基于一步法制備的納米復(fù)合材料發(fā)展光電化學方法檢測鈣衛(wèi)蛋白

李 琪，羅 晶，顧鑫鑫，鐘 琦，楊海峰，吳一萍

（上海師范大學化學與材料科學學院，上海200234）

0 引言

炎癥性腸病（IBD）是不明原因的慢性腸道炎癥性疾病.隨著社會競爭壓力增大，IBD發(fā)病率急劇上升，已成為威脅人群身體健康的主要腸道疾病之一［1］.IBD患者常有腹痛、腹瀉、便血、發(fā)熱、消瘦等臨床表現(xiàn)，根據(jù)這些臨床表現(xiàn)，結(jié)合各種血液檢查、糞便檢查及結(jié)腸鏡和X線鋇劑灌腸檢查等，可做出診斷.但無論是結(jié)腸鏡還是X線鋇劑灌腸檢測，都屬于入侵式檢查，會給患者帶來諸多不適.另外，IBD臨床表現(xiàn)多樣，個體差異大，所以目前針對IBD的診斷仍缺少有效的評價指標［2］.鈣衛(wèi)蛋白（CP）是一種來源于中性粒細胞和巨噬細胞的含鈣蛋白.當腸道發(fā)生炎癥時，中性粒細胞就會對炎癥做出反應(yīng)，釋放出CP，而且在感染部位CP的質(zhì)量濃度甚至會超過1 mg·L-1.此外，CP也可在尿液、糞便、血漿、腦脊液以及結(jié)腸活檢中檢出［3-4］.2005年英國腸胃病學年會將CP作為評估IBD患者炎癥活動及黏膜愈合情況的無創(chuàng)性診斷指標［5］.臨床檢測CP的意義在于，可排除非炎癥性疾?。?］，確定真正需要胃鏡檢查和活檢的患者，預(yù)估和判斷IBD患者治療后復(fù)發(fā)的風險.

光電化學（PEC）傳感器是一種新興且蓬勃發(fā)展的分析方法.PEC技術(shù)在檢測過程中以光作為激發(fā)源，把電極上產(chǎn)生的電流作為檢測信號.如此，激發(fā)信號和檢測信號分離，使PEC檢測具有較低的背景信號.對于PEC分析，電極材料的選擇和傳感模式的構(gòu)建在提高光電轉(zhuǎn)換效率和獲得理想的靈敏度等方面起著重要的作用.目前，已開發(fā)出多種光敏金屬半導(dǎo)體材料，如碲化鎘（CdTe）、硒化鎘（CdSe）、氧化鋅（ZnO）、二氧化鈦（TiO2）、二氧化錫（SnO2）和硫化鉍（Bi2S3）等.但很多材料在PEC測定的實際應(yīng)用中仍受到限制，這主要歸因于：1）PEC檢測中常用的半導(dǎo)體（例如CdTe和CdSe）毒性高，穩(wěn)定性也較差；2）一些半導(dǎo)體具有較寬的禁帶，例如SnO2禁帶為3.6 eV，ZnO禁帶為3.2 eV，需要較高能量的激發(fā)光源.因此開發(fā)具有低成本、高效益且可低能量激發(fā)的光活性材料是PEC發(fā)展的理想之路［7-8］.

本文作者利用化學反應(yīng)Sn2++AuCl4-+OH-→SnO2+Au+H2O，一步合成了金納米粒子（Au NPs）敏化二氧化錫（SnO2）的SnO2＠Au NPs納米復(fù)合材料［9］.合成的SnO2＠Au NPs納米復(fù)合材料不僅具有較寬的可見光吸收范圍，而且金屬與半導(dǎo)體之間存在的肖特基勢壘可以有效抑制光生電子-空穴復(fù)合，有效提高納米復(fù)合材料的光電性能.之后，利用所制備的納米復(fù)合材料，采用雙抗體夾心方案發(fā)展了可以特異性檢測CP的PEC方法.

