消溶穩(wěn)斑方對(duì)ox-LDL誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞炎癥損傷的作用研究*

蔣 靜，邵 靜

1河南中醫(yī)藥大學(xué)，河南 鄭州450000；2河南中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院

動(dòng)脈粥樣硬化是導(dǎo)致多種心腦血管疾病發(fā)生、發(fā)展的主要病理基礎(chǔ)。冠狀動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的破裂可誘發(fā)不穩(wěn)定心絞痛、急性心肌梗死、猝死等多種心血管危急重癥［1］，對(duì)患者生命造成威脅。因此，如何防治動(dòng)脈粥樣硬化是臨床研究的重點(diǎn)。相關(guān)研究［2］發(fā)現(xiàn)，炎癥反應(yīng)誘導(dǎo)的炎癥因子的釋放可促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中新生血管的萌發(fā)，新生血管的增多會(huì)造成動(dòng)脈粥樣硬化斑塊內(nèi)環(huán)境的失衡，增加斑塊內(nèi)出血、破裂的可能。另外，炎癥反應(yīng)也是目前得到普遍認(rèn)可的導(dǎo)致斑塊不穩(wěn)定性增加甚至破裂的促發(fā)因素［3］。研究證實(shí)，單磷酸腺苷酶活化蛋白激酶（amp-activated protein kinas，p-AMPK）/沉默信息調(diào)節(jié)因子1（silent information regulator 1，SIRT1）是調(diào)節(jié)機(jī)體能量代謝、維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)蛋白［4-5］。AMPK參與調(diào)節(jié)機(jī)體多種炎癥反應(yīng)信號(hào)通路，在氧化還原反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。AMPK可以通過(guò)反饋調(diào)節(jié)，調(diào)控SIRT1的表達(dá)，SIRT1可作用于下游分子通路，干預(yù)炎癥反應(yīng)過(guò)程。內(nèi)皮細(xì)胞SIRT1的表達(dá)、AMPK的激活可增加抑制炎癥基因編碼，上調(diào)組織炎癥因子的釋放水平，最終維持內(nèi)環(huán)境的平穩(wěn)，抑制氧化應(yīng)激、抗炎的作用［6］。研究證實(shí)［7］，AMPK可通過(guò)對(duì)SIRT1活性的調(diào)節(jié)，抑制IKKβmRNA、MMP-9 mRNA的表達(dá)上調(diào)氧化酶、炎癥因子的釋放閾值，從而減輕炎癥反應(yīng)促發(fā)的不穩(wěn)定斑塊的破裂，降低不良心血管事件的發(fā)生率。本研究通過(guò)建立ox-LDL誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞炎癥損傷模型，基于AMPK/SIRT1通路探討消溶穩(wěn)斑方對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)的抑制作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物30只雄性SD大鼠，體質(zhì)量200～250 g，購(gòu)自河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)：SYXK（豫）2017-0006。

