葫蘆茶水提物鎮(zhèn)咳祛痰平喘作用的實(shí)驗(yàn)研究*

蘇金妹，盧秋玉，唐愛(ài)存

1廣西國(guó)際壯醫(yī)醫(yī)院明秀分院，廣西 南寧530001；2廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院藥學(xué)部；3廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部

葫蘆茶為豆科植物葫蘆茶Tadehagi triquetrum（L.）Ohashi的枝葉，別名葫蘆葉、牛蟲(chóng)草、咸魚(yú)草等，是壯族常用藥材，主要分布在廣西、江西、廣東、海南等地。葫蘆茶味苦澀、涼，具有清熱解毒，利濕退黃，消積殺蟲(chóng)之功。臨床主要用于治療中暑煩渴、感冒發(fā)熱、咽喉腫痛、肺癰、黃疸肝炎、腎炎、腸炎、風(fēng)濕關(guān)節(jié)痛、鉤蟲(chóng)病、小兒疳積等［1］。前期研究表明葫蘆茶具有明顯的保肝抗炎作用［2-3］。目前未查到葫蘆茶水提物在鎮(zhèn)咳、平喘、化痰方面的藥理研究，而在臨床應(yīng)用中葫蘆茶用于治療痰熱咳嗽、痰黃稠、咽喉不利、哮喘等［4-5］。因此，對(duì)葫蘆茶水提物進(jìn)行鎮(zhèn)咳祛痰藥效學(xué)研究很有意義。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物昆明種小鼠，SPF級(jí)，雌雄各半，體質(zhì)量（20±2）g；Wistar大鼠，SPF級(jí)，雌雄各半，體質(zhì)量180～220 g；豚鼠，SPF級(jí)，雌雄各半，體質(zhì)量200～250 g。均購(gòu)自廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（桂）2009-0002，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（桂）2009-0004。飼養(yǎng)環(huán)境：在具有負(fù)壓及過(guò)濾空氣裝置的動(dòng)物房飼養(yǎng)，室溫20～25℃，相對(duì)濕度60%～70%，光照為12 h小時(shí)明暗交替，清潔喂養(yǎng)，自由飲食。

1.2 藥物與試劑葫蘆茶（廣西萬(wàn)寶堂藥業(yè)有限公司），經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院黃敏主任藥師鑒定為豆科植物葫蘆茶；氨水（廣東光華化學(xué)廠(chǎng)有限公司，批號(hào)：20170306）；枸櫞酸（中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司，批號(hào)：20180516）；苯酚紅（上海試劑三廠(chǎng)，批號(hào)：990609）；磷酸組胺（中國(guó)科學(xué)院上海生物化學(xué)研究所，批號(hào)：990826）；氯化乙酰膽堿（上海試劑三廠(chǎng)，批號(hào)：991026）；磷酸可待因（青海制藥廠(chǎng)，批號(hào)：20170802）；氯化銨（西安化學(xué)試劑廠(chǎng)，批號(hào)：20181008）；氨茶堿（山西臨汾云鵬藥業(yè)有限公司，批號(hào)：20170206）。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器WH-2000型超聲波霧化器（廣東粵華醫(yī)療器械廠(chǎng)有限公司）；722S型可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；毛細(xì)管（內(nèi)徑0.8 mm，長(zhǎng)度5 cm）。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 試驗(yàn)藥物制備 將葫蘆茶粉碎成粗粉，取干燥適量粗粉，加適量水浸泡30 min，按1∶10料液比加水，煎煮60 min，趁熱抽濾，收集濾液，濾渣加適量水煎煮45 min，合并兩次所得濾液并進(jìn)行減壓濃縮，得到濃縮物后，再分別配成所需的相應(yīng)濃度。

1.4.2 小鼠氨水引咳實(shí)驗(yàn) 根據(jù)文獻(xiàn)［6-8］取昆明種小鼠50只，隨機(jī)分成模型組，磷酸可待因組（0.05 g/kg），葫蘆茶水提物低劑量（100 mg/kg）、中劑量（200 mg/kg）、高劑量（400 mg/kg）組，每組10只。各組給予對(duì)應(yīng)藥物連續(xù)灌胃給藥3天，第3天給藥40 min，將小鼠放置密閉玻璃罩內(nèi)，用超聲霧化器噴入氨水5 s激發(fā)小鼠咳嗽，以小鼠同時(shí)出現(xiàn)腹肌收縮、縮胸、張嘴（咳聲有無(wú)均可）為咳嗽標(biāo)準(zhǔn)，記錄引咳潛伏期和2 min內(nèi)小鼠咳嗽次數(shù)。