1 實驗部分

1.1 實驗試劑

無水乙醇、丙酮、異丙醇、碳二亞胺（EDC）及N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）購自Adamas公司；氫氧化鈉（NaOH）、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、氯金酸（HAuCl4·4H2O）、聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X-100）、Tris-EDTA緩沖液（pH=8.0）、巰基乙酸（TGA）及L-抗壞血酸-2-磷酸三鈉鹽（AAP）購自Sigma公司；氯化亞錫（SnCl2·2H2O）購自國藥集團；CP（S100A8+A9）、鈣衛(wèi)蛋白抗體1（Ab1）及生物素-鈣衛(wèi)蛋白抗體2（biotin-Ab2）購自上海領(lǐng)潮生物科技有限公司；堿性磷酸酶-鏈霉親和素（ALP-SA）、抗體稀釋液及質(zhì)量分數(shù)為2%的牛血清蛋白（BSA）封閉液購自上海凌峰化學試劑有限公司.

1.2 實驗儀器

氧化銦錫（ITO）導(dǎo)電玻璃，深圳偉光公司南玻集團；光電化學反應(yīng)儀，PEAC 200A型，天津艾達恒晟科技發(fā)展有限公司；X射線衍射儀（XRD），Rigku XRD Mini Flex，日本理學公司；電化學工作站，CHI440D，上海辰華儀器有限公司；臺式勻膠機，KW-4A型，中國科學院微電子研究所；場發(fā)射掃描電子顯微鏡（FE-SEM），Hitachi S-4800，日本日立公司；熒光分光光度計，F(xiàn)4600，日本日立公司；紫外分光光度計，UV-2600，日本島津公司；X射線光電子能譜儀（XPS），AXIS-ULTRA DLD，日本島津公司；陶瓷纖維馬弗爐，8-12T/TP，上海慧泰儀器制造有限公司；干燥箱，DZF-6000，上海慧泰儀器制造有限公司；純水儀，Milli-Q，上海淼康實業(yè)有限公司.

1.3 制備ITO/SnO2＠Au NPs納米復(fù)合電極

利用化學反應(yīng)Sn2++AuCl4-+OH-→SnO2+Au+H2O設(shè)計了一步合成法制備SnO2＠Au NPs納米復(fù)合材料，具體步驟如下.

1）配制SnO2＠Au NPs前驅(qū)液.在兩口圓底燒瓶中先加入0.06 g PVP和6.0 mL無水乙醇，攪拌10 min得到均一透明的溶液.接著，通15 min氧氣（O2）排盡燒瓶內(nèi)的空氣.然后，加入1 g SnCl2·2H2O，塞住燒瓶瓶口，O2氛圍攪拌5 min.接著，用注射器加入0.4 mL質(zhì)量分數(shù)為1%的HAuCl4和0.2 mL Triton X-100溶液，攪拌5 min后，緩慢滴加0.6 mL 1.0 mol·L-1NaOH溶液.繼續(xù)攪拌5 min，最后加入2.5 mL H2O，攪拌3 h后得到香芋紫色的前驅(qū)液.

2）制備ITO/SnO2＠Au NPs電極.將步驟1中制備的前驅(qū)液（70μL）旋涂在洗凈的ITO玻璃的導(dǎo)電面（5 cm×5 cm）；自然晾干后將電極放入450℃馬弗爐中煅燒2 h；取出電極，用去離子水沖洗3次，氮氣（N2）吹干，得到的電極記為ITO/SnO2＠Au NPs，將電極切成5.0 cm×1.0 cm規(guī)格以備使用.

3）制備ITO/SnO2電極.步驟1中不加HAuCl4，其他實驗操作不變，得到的電極記為ITO/SnO2.

1.4 PEC傳感器的組裝

1）制備ITO/SnO2＠Au NPs/TGA/Ab1電極.為了通過酰胺鍵（-CO-NH-）固定Ab1，先在制備好的ITO/SnO2＠Au NPs電極表面（1.0 cm×1.0 cm）滴30μL TGA溶液，室溫下孵育30 min，目的是使其表面吸附大量的-COOH.洗滌液沖洗3次，洗去多余的EDC和NHS.接著滴30μL 1μg·mL-1Ab1，4℃潮濕環(huán)境中孵育16 h，Ab1中的-NH2與-COOH結(jié)合形成-CO-NH-，洗滌液沖洗3次，洗去非特異性吸附的Ab1.

