植物炭黑對(duì)飼喂脫氧雪腐鐮刀菌烯醇污染飼糧斷奶仔豬生長(zhǎng)性能、血清抗氧化指標(biāo)和腸道二糖酶活性的影響

吳 杰 鄧 波 陳雪穎 王翰陽(yáng) 徐子偉*

(1.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，杭州 310021；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，哈爾濱 150000)

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(deoxynivalenol，DON)又名嘔吐毒素，是單端孢霉烯族毒素中的一種，主要由禾谷鐮刀菌、尖孢鐮刀菌和雪腐鐮刀菌產(chǎn)生，其廣泛存在于小麥、玉米等谷類作物及其加工副產(chǎn)物中[1]，全球每年因DON污染谷物而造成的經(jīng)濟(jì)損失可達(dá)數(shù)十億美元[2]。畜禽在食用DON污染的谷物制品后可能會(huì)出現(xiàn)拒食、嘔吐、生長(zhǎng)性能下降、免疫抑制以及腸道功能失調(diào)等癥狀，嚴(yán)重危害畜禽健康[3-4]。不同動(dòng)物對(duì)DON的耐受性有所不同，反芻動(dòng)物的耐受性較高，而豬是最為敏感的，當(dāng)飼糧中DON含量達(dá)到1 mg/kg時(shí)，仔豬便可能出現(xiàn)拒食、生長(zhǎng)滯緩和腸道菌群紊亂[5]；另有研究表明，飼糧中DON每增加1 mg/kg，生長(zhǎng)育肥豬采食量會(huì)降低6%，當(dāng)達(dá)到10 mg/kg時(shí)即完全拒食[6]。此外，由于目前的豬飼糧配方中會(huì)使用大量的玉米、小麥等原料，豬也有更高風(fēng)險(xiǎn)接觸到DON污染原料。DON一般在田間產(chǎn)生，特別是近些年全球氣候異常，干旱、洪澇等極端天氣大大增加了DON在田間的污染，并且在谷物采收后的貯藏過(guò)程中DON也會(huì)產(chǎn)生，很難對(duì)其進(jìn)行預(yù)防。目前處理霉變飼糧最為常見的方法是使用霉菌毒素吸附劑，然而由于DON所帶基團(tuán)極性較弱，親電性差，大多數(shù)的吸附劑對(duì)DON的吸附率并不高[7-8]。

植物炭黑是以天然植物、殼等為原料經(jīng)高溫碳化、活化后得到，其主要成分是活性炭。研究表明，飼糧中添加活性炭類添加劑能促進(jìn)肉雞腸道絨毛發(fā)育[9]；改善仔豬免疫功能，降低腹瀉[10]；提高育肥豬生長(zhǎng)性能，改善菌群結(jié)構(gòu)[11]。植物炭黑具有較大的比表面積，對(duì)包括DON等多種霉菌毒素在體外緩沖液體系中均具有較好的吸附效果[7,12]，2020年農(nóng)業(yè)農(nóng)村部第258號(hào)公告已批準(zhǔn)植物炭黑為新飼料添加劑，可在豬飼料中使用。然而，有關(guān)植物炭黑或活性炭類吸附劑對(duì)霉菌毒素特別是DON在體內(nèi)吸附效果的研究還較少，并且結(jié)果也并不一致[13-14]。因此，本試驗(yàn)在DON污染飼糧中添加植物炭黑，研究其對(duì)斷奶仔豬生長(zhǎng)性能、血清抗氧化指標(biāo)和腸道二糖酶活性的影響，為其在霉變飼糧中的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

植物炭黑由福建某生物科技有限公司提供。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及飼糧

試驗(yàn)選取48頭24日齡、體重為(7.76±0.24) kg、健康的“杜×大×長(zhǎng)”斷奶仔豬(公豬)，按照體重隨機(jī)分為4組，每組3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)4頭豬。4組分別為：對(duì)照組(CON組)，飼喂基礎(chǔ)飼糧；植物炭黑組(PCB組)，飼喂基礎(chǔ)飼糧+0.1%植物炭黑；DON組，飼喂基礎(chǔ)飼糧+1.5 mg/kg DON；DON+植物炭黑組(DON+PCB組)，飼喂基礎(chǔ)飼糧+1.5 mg/kg DON+0.1%植物炭黑。試驗(yàn)期為21 d?；A(chǔ)飼糧參照NRC(2012)豬營(yíng)養(yǎng)需要配制，其組成及營(yíng)養(yǎng)水平見表1。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

