā)酵試驗(yàn)中，最佳的麥麩添加量為8.6%，發(fā)酵的初始含水量為45%[16]。利用釀酒酵母和嗜酸乳桿菌對(duì)棗渣進(jìn)行發(fā)酵[5]，其中最佳的麩皮添加量為30%。

圖3 發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵棗粉pH的影響

表7 發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵棗粉pH及黃曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮含量的影響

表8 發(fā)酵前后棗粉營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)對(duì)比(風(fēng)干基礎(chǔ))

續(xù)表8項(xiàng)目 Items原料組Raw material group空白發(fā)酵組Blank fermentation group發(fā)酵組Fermentation group酸性洗滌纖維 ADF/%18.36±0.27Bb17.99±0.06Bb13.70±0.35Aa粗蛋白質(zhì) CP/%10.11±0.16Bb11.05±0.04Bb13.13±0.06Aa粗脂肪 EE/%1.79±0.25Bb1.73±0.47Bb3.36±0.12Aa粗灰分 Ash/%5.03±0.04c5.45±0.02b5.83±0.04a鈣 Ca/%1.08±0.071.05±0.041.12±0.08磷 P/%0.67±0.040.66±0.020.71±0.01pH6.64±0.07Bb5.74±0.07Bb4.11±0.04Aa總能 GE/(MJ/kg)17.33±0.4117.45±0.5817.80±0.37黃曲霉毒素B1 Aflatoxin B1/(μg/kg)1.94±0.082.86±0.121.82±0.02玉米赤霉烯酮 Zearalenone/(μg/kg)61.33±3.0259.66±1.41b52.14±2.67a

本研究中，MixA組的發(fā)酵條件對(duì)發(fā)酵棗粉營(yíng)養(yǎng)成分含量及pH的改善效果最優(yōu)，即復(fù)合菌劑配比為釀酒酵母∶植物乳酸桿菌∶枯草芽孢桿菌=2∶1∶2，接種量為3%，接種前發(fā)酵基質(zhì)含水量為20%，麩皮添加量為20%。固態(tài)發(fā)酵棗粉時(shí)添加適量的麩皮，可在中和部分可溶性糖與水分的基礎(chǔ)上誘導(dǎo)產(chǎn)生豐富的纖維素酶，然后作用于棗粉的細(xì)胞壁，改善細(xì)胞壁的通透性，從而使包被于細(xì)胞壁阻礙被機(jī)體高效吸收利用的黃酮、多酚類物質(zhì)得以釋放。

3.3 發(fā)酵時(shí)間優(yōu)化

發(fā)酵時(shí)間是影響發(fā)酵進(jìn)程與結(jié)果的重要因素，主要通過(guò)影響發(fā)酵菌株的數(shù)量以及產(chǎn)酶量而間接影響發(fā)酵結(jié)果[19]。研究表明，不同發(fā)酵時(shí)間下生氰糖苷脫除量存在顯著差異，發(fā)酵72 h后，生氰糖苷得到有效脫除，若此時(shí)繼續(xù)延長(zhǎng)發(fā)酵時(shí)間，發(fā)酵效果不會(huì)發(fā)生顯著變化，而且還會(huì)因過(guò)度發(fā)酵導(dǎo)致其他營(yíng)養(yǎng)成分的損失，同時(shí)增加發(fā)酵成本[18]。童鑫等[5]利用釀酒酵母和嗜酸乳桿菌對(duì)棗渣進(jìn)行發(fā)酵，最適發(fā)酵時(shí)間為84 h，發(fā)現(xiàn)此發(fā)酵時(shí)間下發(fā)酵產(chǎn)物的真蛋白質(zhì)含量比發(fā)酵前提高5.38%。李佳騰[15]在利用混菌發(fā)酵對(duì)杏鮑菇菌糠的飼用品質(zhì)與安全性進(jìn)行了分析，研究發(fā)現(xiàn)最適的發(fā)酵時(shí)間為8 d。本研究中，在MixA組的發(fā)酵條件下，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，pH下降緩慢，維持在一定水平。這可能是因?yàn)?，隨著pH的降低，發(fā)酵產(chǎn)生的有機(jī)酸積累到一定程度，優(yōu)勢(shì)菌群(乳酸菌等)的生存受到的酸抑制作用增強(qiáng)，活性逐漸減弱，從而造成產(chǎn)酸能力下降。發(fā)酵6 d時(shí)對(duì)發(fā)酵棗粉的營(yíng)養(yǎng)成分含量提高效果較好，且pH達(dá)到最低值4.11，毒素含量降低。研究表明，適當(dāng)延長(zhǎng)發(fā)酵時(shí)間可以增加菌群的數(shù)量、生物活性酶的產(chǎn)量和生物活性酶的作用時(shí)間，提高纖維素降解率[15]。

總之，在優(yōu)化的發(fā)酵條件下對(duì)棗粉進(jìn)行固體發(fā)酵，其營(yíng)養(yǎng)成分含量均得到不同程度的提高，黃酮、多酚類物質(zhì)含量提高，且能有效降低pH、粗纖維及毒素含量。

3.4 復(fù)合菌劑固體發(fā)酵對(duì)棗粉營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)的影響