2）制備ITO/SnO2＠Au NPs/TGA/Ab1/CP電極.在電極表面滴涂30μL BSA封閉液，4℃潮濕環(huán)境中孵育2 h封閉未結(jié)合的位點.洗滌液沖洗3次后，N2吹干，再滴加不同濃度的抗原CP（30μL），并在37℃條件下孵育1 h.

3）制備ITO/SnO2＠Au NPs/TGA/Ab1/CP/Ab2電極.滴涂10μg·mL-1biotin-Ab2，37℃條件下孵育1 h.

4）制備ITO/SnO2＠Au NPs/TGA/Ab1/CP/Ab2/ALP電極.滴涂10μg·mL-1ALP-SA，37℃條件下孵育30 min，堿性磷酸酶（ALP）通過鏈霉親和素和生物素之間的親和作用被固定在電極表面.

5）制備ITO/SnO2＠Au NPs/TGA/Ab1/CP/Ab2/ALP/AAP電極.之后，將30μL 0.01 mol·L-1AAP滴涂到電極上，37℃條件下孵育30 min即可.以上每一步完成后都要對電極進行清洗（洗滌液清洗3次）以及N2吹干.最后，對電極進行PEC測試.

1.5 電化學阻抗（EIS）表征

通過CHI 440C電化學工作站，采用交流阻抗技術(shù)對電極進行了EIS表征，從而驗證電極表面修飾是否成功.其中，三電極系統(tǒng)包括：本工作所制備的電極作為工作電極，銀/氯化銀（Ag/AgCl）電極作為參比電極，鉑（Pt）絲電極作為輔助電極.含0.1 mol·L-1KCl的5.0 mmol·L-1［Fe（CN）6］3-/4-溶液為阻抗液，振幅設(shè)置為20 mV，低頻設(shè)置為0.1 Hz，高頻設(shè)置為100 000 Hz.整個EIS實驗在安靜的環(huán)境下完成.

1.6 PEC測試

電極的PEC測試是在PEAC 200A型PEC反應(yīng)儀上進行的.其中，激發(fā)光源為465 nm的藍光，開燈時間設(shè)置為10 s，關(guān)燈時間設(shè)置為10 s，實驗過程光源的啟動和關(guān)閉全自動化.檢測系統(tǒng)為CHI 440C電化學工作站，采用計時電流技術(shù)進行光電檢測.Ag/AgCl為參比電極，Pt絲電極為對電極，0.01 mol·L-1Tris-HCl（pH=8.0）為電解質(zhì)，偏壓設(shè)置為+0.4 V.

1.7 實際血液中CP的測定

血液樣品的預(yù)處理過程如下：2.0 mL血液樣品在3 000 r·min-1轉(zhuǎn)速離心10 min.將上清液轉(zhuǎn)移至試管中，并在-20℃下存貯備用［10］.加標溶液是通過向血樣中添加不同體積的CP母液配制得到的，最終的質(zhì)量濃度分別為1.0，5.0和10.0μg·mL-1.

2 結(jié)果與討論

2.1 SnO2＠Au NPs膜的形貌表征

從宏觀看，SnO2薄膜為半透明白色，而SnO2＠Au NPs薄膜為半透明淡紫色.通過FE-TEM表征薄膜的微觀形貌，結(jié)果如圖1（a）所示，合成的SnO2納米顆粒大小均勻且致密，粒徑約5 nm，并且SnO2膜上負載著一定量的Au NPs.圖1（b）為放大后的結(jié)果，可以看到Au NPs粒徑約為20 nm.此外，通過圖1（b）的mapping圖可以清楚地看到Sn，O和Au元素的存在，進一步證明通過一步合成法成功制備SnO2＠Au NPs納米復(fù)合材料.