1.4.3 豚鼠枸櫞酸引咳實(shí)驗(yàn) 根據(jù)文獻(xiàn)［6-8］采用豚鼠枸櫞酸引咳法，將17.5%的枸櫞酸溶液盛于超聲霧化器霧化室的霧化杯內(nèi)，向鐘罩內(nèi)恒速?lài)娙腓蹤此崛芤红F化氣1 min，記錄5 min內(nèi)的咳嗽次數(shù)。以豚鼠咳嗽聲音響亮，聽(tīng)到咳嗽聲音計(jì)1次咳嗽，咳嗽次數(shù)少于10次的棄除，將預(yù)選合格的50只豚鼠隨機(jī)分成模型組，磷酸可待因組（0.05 g/kg），葫蘆茶水提物低劑量（100 mg/kg）、中劑量（200 mg/kg）、高劑量（400 mg/kg）組，每組10只。各組給予對(duì)應(yīng)藥物連續(xù)灌胃給藥3天，第3天給藥1 h后，將豚鼠扣于鐘罩內(nèi)，按預(yù)選的條件，向鐘罩內(nèi)恒速?lài)娙腓蹤此崛芤红F化氣1 min，觀(guān)察豚鼠自噴霧開(kāi)始至出現(xiàn)咳嗽的潛伏期及噴霧停止后5 min內(nèi)的咳嗽次數(shù)。

1.4.4 小鼠酚紅祛痰實(shí)驗(yàn) 根據(jù)文獻(xiàn)［6-8］取昆明種小鼠50只，雌雄各半，隨機(jī)分成模型組，氯化銨組（1.0 g/kg），葫蘆茶水提物低劑量（100 mg/kg）、中劑量（200 mg/kg）、高劑量（400 mg/kg）組，每組10只。第3天給藥30 min后，腹腔注射5%的酚紅溶液0.01 mL/g體質(zhì)量，30 min后，脫頸處死小鼠，剝離氣管周?chē)M織，剪下自甲狀軟骨下至氣管分支處的一段氣管，放入裝有2 mL生理鹽水的試管中，振蕩30 min，將沖洗液放入另一試管，加入0.1 mL的NaOH（1 mol/L），用722s型分光光度計(jì)，波長(zhǎng)546 nm測(cè)OD值，根據(jù)酚紅標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，將光密度值換算成酚紅含量。

1.4.5 大鼠毛細(xì)管祛痰實(shí)驗(yàn) 根據(jù)文獻(xiàn)［6-8］取Wistar大鼠40只，隨機(jī)分成模型組，氯化銨組（1.0 g/kg），葫蘆茶水提物低劑量（100 mg/kg）、中劑量（200 mg/kg）、高劑量（400 mg/kg）組，每組8只。連續(xù)灌胃給藥3天，第3天給藥前禁食不禁水12 h，給藥后1 h，烏拉坦腹腔注射麻醉后，仰位固定。剪開(kāi)頸正中部皮膚，分離出氣管。在甲狀軟骨下緣正中的軟骨環(huán)之間用尖銳的注射針頭扎一小孔，然后插入玻璃毛細(xì)管一根，使毛細(xì)管剛好接觸氣管底部表面，借以吸取氣管后部之痰液。當(dāng)毛細(xì)管內(nèi)痰液充滿(mǎn)時(shí)，立即另?yè)Q一根。以毛細(xì)管吸取痰液長(zhǎng)度作為評(píng)價(jià)藥物的祛痰效果。記錄給藥后2 h內(nèi)的痰液分泌量。

1.4.6 豚鼠組胺引喘實(shí)驗(yàn) 根據(jù)文獻(xiàn)［6-8］取健康豚鼠，雌雄兼用。將豚鼠放置密閉玻璃罩內(nèi)，用超聲霧化器以400 mm Hg的恒壓噴入2%氯化乙酰膽和0.1%磷酸組胺的等量混合液，每只豚鼠恒壓恒速?lài)婌F15 s，測(cè)定其引喘潛伏期，引喘潛伏期小于150 s為合格。將50只豚鼠隨機(jī)分成模型組，氨茶堿組（0.1 g/kg），葫蘆茶水提物低劑量（100 mg/kg）、中劑量（200 mg/kg）、高劑量（400 mg/kg）組，每組10只。連續(xù)灌胃給藥3天，第3天給藥1 h后，將豚鼠放置密閉玻璃罩內(nèi)，按上述方法進(jìn)行噴霧，測(cè)定其引喘潛伏期。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量資料采用±s表示，采用t檢驗(yàn)，多組均數(shù)比較采用方差分析，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 對(duì)濃氨水致小鼠咳嗽反應(yīng)的影響與模型組比較，葫蘆茶水提物中、高劑量組能延長(zhǎng)氨水引起小鼠咳嗽反應(yīng)的潛伏期，同時(shí)減少咳嗽次數(shù)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 各組濃氨水致小鼠咳嗽反應(yīng)比較（±s）

表1 各組濃氨水致小鼠咳嗽反應(yīng)比較（±s）

注：與模型組比較，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01；-表示無(wú)數(shù)值

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2.2 對(duì)枸櫞酸致豚鼠咳嗽反應(yīng)的影響與模型組比較，葫蘆茶水提物各劑量組能延長(zhǎng)枸櫞酸引起豚鼠咳嗽反應(yīng)的潛伏期，同時(shí)減少咳嗽次數(shù)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