1.2 藥物及材料瑞舒伐他汀鈣片［阿斯利康藥業(yè)（中國(guó)）有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字J20170008，規(guī)格：10 mg/片］；消溶穩(wěn)斑方（藥物組成：黃芪15 g，葛根15 g，半夏10 g，水蛭10 g，佛手15 g，郁金15 g，地龍15 g，甘松10 g）濃縮成2.1 g/mL的中藥浸膏；人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（河南中醫(yī)藥大學(xué)本院中心實(shí)驗(yàn)室提供，批號(hào)：04-400-1A）；高糖DMEM培養(yǎng)基、PBS、胰蛋白酶-EDTA消化液胎牛血清FBS、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、RIPA裂解液、β-actin單克隆抗體、HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG、Phospho-AMPKα（Thr172）抗體、AMPKα抗體、eECL Western Blot Kit高靈敏度化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒（北京康維世紀(jì)生物科技有限公司，批號(hào)：CW0049M）；PVDF膜、脫脂奶粉、Tris堿甘氨酸、十二烷基硫酸鈉、丙烯酰胺（Life Science公司，批號(hào)：LC2007）；RNA提取試劑Trizol Reagent（Invitrogen Life Technologies，批號(hào)：15596018）；無(wú)酶水（索萊寶，批號(hào)R1600）；無(wú)水乙醇、異丙醇、氯仿、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Invitrogen，批 號(hào)：4368814）；SybrGreen Mix kit（Invitrogen，批號(hào)：A25742）。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器IX73型倒置相差顯微鏡（日本OLYMPUS）；C170型CO2培 養(yǎng) 箱（德 國(guó)Binder）；ST16R型離心機(jī)（北京雷勃爾）；BCD-233GB型冰箱（青島海爾股份有限公司）、ULT-1386-3型超低溫冷凍柜（美國(guó)REVCO公司）；37℃恒溫培養(yǎng)箱（北京福意電器有限公司）；CF16RXⅡ低溫高速離心機(jī)（日立）；全波長(zhǎng)掃描式多功能讀數(shù)儀（Thermo fisher）；DYY-6C型電泳儀、BIO-RAD Mini-TRANSBLOT CELL、DYCZ-24DN型迷你雙垂直電泳槽、TS-1脫色搖床（太倉(cāng)市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠）；LAS-4000 MINI型生物分子成像儀（日本富士）；ABI 7500型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（北京眾力挽生物科技有限公司）；Nanodrop 2000型核酸蛋白濃度微量測(cè)定儀（Thermo）。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 動(dòng)物分組及藥物干預(yù) 將30只雄性SD大鼠隨機(jī)分為3組，對(duì)照組15只，他汀組5只，消溶穩(wěn)斑方組10只，普通喂養(yǎng)3天后，于第4天開始灌胃。消溶穩(wěn)斑方組按成人用藥量的10倍給藥，他汀組按成人用藥量的5倍給藥，對(duì)照組予蒸餾水灌胃。各組每日灌胃2次，連續(xù)3天。于末次給藥1 h后，向腹腔注射10%的水合氯醛（0.3 mL/100 g），待麻醉成功后進(jìn)行腹主動(dòng)脈取血。每只大鼠取動(dòng)脈血約8～10 mL，離心半徑10 cm，3000 r/min離心15 min，取上層血清，置于恒溫水浴鍋中56℃、30 min水浴滅活處理。將滅活的血清用0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾除菌，然后分裝成2 mL/管，標(biāo)記后放入-20℃冰箱備用。

1.4.2 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng) 將凍存管中的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞復(fù)蘇，將細(xì)胞懸液放入離心管離心后，倒掉上清液，將細(xì)胞團(tuán)塊打散，加入完全培養(yǎng)基（10%FBS+90%DMEM混合液），置于37℃的5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取第三代細(xì)胞備用。

1.4.3 細(xì)胞分組及藥物干預(yù) 選擇培養(yǎng)的第三代人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，將其分為空白組，模型組，他汀組，中藥低、中、高濃度組，中藥中濃度+抵抗素組。空白組用含10%正常大鼠血清+90% DMEM；模型組用含ox-LDL（100 mg/L）+10%正常大鼠血清+90%DMEM；他汀組用含ox-LDL（100 mg/L）+10%瑞舒伐他汀大鼠血清+90%DMEM；中藥低濃度組用含ox-LDL（100 mg/L）+10%中藥低濃度大鼠血清+90%DMEM；中藥中濃度組用含ox-LDL（100 mg/L）+10%中藥中濃度大鼠血清+90%DMEM；中藥高濃度組用含ox-LDL（100 mg/L）+10%中藥高濃度大鼠血清+90%DMEM；中藥中濃度+抵抗素組用含ox-LDL（100mg/L）+10%中藥中濃度大鼠血清+抵抗素50 ng/mL+90%DMEM。將分組后的細(xì)胞于37℃的5%CO2培養(yǎng)箱中靜置24 h。

1.5 觀察指標(biāo)