圖1 SnO2＠Au NPs膜的形貌表征.（a）SnO2＠Au NPs的FE-TEM圖；（b）選區(qū)的能譜mapping圖

2.2 SnO2＠Au NPs膜的結(jié)構(gòu)表征

通過XPS技術(shù)可獲得納米復(fù)合材料的元素價態(tài)等信息.圖2（a）是SnO2＠Au NPs的XPS全譜圖，結(jié)果表明材料中存在Sn和O元素，而銦（In）元素源于底層的ITO玻璃.通過XPS譜圖并沒有得到Au元素的特征譜峰.Sn 3d的XPS譜圖如圖2（b）所示，在486.7 eV和495.0 eV處的2個峰，分別歸屬為Sn 3d5/2和Sn 3d3/2的自旋態(tài)，表明該復(fù)合納米材料中的Sn元素為+4價.通過XRD表征，可以觀察到Au的存在，結(jié)果如圖2（c）所示.2θ分別為26.9°，33.6°，37.8°，51.6°，61.8°和65.5°的6個特征峰歸屬于SnO2的（100），（101），（200），（211），（310）和（301）晶面，表明在該納米復(fù)合材料中SnO2為四方相金紅石結(jié)構(gòu)（JCPDS#41-1445）［11-12］.與純SnO2相比，SnO2＠Au NPs在2θ為44.7°處出現(xiàn)新的衍射峰，歸屬于單質(zhì)Au的（200）晶面（JCPDS#04-0784）［13］.綜上結(jié)果，利用XPS和XRD技術(shù)，進一步表征了SnO2＠Au NPs復(fù)合納米材料的化學狀態(tài).

圖2 SnO2＠Au NPs膜的結(jié)構(gòu)表征.（a）SnO2＠Au的XPS全譜圖；（b）Sn 3d的XPS譜圖；（c）XRD結(jié)果圖

2.3 材料的光學性質(zhì)考察

為了考察合成的納米復(fù)合材料是否具有理想的光學性能，通過相關(guān)檢測儀器獲得了材料的紫外-可見漫反射光譜和光致發(fā)光光譜（PL）.如圖3（a）所示，與純SnO2在315 nm處的紫外吸收峰相比，SnO2＠Au NPs復(fù)合材料在此位置的SnO2吸收峰發(fā)生了紅移，表明Au NPs與SnO2成功摻雜.另外，復(fù)合材料的紫外-可見吸收峰峰強度明顯增強，且對光的吸收范圍拓寬到可見光區(qū)域，表明在Au摻雜后，所制備的金屬-半導(dǎo)體納米復(fù)合材料對光的利用率顯著提高.PL是指半導(dǎo)體中的e-受光激發(fā)，從價帶躍遷至導(dǎo)帶，價帶中留下h+.e-和h+通過弛豫達到各自的準平衡態(tài).準平衡態(tài)下的e-和h+復(fù)合發(fā)光，形成不同波長光的能量分布光譜圖［14］.如圖3（b）所示，Au NPs摻雜后，合成材料在730 nm處PL強度明顯下降，說明異質(zhì)材料中電子-空穴的復(fù)合率下降，反向表明此復(fù)合材料的傳質(zhì)效率如期提高.

圖3 SnO2和SnO2＠Au NPs的（a）固體紫外-可見漫反射譜圖和（b）PL圖

2.4 PEC可行性分析

如圖4所示，通過PEC測試對合成的材料進行了評估.在Tris-HCl（pH=8.0）電解液中，Au摻雜后，SnO2＠Au NPs材料（C線）光電流強度顯著高于單純的納米SnO2材料（B線），表明半導(dǎo)體納米材料的光電性能經(jīng)過貴金屬納米材料的摻雜后顯著改善，與先前光學考察的結(jié)果保持一致.接著，在電解液中加入一定量的還原物抗壞血酸（AA）［15］，初步驗證了此材料對還原性物質(zhì)的響應(yīng)，如圖4中D線所示，隨著還原性物質(zhì)AA的加入，光電流進一步升高.以上結(jié)果表明：所制備的ITO/SnO2＠Au NPs電極對AA有光電響應(yīng)，可實現(xiàn)對AAP的水解產(chǎn)物AA的檢測分析.

圖4 不同電極在含有1.0 mol·L-1 AA的Tris-HCl溶液和不含AA的Tris-HCl溶液的光電響應(yīng)圖

2.5 傳感機制

通過一步合成法制備得到致密穩(wěn)定的SnO2＠Au NPs納米復(fù)合物，且材料的重現(xiàn)性良好，可在電極表面修飾識別層［16］，已有的表征結(jié)果也證實生成的材料多方面性能有所提升.由于PEC檢測最明顯的缺點是專一性不強，為了解決該問題，設(shè)計了如圖5所示的特異性良好的抗原-抗體“三明治”夾心結(jié)構(gòu)的生物傳感器來檢測目標物.

