蒙藥藍(lán)刺頭對去卵巢大鼠TGF-β1、BMD及子宮組織形態(tài)的影響*

趙 軍，李 昕，劉 晉，王雄耀，師建平△，董重陽，常 虹，高小明，莫日根，謝靜華

1內(nèi)蒙古自治區(qū)中醫(yī)醫(yī)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特010020；

2內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院；3內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院

原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥按照其成因可分為Ⅰ型和Ⅱ型，其中Ⅰ型骨質(zhì)疏松癥由于雌激素缺乏而多發(fā)生于絕經(jīng)后5～10年的女性，所以也叫絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥（postmenopausal osteoporosis，PMOP）。雌激素替代療法（estrogen replacement therapy，ERT）防治該疾病費(fèi)用昂貴，易出現(xiàn)高血凝狀態(tài)、高血壓、水腫等副反應(yīng)，且長期使用可增加子宮癌及乳腺癌的發(fā)病率［1］。為此，人們在致力于尋求雌激素替代物，這類物質(zhì)被稱作選擇性雌激素受體調(diào)質(zhì)，而植物雌激素正是其中之一。流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，人類激素相關(guān)性疾病低發(fā)區(qū)與食富含植物雌激素的人群成正比，且植物雌激素副作用較小，對圍絕經(jīng)期綜合征、心血管疾病及骨質(zhì)疏松有保健和治療作用［2］。研究顯示［3-4］，蒙藥藍(lán)刺頭具有植物刺激素樣作用，可通過雌激素樣作用促進(jìn)骨形成，骨吸收、降低骨轉(zhuǎn)換率，延緩絕經(jīng)后骨量丟失的發(fā)生發(fā)展，以此達(dá)到防治PMOP的作用。本研究就藍(lán)刺頭對去卵巢大鼠血清轉(zhuǎn)化生長因子β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）、骨密度（bone mineral density，BMD）、子宮組織病理學(xué)變化的影響進(jìn)行研究，現(xiàn)報(bào)道如下：

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器蒙藥藍(lán)刺頭制劑由廣州中醫(yī)藥大學(xué)技產(chǎn)業(yè)園有限公司提供，產(chǎn)地：新疆烏魯木齊市天山區(qū)；采摘時間：2018年7月。強(qiáng)骨膠囊（北京岐黃制藥有限公司，批號：20181103，規(guī)格：0.25 g/粒）；己烯雌酚片（合肥久聯(lián)制藥有限公司，批號：20181004，規(guī)格：0.5 mg/片）。TGF-β1ELISA試劑盒（北京博奧森生物技術(shù)有限公司）；蘇木素-伊紅染液；5%堿性美藍(lán)溶液；亞甲基藍(lán)染液；PBS緩沖液；鹽酸；氨水；酒精。JA503型1/1 000電子稱（凱豐集團(tuán)有限公司）；ACS-H1型電子計(jì)重稱（上海?？惦娮觾x器廠）；低速離心機(jī)（北京醫(yī)用離心機(jī)廠出品，3000 r/min）；冰箱（內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)病理學(xué)實(shí)驗(yàn)中心提供）；SZX19型Olympus顯微鏡（100倍，日本奧林巴斯公司）；圖像分析儀（清華同方Motic Image Advanced 3.0）；Micro-CT（內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)研究中心）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物4月齡雌性Wistar大鼠，77只，平均體質(zhì)量（250±20.00）g，購于內(nèi)蒙古大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物研究中心，動物實(shí)驗(yàn)合格證號：SCXK（蒙）2002-0001。內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)樓病理學(xué)實(shí)驗(yàn)室，大鼠為清潔級，飼養(yǎng)條件一致，標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，恒溫、恒濕，室溫（25±3）℃，空氣濕度55%～65%，自然光照、通風(fēng)良好、自由進(jìn)食水，養(yǎng)于專用鼠籠內(nèi)，每籠11只，購回適應(yīng)環(huán)境7天左右。

1.3 分組與造模將77只大鼠隨機(jī)平均分為藍(lán)刺頭高、中、低劑量組，強(qiáng)骨膠囊組，乙烯雌酚組，模型組，假手術(shù)組7組，每組用亞甲基藍(lán)染液分別編號1～11。絕經(jīng)后PMOP模型的復(fù)制參考文獻(xiàn)［5］進(jìn)行，假手術(shù)組不切卵巢只切除卵巢周圍少量脂肪，造模縫合創(chuàng)口后5天，將大鼠陰道脫落細(xì)胞涂片［6］進(jìn)行觀察。假手術(shù)組大鼠陰道涂片充滿有核細(xì)胞、白細(xì)胞和角質(zhì)化細(xì)胞，而PMOP模型組中很少見上述細(xì)胞，表明造模成功。見圖1。