植物外圍包含著一層厚壁即細(xì)胞壁，纖維素酶能通過(guò)降解作用使包裹在細(xì)胞壁中的黃酮溶出，且不破壞其生物活性[20]。粗纖維的降解使還原糖含量得到提高，木質(zhì)纖維素在酶的作用下降解成各種單糖、醛和酸等，這些成分可能未被菌體全部利用，致使基質(zhì)中無(wú)氮浸出物的含量大致呈遞增趨勢(shì)。黃玉嵐[21]研究顯示，發(fā)酵棗粉的粗蛋白質(zhì)含量較未發(fā)酵棗粉增加45.37%，粗脂肪含量減少46%，粗纖維含量變化不大。選用麥麩、棗渣等為原料進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵，結(jié)果表明發(fā)酵產(chǎn)物中β-葡聚糖、甘露聚糖、多肽含量比未進(jìn)行發(fā)酵的對(duì)照組分別提高了7.5%、7.6%、3.0%[16]。利用釀酒酵母和嗜酸乳桿菌對(duì)棗渣進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵，發(fā)酵產(chǎn)物的真蛋白質(zhì)含量比發(fā)酵前提高了5.38%[5]。馬文強(qiáng)等[22]利用枯草芽孢桿菌、釀酒酵母、乳酸菌對(duì)豆粕進(jìn)行發(fā)酵，結(jié)果顯示粗蛋白質(zhì)、粗脂肪含量較發(fā)酵前分別提高了13.48%、18.18%。本研究中，經(jīng)過(guò)復(fù)合菌劑發(fā)酵后棗粉的黃酮、多酚、還原糖、粗脂肪、粗蛋白質(zhì)含量明顯提高，而中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維含量降低，這可能是由于粗纖維的降解使得發(fā)酵基質(zhì)中干物質(zhì)含量減少，粗蛋白質(zhì)和粗脂肪含量發(fā)生相對(duì)濃縮，或者形成菌體蛋白，進(jìn)而表現(xiàn)為含量的增加，該結(jié)果與李佳騰[15]、陸亞珍等[23]所得結(jié)果相似。

發(fā)酵過(guò)程中有機(jī)酸含量的增加有利于飼料的長(zhǎng)期保存，且飼料pH的降低與有機(jī)酸含量的增加有直接關(guān)系[24-25]。lvarez-Martín等[26]研究發(fā)現(xiàn)，酵母菌和乳酸菌混合發(fā)酵可以調(diào)控代謝產(chǎn)物的變化，酵母菌能夠通過(guò)與乳酸菌的共生作用刺激乳酸菌活動(dòng)，從而促進(jìn)乳酸的產(chǎn)生及pH的降低。枯草芽孢桿菌能夠代謝產(chǎn)生乳酸等有機(jī)酸，同時(shí)消耗環(huán)境中的游離氧，創(chuàng)造厭氧條件，促進(jìn)乳酸菌的大量繁殖并產(chǎn)生乳酸，降低pH。考書娟等[27]對(duì)絲狀真菌YW-7和乳酸菌混合發(fā)酵豆粕進(jìn)行了研究，發(fā)酵后豆粕中的粗蛋白質(zhì)含量大于53%，pH為4.4。本研究結(jié)果與此相似，復(fù)合菌劑為釀酒酵母∶植物乳酸桿菌∶枯草芽孢桿菌=2∶1∶2時(shí)，發(fā)酵棗粉的pH為4.11，發(fā)酵進(jìn)程較快。這表明復(fù)合菌劑按照一定比例混合后進(jìn)行發(fā)酵，能夠充分利用彼此間的協(xié)同性、互補(bǔ)性，發(fā)揮組合正效應(yīng)，促進(jìn)乳酸等有機(jī)酸的產(chǎn)生，降低飼料pH。

本研究中，在最優(yōu)發(fā)酵條件下經(jīng)過(guò)固體發(fā)酵后，棗粉中黃曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮含量分別為1.82、52.14 μg/kg，分別較原料組下降了6.19%和14.98%。本試驗(yàn)所得發(fā)酵產(chǎn)物中這2個(gè)毒素的含量均低于《飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》(GB 13078—2017)規(guī)定的允許量。黃曲霉毒素B1作為霉菌毒素中毒性最強(qiáng)的毒素，主要由黃曲霉和寄生曲霉產(chǎn)生，動(dòng)物長(zhǎng)期攝入被黃曲霉毒素B1污染的飼料會(huì)對(duì)肝臟組織和細(xì)胞造成嚴(yán)重?fù)p傷[28]。芽孢桿菌已經(jīng)被證明對(duì)黃曲霉毒素B1具有降解作用[29]，這可能為發(fā)酵棗粉中黃曲霉毒素B1含量下降的主要原因，發(fā)酵棗粉中玉米赤霉烯酮含量顯著下降可能是因?yàn)樘砑拥木陮?duì)這種毒素的降解能力較強(qiáng)。

4 結(jié) 論

棗粉固態(tài)發(fā)酵的最優(yōu)條件為：復(fù)合菌劑配比為釀酒酵母∶植物乳酸桿菌∶枯草芽孢桿菌=2∶1∶2，接種量為3%，麩皮添加量為20%，接種前發(fā)酵基質(zhì)含水量為20%，發(fā)酵時(shí)間為6 d。在最優(yōu)發(fā)酵條件下進(jìn)行固體發(fā)酵后，紅棗的黃酮、多酚、還原糖和粗蛋白質(zhì)含量分別提高了31.23%、17.12%、41.43%和29.87%，pH、黃曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮含量分別降低了38.10%、6.19%和14.98%。