1.5.1 采用Western Blot法測(cè)定p-AMPK、SIRT1水平 將藥物干預(yù)24 h的細(xì)胞取出，吸除培養(yǎng)基，用PBS（4℃）洗2遍，加入適量組織蛋白裂解液后提取總蛋白，BCA法測(cè)蛋白濃度，行SDS-PAGE電泳分析，電泳（8 V/cm，進(jìn)入分離膠后提至15 V/cm）后行蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)膜，待轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，將標(biāo)記過(guò)的PVDF膜放在封閉液中室溫振搖封閉2 h。棄去封閉液，分別用內(nèi)參蛋白和目的蛋白的一抗進(jìn)行雜交，于4℃中反應(yīng)過(guò)夜。取出PVDF膜，TBST漂洗，以HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG做為二抗，室溫下振搖反應(yīng)1 h。取出PVDF膜，TBST漂洗，在濾紙上瀝干液體。把PVDF膜浸入發(fā)光液中室溫孵育3 min，進(jìn)行曝光照相。

1.5.2 采用熒光定量RT-PCR法檢測(cè)IKKβmRNA、MMP-9 mRNA含量 取100 mg人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，加入Trizol試劑1 mL，按照產(chǎn)品說(shuō)明提取總RNA。然后將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，具體參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明進(jìn)行，引物序列見表1。將反轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)獲得的cDNA溶液10倍稀釋，進(jìn)行反應(yīng)液配置，然后在ABI 7500 Fast上進(jìn)行Real Time PCR反應(yīng)。MMP-9反應(yīng)條件：94℃，5 min，然后進(jìn)入PCR循環(huán)，94℃預(yù)變性30 s，分別于60℃和58℃退火30 s，72℃延伸45 s，循環(huán)33次后再延伸5 min。IKKβ反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min，95℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，72℃充分延伸5 min，4℃保存。取PCR產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠中電泳，然后在凝膠成像系統(tǒng)上掃描，測(cè)定各目的基因吸光度值，分別計(jì)算其比值，以目的條帶吸光度比值進(jìn)行半定量分析。

表1 引物序列

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以±s表示，多組間比較采取單因素方差分析，若方差齊則采取L-S-D檢驗(yàn)，方差不齊則采用Dunnett’T3檢驗(yàn)；P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 p-AMPK、SIRT1蛋白水平1）p-AMPK水平：與空白組比較，模型組，他汀組，中藥低、中濃度組p-AMPK水平均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；中藥高濃度組、中藥中濃度+抵抗素組p-AMPK水平雖有降低趨勢(shì)，但組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與模型組比較，他汀組，中藥低、中、高濃度組及中藥中濃度+抵抗素組p-AMPK水平均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與他汀組比較，中藥低濃度組p-AMPK水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；中藥中、高濃度組及中藥中濃度+抵抗素組p-AMPK水平升高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。2）SIRT1水平：與空白組比較，模型組，中藥低、中濃度組SIRT1蛋白水平均降低（P＜0.05），其余各組SIRT1蛋白水平有升高趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與模型組比較，他汀組，中藥低、中、高濃度組及中藥中濃度+抵抗素組SIRT1水平均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與他汀組比較，中藥低、中濃度組SIRT1蛋白水平降低差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），中藥高濃度組及中藥中濃度+抵抗素組SIRT1蛋白水平雖較瑞舒伐他汀組升高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖1、表2。

表2 各組細(xì)胞p-AMPK、SIRT1蛋白水平比較（±s）

表2 各組細(xì)胞p-AMPK、SIRT1蛋白水平比較（±s）

注：*表示與空白組比較，P＜0.05；▲表示與模型組比較，P＜0.05；○表示與他汀組比較，P＜0.05

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圖1 各組細(xì)胞p-AMPK、STRI1蛋白表達(dá)

2.2 IKKβmRNA、MMP-9 mRNA表達(dá)量1）IKKβmRNA的表達(dá)：與空白組比較，模型組、中藥低濃度組IKKβmRNA表達(dá)水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），余治療組與空白組間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與模型組比較，他汀組，中藥低、中、高濃度組及中藥中濃度+抵抗素組IKKβmRNA表達(dá)水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。與他汀組比較，中藥低濃度組IKKβmRNA表達(dá)水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；中藥中、高濃度組及中藥中濃度+抵抗素組IKKβmRNA表達(dá)水平升高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。2）MMP-9 mRNA的表達(dá)：與空白組比較，模型組、中藥低濃度組MMP-9 mRNA表達(dá)水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），余治療組MMP-9 mRNA的表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與模型組比較，他汀組，中藥低、中、高濃度組及中藥中濃度+抵抗素組MMP-9 mRNA表達(dá)水平均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。與他汀組比較，僅中藥低濃度組MMP-9 mRNA表達(dá)水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表3。