圖1 光鏡下雌鼠陰道涂片（HE×400）

1.4 給藥及處理正常飼養(yǎng)90天后進(jìn)行藥物干預(yù)灌胃給藥。藍(lán)刺頭高、中、低劑量組依據(jù)人、鼠體質(zhì)量比例及人、鼠代謝速率比折算后分別以27.500 0、13.750 0、6.875 0 mg/mL的劑量灌胃給藥，以低劑量組為臨床等效劑量。強(qiáng)骨膠囊23.437 5 mg/mL，己烯雌酚0.031 3 mg/mL，均按成人劑量的有效量給藥；用相應(yīng)體積的0.9%氯化鈉溶液對模型組和假手術(shù)組進(jìn)行灌胃。為了便于方便配藥，換算為按大鼠體質(zhì)量灌胃0.02 mL/（g·d），配制成相應(yīng)的濃度。灌胃過程中每組死亡2只。處死前1天停止給食，處死時腹腔注射10%水合氯醛0.8 mL麻醉，然后心內(nèi)取血，采血約6～10 mL離心管內(nèi)，采用3000r/min離心5 min后分離血清，進(jìn)行血清TGF-β1，檢測；處死大鼠剖取雙側(cè)完整股骨，分離干凈附著的肌肉組織，保留完整骨膜，將股骨標(biāo)記清楚，將右側(cè)股骨用來測定離體BMD水平；大鼠子宮用4%甲醛溶液浸泡，室溫保存10天，HE染色觀察。

1.5 觀察指標(biāo)

1.5.1 骨組織計(jì)量學(xué)測定 采用顯微CT對所有大鼠右側(cè)股骨BMD計(jì)量學(xué)指標(biāo)進(jìn)行分析。

1.5.2 測定血清TGF-β1水平 采用酶聯(lián)免疫法檢測血清TGF-β1表達(dá)水平，實(shí)驗(yàn)步驟完全按TGFβ1試劑盒說明書操作步驟進(jìn)行。

1.5.3 子宮病理學(xué)觀察 常規(guī)包埋、HE染色。每組大鼠取5張切片（n0），每張切片隨機(jī)選擇5個視野（n1），在光學(xué)顯微鏡下觀察各組染色情況，采用醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)，測定鏡下細(xì)胞：1）子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞高度；2）子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞高度；3）腺腔內(nèi)徑；4）宮內(nèi)膜腺體面積百分比；5）肌全層。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 13.0統(tǒng)軟件計(jì)進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用±s表示，采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 骨組織計(jì)量藍(lán)刺頭中劑量組，乙烯雌酚組，強(qiáng)骨膠囊組，假手術(shù)組與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；藍(lán)刺頭高、低劑量組與模型組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；藍(lán)刺頭高、低劑量組與假手術(shù)組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；藍(lán)刺頭中劑量組、己烯雌酚組、假手術(shù)組、強(qiáng)骨膠囊組組間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 各組大鼠BMD水平比較（±s） g/cm

表1 各組大鼠BMD水平比較（±s） g/cm

注：*表示與模型組比較，P＜0.05；△表示與假手術(shù)組比較，P＜0.05

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2.2 血清TGF-β1水平大鼠血清TGF-β1模型組與假手術(shù)組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；藍(lán)刺頭中劑量、己烯雌酚組、強(qiáng)骨膠囊組與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；藍(lán)刺頭高、低劑量組與模型組比較，無明顯差異（P＞0.05）；藍(lán)刺頭高、低劑量組與假手術(shù)組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；藍(lán)刺頭中劑量組、己烯雌酚組、強(qiáng)骨膠囊組、假手術(shù)組組間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

表2 各組大鼠血清TGF-β1水平比較（±s）ng/mL

表2 各組大鼠血清TGF-β1水平比較（±s）ng/mL

注：*表示與模型組比較，P＜0.05；△表示與假手術(shù)組比較，P＜0.05

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2.3 大鼠子宮病理學(xué)變化大鼠子宮全肌層觀察結(jié)果顯示：假手術(shù)組內(nèi)膜層較去卵巢組厚，內(nèi)膜內(nèi)腺腔明顯，全肌層明顯增厚，細(xì)胞飽滿，排列致密。模型組子宮較假手術(shù)組明顯縮小，內(nèi)膜層薄，內(nèi)膜上皮及腺體上皮較假手術(shù)組明顯變薄，腺腔直徑較假手術(shù)組縮小甚至不明顯，全肌層明顯變薄，細(xì)胞縮小，排列松散。見圖2。