1.3 飼養(yǎng)管理

本試驗(yàn)在浙江省杭州正興牧業(yè)有限公司內(nèi)進(jìn)行，所有欄舍為封閉式、漏縫地板。每日飼喂3次(08:00、14:00和20:00)，每次飼喂遵循少量多次原則，自由飲水，免疫程序按照豬場(chǎng)常規(guī)方法進(jìn)行。每天對(duì)圈舍進(jìn)行清掃，定期對(duì)豬舍進(jìn)行消毒。試驗(yàn)期早晚觀察仔豬精神狀態(tài)。

1.4 測(cè)定指標(biāo)及方法

1.4.1 生長(zhǎng)性能測(cè)定

分別于試驗(yàn)開始、試驗(yàn)第10天和試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，對(duì)所有仔豬進(jìn)行空腹稱重；試驗(yàn)期間每日記錄斷奶仔豬采食量；試驗(yàn)結(jié)束時(shí)計(jì)算平均日增重(ADG)、平均日采食量(ADFI)和料重比(F/G)。

1.4.2 血常規(guī)及血清抗氧化指標(biāo)測(cè)定

分別于試驗(yàn)第10天和第21天08:00對(duì)所有仔豬進(jìn)行采血，每頭豬采血2份，一份打入含肝素鈉抗凝管中進(jìn)行血常規(guī)檢測(cè)，包括測(cè)定白細(xì)胞計(jì)數(shù)(white blood cell count，WBC)、紅細(xì)胞計(jì)數(shù)(red blood cell count，RBC)、血小板計(jì)數(shù)(platelet count，PLT)、紅細(xì)胞壓積(hematokrit，HCT)和血紅蛋白(hemoglobin，HGB)含量；另一份靜置30 min后以3 000 r/min離心10 min，分離得到血清，置于-20 ℃保存，測(cè)定血清超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、過(guò)氧化氫酶(catalase，CAT)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(glutathion peroxidase，GSH-Px)活性、總抗氧化能力(total antioxidant capacity，T-AOC)和丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量。

1.4.3 小腸樣品的采集及二糖酶活性測(cè)定

試驗(yàn)第21天，每重復(fù)隨機(jī)挑選2頭仔豬進(jìn)行屠宰采樣。仔豬采樣電擊致死后放血，剖開腹腔，分離出十二指腸、空腸和回腸，然后十二指腸從靠近胃賁門部2 cm處開始取樣，空腸在空腸中段取樣，回腸從距盲腸5 cm處開始取樣。將取得腸段剪開，用生理鹽水沖洗干凈后用濾紙吸干水分，載玻片刮取黏膜后裝入凍存管中，立即放入液氮中速凍待測(cè)。腸道乳糖酶、麥芽糖酶和蔗糖酶活性嚴(yán)格按照試劑盒(南京建成生物工程研究所)說(shuō)明書進(jìn)行測(cè)定。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及分析

所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)Excel 2019初步分析后，使用SPSS 17.0軟件對(duì)4組數(shù)據(jù)進(jìn)行雙因素方差分析，當(dāng)有顯著互作效應(yīng)或有顯著互作效應(yīng)趨勢(shì)時(shí)，采用LSD多重比較檢測(cè)4組間的差異顯著性。所有數(shù)據(jù)均以平均值和均值標(biāo)準(zhǔn)誤表示，以P<0.05為差異顯著，以0.05

2 結(jié) 果

2.1 植物炭黑對(duì)飼喂DON污染飼糧斷奶仔豬生長(zhǎng)性能的影響

由表2可知，飼糧添加1.5 mg/kg DON顯著降低斷奶仔豬末重以及第11～21天和第1～21天ADG(P<0.05)，并有提高第11～21天F/G的趨勢(shì)(0.050.05)，且與CON組相比均無(wú)顯著差異(P>0.05)。

表2 植物炭黑對(duì)飼喂DON污染飼糧斷奶仔豬生長(zhǎng)性能的影響

續(xù)表2項(xiàng)目 Items組別 GroupsCONPCBDONDON+PCBSEMP值 P-value脫氧雪腐鐮刀菌烯醇 DON植物炭黑 PCB脫氧雪腐鐮刀菌烯醇×植物炭黑 DON×PCB平均日采食量 ADFI/g544.40568.93507.86576.3117.400.6970.2350.560料重比 F/G1.441.521.831.690.070.0570.8200.400第1～21天 Days 1 to 21平均日增重 ADG/g323.63a321.79a235.19b299.21ab15.320.0310.1620.074平均日采食量 ADFI/g432.75450.00374.02456.8714.650.3380.0850.234料重比 F/G1.351.421.611.540.060.1310.9940.546