表2 各組枸櫞酸致豚鼠咳嗽反應(yīng)比較（±s）

表2 各組枸櫞酸致豚鼠咳嗽反應(yīng)比較（±s）

注：與模型組比較，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01；-表示無(wú)數(shù)值

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2.3 對(duì)小鼠酚紅祛痰作用的影響與模型組比較，葫蘆茶水提物各劑量組能增加小鼠的酚紅排泄量，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表3。

表3 各組小鼠氣管段酚紅排泄量比較（±s）

表3 各組小鼠氣管段酚紅排泄量比較（±s）

注：與模型組比較，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01；-表示無(wú)數(shù)值

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2.4 對(duì)大鼠毛細(xì)管祛痰作用的影響葫蘆茶水提物各劑量組均可顯著增加大鼠的排痰量，與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表4。

表4 各組大鼠排痰量比較（±s）

表4 各組大鼠排痰量比較（±s）

注：與模型組比較，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01；-表示無(wú)數(shù)值

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2.5對(duì)豚鼠組胺引喘作用的影響葫蘆茶水提物各劑量組對(duì)組胺誘發(fā)的豚鼠哮喘均有明顯的抑制作用，可顯著延長(zhǎng)豚鼠引喘潛伏期，與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表5。

表5 各組組胺致豚鼠哮喘反應(yīng)比較（±s）

表5 各組組胺致豚鼠哮喘反應(yīng)比較（±s）

注：與模型組比較，*表示P＜00.05，**表示P＜00.01；-表示無(wú)數(shù)值

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3 討論

咳嗽、咳痰、氣喘是呼吸系統(tǒng)疾病的常見(jiàn)癥狀，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量［9］。中醫(yī)藥是中國(guó)古代科學(xué)的瑰寶，在治療呼吸系統(tǒng)疾病方面具有獨(dú)特的理論和療效。

本實(shí)驗(yàn)研究的關(guān)鍵是建立合適的動(dòng)物模型?？人詣?dòng)物模型常用的誘咳方法為機(jī)械刺激法和化學(xué)誘導(dǎo)法，由于機(jī)械刺激強(qiáng)度不能控制，故常選用化學(xué)誘導(dǎo)法。研究表明，常用的化學(xué)誘導(dǎo)物質(zhì)有氨水、枸櫞酸、丙烯醛、二氧化硫等，由于二氧化硫引咳的個(gè)體差異較大，而丙烯醛引咳不穩(wěn)定，因此本實(shí)驗(yàn)采用氨水、枸櫞酸誘導(dǎo)建立咳嗽模型，常用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有小鼠、豚鼠和大鼠，小鼠和豚鼠化學(xué)誘導(dǎo)刺激敏感性好，個(gè)體差異小，可靠性高，而大鼠個(gè)體差異較大，可靠性不高，因此本實(shí)驗(yàn)選擇小鼠、豚鼠作為咳嗽動(dòng)物模型。研究結(jié)果表明，葫蘆茶水提物能顯著減少小鼠因氨水所致的咳嗽次數(shù)及豚鼠因枸櫞酸所致的咳嗽次數(shù)，同時(shí)能延長(zhǎng)咳嗽潛伏期。

痰是一種病理產(chǎn)物，當(dāng)呼吸道發(fā)生炎癥病變時(shí)，呼吸道液體的成分就會(huì)發(fā)生改變，形成痰液［10］。祛痰藥的作用原理為增加呼吸道分泌液，使痰液變稀，降低痰液黏度，使痰液易于咳出，本實(shí)驗(yàn)采用小鼠酚紅祛痰法和大鼠毛細(xì)管祛痰法觀(guān)察其祛痰作用，結(jié)果顯示葫蘆茶水提物能增加小鼠氣管酚紅排泌量及增加大鼠毛細(xì)管的排痰量，利于附著氣管黏膜的濃痰變稀從氣管壁脫落，起到祛痰作用。哮喘是由嗜酸性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞等細(xì)胞組分參與的慢性氣道炎癥性疾病，這種慢性炎癥導(dǎo)致氣道高反應(yīng)性的產(chǎn)生，通常出現(xiàn)廣泛多變的可逆性氣流受限，并引起反復(fù)發(fā)作的喘息、氣急、胸悶或咳嗽等癥狀，嚴(yán)重者出現(xiàn)呼吸抑制或窒息，危及生命［11］。本實(shí)驗(yàn)采用組胺引喘法，結(jié)果表明葫蘆茶水提物能延長(zhǎng)組胺致豚鼠哮喘發(fā)作的潛伏期，提示葫蘆茶可對(duì)抗組胺、乙酰膽堿等引起的支氣管收縮。

綜上所述，葫蘆茶具有顯著的鎮(zhèn)咳祛痰平喘作用，本實(shí)驗(yàn)為臨床應(yīng)用葫蘆茶提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論基礎(chǔ)，但是其相關(guān)的藥理作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。