圖2 假手術(shù)組、PMOP模型組大鼠子宮各部位病理學(xué)變化（HE×400）

子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞高度、子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞高度、腺腔內(nèi)徑、宮內(nèi)膜腺體面積百分比，假手術(shù)組、藍(lán)刺頭中劑量組與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；藍(lán)刺頭中劑量組、強(qiáng)骨膠囊組、己烯雌酚組、假手術(shù)組與藍(lán)刺頭高、低劑量組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；藍(lán)刺頭高、低劑量組與模型組比較，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）；藍(lán)刺頭中劑量組、強(qiáng)骨膠囊組、己烯雌酚組、假手術(shù)組組間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表3。

表3 各組大鼠子宮各項(xiàng)指標(biāo)比較（±s）

表3 各組大鼠子宮各項(xiàng)指標(biāo)比較（±s）

注：*表示與模型組比較，P＜0.05；△表示與假手術(shù)組比較，P＜0.05

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3 討論

骨質(zhì)疏松癥屬蒙醫(yī)經(jīng)典文獻(xiàn)中“骨枯癥”范疇。蒙醫(yī)理論認(rèn)為，骨在五元中屬于土，是“赫依之寓所”，也是“赫依”病變串行之道，易發(fā)生骨折等的原因?yàn)闅庋嗖?、精華與糟粕分解功能減弱，“腎氣虛弱，精華不足”是骨質(zhì)疏松癥主要病機(jī)。

研究顯示，蒙藥藍(lán)刺頭有植物雌激素樣作用，可通過雌激素樣作用而促進(jìn)骨形成，調(diào)節(jié)骨吸收與骨形成的偶聯(lián)，降低骨轉(zhuǎn)換率，達(dá)到防治PMOP的目的［7-8］。藍(lán)刺頭可通過降低去卵巢大鼠的骨高轉(zhuǎn)換率，抑制骨吸收，調(diào)節(jié)骨吸收-骨形成偶聯(lián)，防止骨量快速丟失，以延緩絕經(jīng)后骨量丟失的發(fā)生發(fā)展，以此達(dá)到防治PMOP的目的［4］。TGF-β1作為在骨基質(zhì)內(nèi)含量最高的細(xì)胞因子，對骨重建發(fā)揮重要作用。它能促進(jìn)骨細(xì)胞的增值分化及細(xì)胞外基質(zhì)的合成，并促使成熟的破骨細(xì)胞發(fā)生凋亡［9］。子宮質(zhì)量、組織形態(tài)變化是體內(nèi)雌激素變化最靈敏的指標(biāo)，還表現(xiàn)在雌性大鼠的陰道上皮角化等。BMD是診斷骨質(zhì)疏松的“金標(biāo)準(zhǔn)”。

本實(shí)驗(yàn)中，大鼠血清TGF-β1、BMD、子宮組織病理學(xué)變化，藍(lán)刺頭中劑量組在BMD、TGF-β1及子宮病理性改變上與強(qiáng)骨膠囊組，乙烯雌酚組及假手術(shù)組相當(dāng)。說明藍(lán)刺頭適當(dāng)?shù)膭┝磕苡行Х乐我虼萍に販p少而導(dǎo)致的骨質(zhì)疏松，提高血清TGF-β1及BMD水平，在骨組織形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)變化上，藍(lán)刺頭防治絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松大鼠模型是有效的，治療效果與強(qiáng)骨膠囊、己烯雌酚相似。因此，蒙醫(yī)“骨枯癥，補(bǔ)暖補(bǔ)精，補(bǔ)腎固骨質(zhì)壯骨”理論與經(jīng)典的雌激素通路具有密切聯(lián)系，此通路是蒙醫(yī)抗骨質(zhì)疏松基礎(chǔ)理論在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)實(shí)踐中的重要組成部分。

綜上所述，本研究為藍(lán)刺頭蒙醫(yī)“腎主骨，治以補(bǔ)暖補(bǔ)精”理論防治PMOP提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，但其詳細(xì)的機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。