2.2 植物炭黑對(duì)飼喂DON污染飼糧斷奶仔豬血常規(guī)指標(biāo)的影響

由表3可知，飼糧添加1.5 mg/kg DON顯著降低斷奶仔豬第10天和第21天WBC和HGB含量(P<0.05)，并有降低第10天和第21天HCT以及第21天RBC的趨勢(shì)(0.050.05)；DON與植物炭黑對(duì)第21天WBC和第10天RBC有互作效應(yīng)趨勢(shì)(0.050.05)，且與CON組相比無(wú)顯著差異(P>0.05)。

表3 植物炭黑對(duì)飼喂DON污染飼糧斷奶仔豬血常規(guī)指標(biāo)的影響

2.3 植物炭黑對(duì)飼喂DON污染飼糧斷奶仔豬血清抗氧化指標(biāo)的影響

由表4可知，飼糧添加1.5 mg/kg DON顯著降低斷奶仔豬第10天血清T-AOC和CAT活性以及第21天血清SOD、GSH-Px活性和T-AOC(P<0.05)，顯著提高第10天和第21天血清MDA含量(P<0.05)；飼糧添加0.1%植物炭黑對(duì)血清抗氧化指標(biāo)無(wú)顯著影響(P>0.05)；DON與植物炭黑對(duì)第10天血清MDA含量以及第21天血清SOD活性有顯著互作效應(yīng)(P<0.05)，對(duì)第21天血清MDA含量有互作效應(yīng)趨勢(shì)(0.050.05)，且與CON組相比均無(wú)顯著差異(P>0.05)。

表4 植物炭黑對(duì)飼喂DON污染飼糧斷奶仔豬血清抗氧化指標(biāo)的影響

2.4 植物炭黑對(duì)飼喂DON污染飼糧斷奶仔豬小腸二糖酶活性的影響

由表5可知，飼糧添加1.5 mg/kg DON顯著提高斷奶仔豬十二指腸蔗糖酶活性以及空腸麥芽糖酶和蔗糖酶活性(P<0.05)，并有提高十二指腸和回腸麥芽糖酶活性的趨勢(shì)(0.050.05)；DON與植物炭黑對(duì)空腸蔗糖酶活性有互作效應(yīng)趨勢(shì)(0.050.05)，且與CON組相比無(wú)顯著差異(P>0.05)。

表5 植物炭黑對(duì)飼喂DON污染飼糧斷奶仔豬小腸二糖酶活性的影響

3 討 論

3.1 植物炭黑對(duì)飼喂DON污染飼糧斷奶仔豬生長(zhǎng)性能的影響

豬采食DON污染飼糧出現(xiàn)的典型癥狀是嘔吐、拒食和采食量下降，目前普遍認(rèn)為這是由于DON能通過(guò)破壞腸道菌群并調(diào)節(jié)腸道神經(jīng)傳導(dǎo)物質(zhì)如5-羥色胺、兒茶酚胺等受體來(lái)抑制小腸蠕動(dòng)，從而引發(fā)拒食[15-16]。本研究發(fā)現(xiàn)，飼糧添加1.5 mg/kg DON會(huì)顯著降低斷奶仔豬末重和ADG，并有提高F/G的趨勢(shì)。Liao等[17]在斷奶仔豬飼糧中添加4 mg/kg DON 14 d，仔豬ADG下降了15.01%，ADFI下降了11.32%，與本研究結(jié)果一致。Pestka等[6]在育肥豬上的研究也發(fā)現(xiàn)，采食量的降低和DON含量呈正相關(guān)，飼糧中每增加1 mg/kg DON，育肥豬的采食量下降約6%，當(dāng)DON超過(guò)10 mg/kg時(shí)，育肥豬完全拒食。DON對(duì)仔豬生長(zhǎng)性能最低可觀測(cè)損害水平還有所爭(zhēng)議，Jia等[18]報(bào)道仔豬飼喂1 mg/kg DON污染飼糧3周并不會(huì)引起ADG和ADFI的變化，然而也有研究表明，當(dāng)DON含量低至0.6 mg/kg時(shí)仍會(huì)對(duì)仔豬生長(zhǎng)性能造成損害[19]，以上結(jié)果的差異可能與豬群體重、性別、健康情況、毒素來(lái)源及是否存在毒素混合污染等有關(guān)。