表3 各組細(xì)胞IKKβ mRNA、MMP-9 mRNA表達(dá)水平比較（±s）

表3 各組細(xì)胞IKKβ mRNA、MMP-9 mRNA表達(dá)水平比較（±s）

注：*表示與空白組比較，P＜0.05；△表示與模型組比較，P＜0.01；○表示與他汀組比較，P＜0.05

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3 討論

動(dòng)脈粥樣硬化屬于中醫(yī)學(xué)中“脈痹”范疇。筆者結(jié)合多年診治動(dòng)脈粥樣硬化性疾病的臨床經(jīng)驗(yàn)，以“益氣活血，化瘀通絡(luò)”為法，自擬消溶穩(wěn)斑方［8］。消溶穩(wěn)斑方［9］由黃芪、葛根、水蛭、地龍、佛手、郁金、半夏、甘松諸藥配伍而成。方中重用黃芪為君，氣為血之帥，氣行則血行，血行則血脈得通，血瘀得化［10］；葛根與黃芪為伍，共為君藥，使補(bǔ)而不燥，化生有源［11］。水蛭、地龍為臣藥，水蛭功善破血逐瘀，地龍走竄通絡(luò)，二者助君藥通絡(luò)行血，脈痹自除；佛手、郁金為佐藥，二者寬中理氣，行氣解郁，調(diào)暢氣機(jī)；半夏為佐藥，取其祛痰下氣，化痰散結(jié)之功；甘松亦為使藥，性甘溫，入心經(jīng)，有理氣、疏郁、通陽(yáng)之功。此外，甘松尚有醒脾導(dǎo)滯，行氣降逆之能，故使補(bǔ)而不壅，寓疏于補(bǔ)。諸藥合用，使血行瘀得以化，氣行郁得以疏，氣血調(diào)和，血脈自通，脈痹自除。

SIRT1是一種NAD+依賴性組蛋白去乙?；福cAMPK之間存在反饋調(diào)節(jié)機(jī)制，因此，它可通過(guò)激活A(yù)MPK，增強(qiáng)AMPK對(duì)煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）氧化酶的負(fù)調(diào)控，抑制炎癥基因IKKβ mRNA、MMP-9 mRNA復(fù)制，上調(diào)炎癥因子釋放閾值，減輕氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)［12］。研究發(fā)現(xiàn)［13］，動(dòng)脈粥樣硬化患者的血管內(nèi)皮細(xì)胞表面存在的NADPH氧化酶亞基水平上升，而降低NADPH氧化酶活性則可降低氧化應(yīng)激水平，進(jìn)而緩解高脂、炎癥等引起的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷。研究證實(shí)，炎癥損傷，可激活組織細(xì)胞中AMPK蛋白，轉(zhuǎn)變?yōu)榱姿峄腁MPK，而p-AMPK水平升高后則會(huì)上調(diào)位于其下游的調(diào)控蛋白SIRT1蛋白的表達(dá)［14］，同時(shí)SIRT1蛋白表達(dá)的增加可催化轉(zhuǎn)錄因子核因子（nuclear factor-κB，NF-κB）去乙?；磻?yīng)而降低其活性，抑制炎癥相關(guān)基因IKKβ mRNA、MMP-9 mRNA的轉(zhuǎn)錄，從而減少炎性因子的釋放［15］。

本研究發(fā)現(xiàn)，消溶穩(wěn)斑方可通過(guò)作用于AMPK/SIRT1信號(hào)通路，激活A(yù)MPK使其磷酸化，同時(shí)通過(guò)正反饋上調(diào)SIRT1水平，增加p-AMPK及SIRT1的水平來(lái)發(fā)揮抑制動(dòng)脈粥樣硬化斑塊及損傷內(nèi)皮細(xì)胞中的炎癥基因IKKβmRNA、MMP-9 mRNA的表達(dá)［16］，發(fā)揮抑制炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激損傷的用，從而減少炎癥反應(yīng)導(dǎo)致的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷，降低動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成的風(fēng)險(xiǎn)。