圖5 免疫“夾心法”檢測CP機理圖

此傳感器的設(shè)計從復(fù)合材料對還原物AA具有光電響應(yīng)入手，在ITO/SnO2＠Au NPs電極表面修飾CP的Ab1，抗原CP與抗體Ab1特異性結(jié)合，將待測物拉近電極表面.然后，CP的另一個活性位點可識別修飾有ALP的Ab2，由此形成抗體-抗原-抗體“三明治”夾心結(jié)構(gòu).ALP可催化AAP水解生成供電子體AA，增強光電信號.光照條件下，SnO2＠Au NPs復(fù)合材料吸收光子，受激產(chǎn)生熱電子，這些熱電子一部分經(jīng)ITO半導(dǎo)體導(dǎo)入外電路形成光電流，另一部分會與空穴復(fù)合.隨著AA的產(chǎn)生，AA作為還原劑可以有效填補光生空穴，使得電子空穴復(fù)合率下降，光電流響應(yīng)上升，由此構(gòu)建光電流強度與CP濃度間的相關(guān)性.值得一提的是，由于金屬-半導(dǎo)體異質(zhì)結(jié)構(gòu)界面處存在肖特基勢壘，可以有效降低半導(dǎo)體中光生電子-空穴的復(fù)合率，促使材料光電響應(yīng)增高［17］.

2.6 傳感器的電化學表征

為確保此傳感器的成功構(gòu)建，利用電化學技術(shù)對整個構(gòu)建過程進行了監(jiān)測表征.首先是圖6的PEC響應(yīng)，可見在含0.01 mol·L-1AAP的電解質(zhì)溶液中，ITO/SnO2＠Au NPs電極的本征信號約180 nA，當電極表面修飾上TGA后，由于TGA具有還原性，使電流信號上升到約400 nA.接著，由于TGA中的-COOH和Ab1中的-NH2易形成酰胺鍵［18］，可將CP Ab1拉近電極表面，但抗體蛋白導(dǎo)電性差，使光電流降低了一點.隨后，在電極表面逐步孵育BSA，CP，Ab2和ALP，顯而易見，因蛋白質(zhì)不導(dǎo)電，光電流強度也逐步下降.最后一步，修飾上ALP后，ALP可催化AAP轉(zhuǎn)化成AA［19］，可作為還原劑向電極提供電子，光電流顯著上升至750 nA，證實了此傳感器檢測CP的可行性.

圖6 不同電極層層組裝后的光電響應(yīng)圖（電解質(zhì)為0.01 mol·L-1 Tris-HCl溶液）

此外，還通過EIS技術(shù)表征了傳感器的組裝過程.電極的阻抗值（Ret）可用高頻下半圓直徑大小進行評估，較小的圓弧半徑意味著在電極和電解質(zhì)的界面處電荷轉(zhuǎn)移效率更高［20］.如圖7所示，ITO/SnO2＠Au NPs材料自身電阻很小，EIS結(jié)果呈現(xiàn)一個很小的半圓.修飾TGA后，由于TGA具有一定的還原性，可向電極傳輸電子，Ret減小.隨著Ab1，BSA，CP，Ab2，ALP和AAP的組裝，半圓逐漸增大，表明電極表面不導(dǎo)電層不斷增厚，電極表面層層修飾成功.綜上所述，PEC檢測和EIS測試結(jié)果均證實PEC傳感器的成功組裝.