目前緩解DON對(duì)仔豬生長(zhǎng)性能的影響最常見的方法是在毒素污染飼糧中添加吸附劑。Liu等[5]發(fā)現(xiàn)在3.0 mg/kg DON污染飼糧中添加疏水性吸附劑水合鋁硅酸鈉鈣能有效緩解DON對(duì)仔豬體重、ADG和ADFI的影響。萬(wàn)晶[20]研究表明，在DON污染飼糧中添加提純及碳化蒙脫石能提高仔豬第1～14天ADG，改善第1～14天和第1～28天F/G。本試驗(yàn)中使用的植物炭黑為活性碳類產(chǎn)品，其微孔結(jié)構(gòu)多，相較于普通蒙脫石類吸附劑具有較大的比表面積[10]，在體外緩沖液中對(duì)包括DON在內(nèi)的多種毒素具有較高的吸附率[7]，在DON體內(nèi)代謝試驗(yàn)中能有效降低仔豬血清中DON及其代謝產(chǎn)物含量[13]。本試驗(yàn)結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，飼喂添加0.1%植物炭黑的DON污染飼糧，斷奶仔豬末重、ADG和ADFI等生長(zhǎng)性能指標(biāo)較DON組有所改善，結(jié)果與使用水合鋁硅酸鈉鈣和碳化蒙脫石的結(jié)果[5,20]一致。目前對(duì)活性炭類產(chǎn)品，市場(chǎng)認(rèn)為其吸附性較強(qiáng)，但沒有選擇性，可能會(huì)吸附營(yíng)養(yǎng)素從而降低仔豬生長(zhǎng)性能，然而本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，單獨(dú)添加0.1%植物炭黑并沒有顯著降低仔豬生長(zhǎng)性能。Wang等[10]在正常飼糧中也發(fā)現(xiàn)，添加500 mg/kg植物炭黑能顯著提高仔豬第14天和第28天體重，降低腹瀉率，當(dāng)添加量達(dá)到2 000 mg/kg時(shí)也不會(huì)降低仔豬生長(zhǎng)性能。

3.2 植物炭黑對(duì)飼喂DON污染飼糧斷奶仔豬血常規(guī)指標(biāo)的影響

血常規(guī)指標(biāo)是臨床上最為常見的基礎(chǔ)指標(biāo)之一，能夠反映動(dòng)物機(jī)體或器官的健康情況[21]。DON具有較強(qiáng)的細(xì)胞毒性，它能抑制蛋白質(zhì)合成，影響細(xì)胞增殖[22-23]。李華[24]研究發(fā)現(xiàn)，飼糧添加2 mg/kg DON顯著降低了小鼠第10天和第30天血液中WBC、RBC和HCT。趙青等[25]也研究發(fā)現(xiàn)無(wú)論是灌胃或者注射DON均能顯著降低WBC、RBC、PLT和HCT。WBC、RBC和HCT的降低表明機(jī)體免疫力及造血功能受到影響且體內(nèi)有炎癥反應(yīng)。本試驗(yàn)結(jié)果表明，DON會(huì)影響斷奶仔豬全血中WBC、RBC和HGB含量，而添加植物炭黑能緩解DON對(duì)WBC和RBC的降低，且與CON組相比均未見顯著差異，這與蔣竹英[14]使用竹炭的效果相一致，這提示飼糧添加植物炭黑能緩解DON對(duì)細(xì)胞的毒性和對(duì)造血功能的影響，降低DON對(duì)機(jī)體的危害。

3.3 植物炭黑對(duì)飼喂DON污染飼糧斷奶仔豬血清抗氧化指標(biāo)的影響

DON進(jìn)入機(jī)體后會(huì)產(chǎn)生大量的自由基，破壞原有氧化-抗氧化穩(wěn)態(tài)系統(tǒng)，引起氧化應(yīng)激[26]。T-AOC含量通常由體內(nèi)酶類及非酶類的抗氧化系統(tǒng)維持，其可反映機(jī)體整體的抗氧化狀態(tài)[27]。MDA是自由基作用于脂質(zhì)過(guò)氧化后的產(chǎn)物，可反映機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化程度。SOD、CAT和GSH-Px是抗氧化系統(tǒng)中重要的酶，其可共同協(xié)作加速過(guò)氧化氫、超氧化物等氧化物的代謝，降低對(duì)機(jī)體產(chǎn)生的毒性[28]。本試驗(yàn)中，DON顯著降低了斷奶仔豬第10天血清T-AOC、CAT活性以及第21天血清SOD、GSH-Px活性和T-AOC，顯著提高第10天和第21天血清MDA含量，這表明DON污染飼糧破壞了仔豬體內(nèi)的抗氧化系統(tǒng)，脂質(zhì)過(guò)氧化物大量積累，機(jī)體結(jié)構(gòu)及功能受到氧化損傷。Kouadio等[29]在Caco-2細(xì)胞系中也發(fā)現(xiàn)，DON能通過(guò)阻斷鞘磷脂代謝，加速脂質(zhì)過(guò)氧化，提高細(xì)胞中MDA含量。Wu等[30]在生長(zhǎng)豬飼糧中添加3～12 mg/kg DON發(fā)現(xiàn)，生長(zhǎng)豬血清SOD和GSH-Px活性顯著降低，并且其活性與DON的添加量呈負(fù)相關(guān)。Jia等[31]在仔豬中也發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加3.6 mg/kg DON顯著提高了血清MDA含量。本試驗(yàn)中，在DON污染的飼糧中添加植物炭黑顯著提高了斷奶仔豬第21天血清SOD活性，并能緩解DON引起的第10天和第21天血清MDA含量的提高，結(jié)果與之前研究使用活性炭、竹炭等效果類似[14,32]，這提示植物炭黑能緩解DON對(duì)機(jī)體造成的氧化應(yīng)激。植物炭黑對(duì)緩解DON引起的氧化應(yīng)激的原因一方面是因?yàn)槠淠芪紻ON，減少其在體內(nèi)的吸收，從而降低氧化損傷；另一方面，也可能是因?yàn)槠鋵?duì)腸道內(nèi)毒素具有吸附作用。仔豬斷奶會(huì)增加腸道內(nèi)毒素的釋放，引發(fā)仔豬炎癥及氧化應(yīng)激[33]，而活性炭對(duì)內(nèi)毒素有較好的吸附效果[34]，從而能緩解內(nèi)毒素對(duì)機(jī)體的危害。

3.4 植物炭黑對(duì)飼喂DON污染飼糧斷奶仔豬小腸二糖酶活性的影響

麥芽糖、蔗糖和乳糖等二糖在動(dòng)物機(jī)體內(nèi)并不能直接被利用，需要被黏膜上皮的二糖酶水解為單糖后才能吸收，當(dāng)腸道受損時(shí)，二糖酶活性會(huì)有所降低，因此常將二糖酶活性作為反映腸道黏膜健康及機(jī)體對(duì)碳水化合物吸收能力的重要指標(biāo)[35]。Martínez等[36]在斷奶仔豬飼糧中添加50 μg/kg BW的DON后發(fā)現(xiàn)，十二指腸及近端空腸麥芽糖酶和乳糖酶活性、遠(yuǎn)端空腸蔗糖酶和乳糖酶活性以及回腸麥芽糖酶活性均顯著降低。陳祥興[37]使用鐮刀菌毒素(玉米赤霉烯酮899.4 μg/kg、DON 1 429.4 μg/kg和煙曲霉毒素5 846 μg/kg)攻毒斷奶仔豬發(fā)現(xiàn)，鐮刀菌毒素顯著降低了十二指腸和空腸乳糖酶活性以及空腸和回腸蔗糖酶活性。和預(yù)期有所不同，本試驗(yàn)中，DON顯著提高斷奶仔豬十二指腸蔗糖酶活性以及空腸麥芽糖酶和蔗糖酶活性，并有提高十二指腸和回腸麥芽糖酶活性的趨勢(shì)。二糖酶活性的異常提高也在黃曲霉毒素B1攻毒的蛋雞中被發(fā)現(xiàn)，并且二糖酶活性與黃曲霉毒素B1添加量呈二次提高關(guān)系[38]。筆者推測(cè)，二糖酶活性的異常表現(xiàn)可能與毒素劑量和作用時(shí)間有關(guān)，也可能與毒素引發(fā)的全身性代謝及激素分泌異常有關(guān)[39]，具體還有待于進(jìn)一步研究。本試驗(yàn)中，在DON污染飼糧中添加植物炭黑后斷奶仔豬空腸蔗糖酶活性較CON組無(wú)顯著變化，這提示植物炭黑能一定程度緩解DON對(duì)消化酶的影響。

4 結(jié) 論

① 飼喂DON污染(1.5 mg/kg)的飼糧會(huì)降低斷奶仔豬生長(zhǎng)性能，改變血常規(guī)指標(biāo)，降低血清抗氧化能力并引起小腸二糖酶活性的異常提高；添加0.1%植物炭黑能緩解DON對(duì)機(jī)體的這種負(fù)面影響。

② 正常飼糧中添加0.1%植物炭黑不會(huì)對(duì)斷奶仔豬生長(zhǎng)性能、血常規(guī)指標(biāo)、血清抗氧化指標(biāo)以及小腸二糖酶活性造成負(fù)面影響。