圖7 不同電極層層修飾后在含0.1 mol·L-1 KCl的5 mmol·L-1［Fe（CN）6］3-/4-溶液中的EIS圖

2.7 PEC檢測CP

AAP在ALP的催化下被轉(zhuǎn)化為AA，能給ITO/SnO2＠Au NPs電極提供電子，金屬-半導(dǎo)體界面形成的肖特基勢壘可加快電子傳輸過程，從而使電極的光電流增強［21］.圖8（a）為最優(yōu)實驗條件下此生物傳感器對不同質(zhì)量濃度CP（質(zhì)量濃度分別為0.01，0.10，1.00，10.00，20.00，50.00和100.00μg·mL-1）的PEC響應(yīng)結(jié)果.顯然，隨著CP質(zhì)量濃度的增加，光電流先緩慢增長，當CP質(zhì)量濃度超過20μg·mL-1時，由于AA大量生成，光電流信號陡然增加.然而，當CP質(zhì)量濃度超過50μg·mL-1時，CP上的結(jié)合位點有限，特異性結(jié)合的Ab2達到飽和，AAP還原生成的AA也趨于飽和，導(dǎo)致電子傳輸性能接近最大值，光電流緩慢上升，并趨于平穩(wěn).圖8（b）是傳感器檢測CP的光電流值隨CP質(zhì)量濃度變化的擬合圖，內(nèi)插圖是其中良好的線性范圍（0.01～20.00μg·mL-1），標準方程為I=731.99+174.74 lg c（R2=0.992 6），其中，I為光電流值（單位nA），c為CP的質(zhì)量濃度（單位質(zhì)量μg·mL-1），R2為相關(guān)系數(shù)，檢測限為3.2 ng·mL-1，線性范圍寬且檢測限低.

圖8 CP質(zhì)量濃度梯度的考察.（a）不同質(zhì)量濃度CP的光電流響應(yīng)；（b）對應(yīng)的線性擬合圖（內(nèi)插圖為線性部分）

此外，還考察了此傳感器在實際樣品中的應(yīng)用.將不同質(zhì)量濃度的CP（1.0，5.0和10.0μg·mL-1）加標到血樣中進行處理檢測，所得結(jié)果如表1所示，回收率在98.9%～103.7%之間，相對標準偏差（RSD）在1.8%～2.5%范圍內(nèi)，表明此PEC傳感器的重現(xiàn)性良好.

表1 實際血樣中CP的檢測（n=3）

2.8 傳感器專一性、穩(wěn)定性考察

為了對該傳感器的特異性進行了考察，研究了潛在干擾物質(zhì)對CP測定的干擾，結(jié)果如圖9（a）所示.由于抗原-抗體的特異性結(jié)合，該傳感器只對CP有響應(yīng)，轉(zhuǎn)鐵蛋白（TRF）、人血清蛋白（HSA）的存在不會對CP檢測造成干擾，該PEC傳感器顯示良好的選擇性.另外，對傳感器的穩(wěn)定性也進行了考察，通過連續(xù)開/關(guān)燈約900 s，得到的光電檢測結(jié)果如圖9（b）所示，經(jīng)過長時間檢測，電流仍然保持平穩(wěn)狀態(tài)，幾乎沒有下降的趨勢，電極展現(xiàn)了較好的穩(wěn)定性.

圖9 傳感器專一性和穩(wěn)定性的考察.（a）多種蛋白質(zhì)的光電信號對比；（b）傳感器在0.01 mol·L-1 Tris-HCl電解液中連續(xù)開/關(guān)燈約900 s的光電性能（CP質(zhì)量濃度為0.1μg·mL-1）

3 結(jié)論

本工作通過一步合法制備了光學性能良好的金屬-半導(dǎo)體納米復(fù)合材料.摻雜的Au NPs可以顯著增強SnO2的光電性能，原因如下：1）摻雜的Au NPs由于表面等離子共振（SPR）效應(yīng)拓寬了雜化材料對可見光的吸收范圍；2）Au NPs良好的載流子傳輸性能，可以提高電極的電導(dǎo)率；3）當Au NPs摻雜到SnO2時，異質(zhì)結(jié)構(gòu)界面會形成肖特基勢壘，其存在有利于電子和空穴的分離，并阻礙光生電子-空穴對的復(fù)合.其次，異質(zhì)結(jié)中存在的內(nèi)部電場可以誘導(dǎo)載流子更快的遷移，從而增強PEC性能.之后，在該納米復(fù)合材料表面修飾CP抗體，利用“三明治”夾心模型成功實現(xiàn)對CP的特異性光電測定.線性范圍為0.01～20.00μg·mL-1，檢測限低至3.2 ng·mL-1，且傳感器專一性強、穩(wěn)定性好.此外，傳感器也成功用于檢測實際血樣中的CP，獲得了預(yù)期的回收率，可實現(xiàn)對實際樣品中CP的快速檢測.